探究马铃薯基因StEXLB1a的表达模式和功能,为后续马铃薯病害的抗性研究提供理论依据。在东北农业大学植物资源与分子生物学实验室前期研究基础上,以马铃薯大西洋品种为材料,克隆了StEXLB1a基因并对其进行了生物信息学、表达模式和抗病功能初步分析。结果表明:StEXLB1a基因cDNA全长序列768 bp,编码255个氨基酸,注释显示其属于扩展蛋白家族基因。亚细胞定位显示,该蛋白定位于细胞壁上。在马铃薯不同组织中,StEXLB1a基因在叶中表达量最高,根和地上茎其次,在花和块茎中最低。在激素(吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸)、逆境(高温、低温、盐、干旱)和真菌病害干腐病(燕麦镰孢菌)、细菌病害软腐病(胡萝卜软腐欧文氏菌)及青枯病(茄科雷尔氏菌)等多种胁迫处理下,StEXLB1a基因的表达量在各个处理中均有显著变化。获得过表达转基因马铃薯植株后,接种干腐病致病菌燕麦镰孢菌,转基因比野生型植株叶片受到病菌的侵染严重。过表达植株中的活性氧清除系统相关酶活性发生显著变化,POD、SOD活性受到抑制,MDA含量高于野生型植株,植株受损程度加重。分析结果表明,过表达StEXLB1a的转基因马铃薯植株相较野生型对干腐病的抗病性下降。

过氧化氢酶(CAT)在植物抵抗外界生物胁迫中发挥着重要作用。为了探究StCAT1与StCAT3基因在马铃薯抗早疫病菌侵染过程中的作用,通过RT-PCR方法克隆得到了StCAT1与StCAT3的cDNA,测序结果表明,这2个基因的全长均为1 479 bp,均编码493个氨基酸。通过构建系统发育树发现,StCAT1与番茄的SlCAT1有高度同源性,StCAT3与番茄SlCAT3还有彭氏番茄的SpCAT3有高度同源性。茄链格孢侵染马铃薯6 d后,StCAT1显著上调约3.9倍,StCAT3显著上调约8.7倍。进一步构建了StCAT1与StCAT3共沉默载体,利用VIGS技术对StCAT1与StCAT3进行瞬时共沉默,利用qRT-PCR筛选获得了StCAT1与StCAT3有效共沉默马铃薯株系VIGS-3。对马铃薯沉默株系接种早疫病菌,沉默株系的叶片病斑面积显著大于对照组,其与对照组相比增大42%,表明StCAT1与StCAT3共沉默后可降低马铃薯植株的早疫病抗性。同时,利用DAB染色法测定了共沉默株系叶片的H₂O₂水平,发现沉默株系的H₂O₂含量显著高于对照组,共沉默株系叶片的DAB染色强度是对照组的3.8倍。上述结果表明,StCAT1与StCAT3可通过调节H₂O₂水平介导马铃薯对早疫病的抗性,为揭示StCAT1与StCAT3在马铃薯抗早疫病中的分子调控机制奠定理论基础。

为探究马铃薯miR7997家族响应晚疫病原菌侵染的分子机制,以马铃薯Desiree为试验材料,对马铃薯miR7997家族序列特征、靶基因预测、表达模式和Stu-miR7997与靶基因在晚疫病胁迫下的表达特性进行分析。结果表明:马铃薯miR7997家族由3个成员Stu-miR7997a/b/c组成,分布于2条染色体上,成熟体序列高度保守,其中Stu-miR7997a/b成熟体序列完全相同;Stu-miR7997s前体序列均可形成典型的茎环二级结构,最小折叠自由能为-37.00~-49.50 kcal/mol,成熟体均位于前体5'端臂上,Stu-miR7997c在序列长度和功能元件分布上与Stu-miR7997a/b明显不同;启动子分析显示,Stu-miR7997s含光响应、激素响应、转录因子响应及胁迫防御相关元件。靶基因预测结果显示,Stu-miR7997家族共鉴定出19条靶基因,绝大多数靶基因受Stu-miR7997家族共同调控;组织特异性表达测定结果显示,Stu-miR7997s在马铃薯的各组织部位中均有不同程度的表达,Stu-miR7997a/b在茎中表达量最高,Stu-miR7997c在根部表达量最高。晚疫病致病疫霉侵染后,Stu-miR7997家族均显著下调表达,其靶基因转录因子MYB92、NAD(P)H-醌氧化还原酶及果胶裂解酶基因的表达显著上调,Stu-miR7997家族可能通过负调控靶基因表达,间接影响马铃薯的抗病反应,为进一步研究马铃薯miR7997基因家族在马铃薯抗晚疫病中的作用机制提供理论基础。

TCP家族成员是植物特有的转录因子,在植物生长、代谢活动及逆境应答等关键生物过程中发挥不可或缺的作用。为了解TCP基因家族在花魔芋基因组中的数量、分布和表达等情况,利用生物信息学技术对AkTCP家族基因进行鉴定,分析该家族成员的理化性质、亚细胞定位、共线性、基因结构及进化关系,采用qRT-PCR技术分析响应生物、非生物胁迫的基因表达情况。结果表明,花魔芋全基因组中鉴定出30个TCP家族成员,其蛋白包含135~562个氨基酸残基,分子质量为15.08~57.20 ku,等电点为4.96~11.49,大部分为碱性蛋白,均为不稳定的亲水性蛋白,主要分布在细胞核上,其基因在染色体上不均匀分布。AkTCP共线性基因仅在花魔芋8条染色体中分布,包含4个染色体间共线性事件和5个染色体内共线性事件。AkTCP基因结构较为简单,大部分不含内含子,均含有高度保守的TCP结构域,可分为Class Ⅰ和Class Ⅱ 2个组别,Class Ⅱ又分为CIN和CYC/TB1 2个亚类。启动子顺式作用元件分析结果显示,AkTCP启动子上含有多个生理响应、光响应、植物激素和逆境胁迫响应等元件。qRT-PCR分析结果表明,AkTCP家族成员参与了干旱胁迫、盐胁迫、茉莉酸甲酯和软腐病原菌侵染应答过程并作出积极响应。

为了解魔芋感染白绢病后内源激素与相关基因表达量的变化,进而揭示魔芋参与对白绢病响应的主要激素通路,采用液相色谱串联质谱对3月龄珠芽魔芋感染白绢病0,1,3,6 d 的内源激素含量进行测定,并利用实时荧光定量PCR技术对脱落酸、茉莉酸和水杨酸通路基因表达水平进行分析。结果表明: 感染白绢病后会导致魔芋多种内源激素含量发生变化,随着感染白绢病时间的延长,其中生长素类代谢物吲哚-3-乙酸含量呈先升高后下降的趋势,而吲哚-3-丁酸含量呈下降的趋势;反式玉米素含量则显著下降;脱落酸的含量呈先升高后下降的趋势;茉莉酸类代谢物含量和水杨酸类代谢物的含量均显著高于对照组。魔芋感染白绢病1,3,6 d茉莉酸含量分别为对照组的2.31,2.31,5.08倍,水杨酸含量分别为对照组的5.53,4.60,7.38倍。脱落酸、茉莉酸和水杨酸代谢通路相关的8个基因均被激活,表达量显著提高。感染白绢病后打破了魔芋内源激素稳态,激活了魔芋茉莉酸、水杨酸及脱落酸激素通路相关基因的表达,茉莉酸和水杨酸通路在魔芋对白绢病抗性胁迫中可能具有重要的作用。

PHR1是平衡植物抗病性与低磷胁迫抗性的关键因子。为研究马铃薯StPHR1基因的性质和功能,探明StPHR1在马铃薯抵抗早疫病菌侵染过程中的作用。以马铃薯为材料,采用PCR技术克隆得到了马铃薯StPHR1基因CDS序列,利用生物信息学软件分析预测StPHR1的结构、理化性质和亲缘关系,随后利用qRT-PCR技术分析StPHR1在早疫病菌侵染马铃薯时和不同激素处理下的表达量,并通过激光共聚焦扫描显微技术进行了蛋白质亚细胞定位分析。结果表明:StPHR1基因CDS全长为1 353 bp,编码450个氨基酸。蛋白分子式为C₂₁₄₇H₃₃₉₉N₅₉₅O₇₁₁S₁₈,分子质量为49.51 ku,理论等电点为5.07,编码亲水性不稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构,二级结构主要由无规则卷曲和α螺旋组成。系统进化树分析发现,StPHR1蛋白与拟南芥的亲缘关系最近;保守结构域分析发现,StPHR1蛋白和其他PHR1一样,在其蛋白C末端同时具有MYB-CC和MYB保守结构域。相对表达量分析发现,StPHR1被茄链格孢和水杨酸显著诱导表达,推测StPHR1可能在茄链格孢侵染马铃薯和水杨酸响应方面起重要作用;亚细胞定位显示,StPHR1蛋白定位于细胞核中。推测StPHR1可能通过其MYB转录因子活性和响应水杨酸参与调控马铃薯对茄链格孢菌的抗性。

查尔酮合酶(CHS)是调控植物类黄酮通路早期生物合成的重要结构基因,在植物生长发育和逆境响应中发挥作用。前期通过表达量分析,在马铃薯CHS家族中筛选到花青素生物合成关键基因StCHS4和StCHS5。为进一步探究马铃薯StCHS4和StCHS5在类黄酮和花青素生物合成中的功能,首先利用在线网站分析StCHS4和StCHS5蛋白结构,之后以pRI101双元表达载体为基础,通过同源重组法构建35S∷StCHS4-GFP和35S∷StCHS5-GFP植物过表达载体,并将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株中。利用本氏烟草进行瞬时转化,明确StCHS4和StCHS5蛋白亚细胞定位情况。以红花烟草为试验材料,分别进行瞬时超表达和稳定遗传转化,分析StCHS4和StCHS5基因过表达后总类黄酮和总花青素的含量变化。结果表明:StCHS4和StCHS5蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,StCHS4为不稳定的亲水蛋白,StCHS5为稳定的亲水蛋白。StCHS4和StCHS5分别与辣椒CHS和番茄CHS1亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示,StCHS4和StCHS5蛋白均在细胞质和细胞膜中表达。烟草瞬时超表达中,StCHS4和StCHS5基因在注射3~5 d显著促进花青素累积。分别获得3个阳性烟草转基因株系,与野生型相比,转基因植株中StCHS4和StCHS5显著高表达,总类黄酮和总花青素含量均高于野生型。StCHS4-OE3和StCHS5-OE1转基因植株中的总类黄酮含量显著提升,StCHS5-OE1和StCHS5-OE2中花青素含量分别提高89%,131%。上述结果表明,StCHS4和StCHS5是马铃薯类黄酮通路中关键CHS基因,过表达可促进花青素与类黄酮生物合成。

为了研究缺钾胁迫下活性氧(ROS)对甘薯生长和抗氧化系统的影响,进一步揭示活性氧调控甘薯缺钾胁迫下的抵御机制。选用低钾耐受型品种徐薯32和低钾敏感型品种宁紫薯1号2种甘薯品种为试验材料,通过人工气候室内水培的方式确保试验过程中环境因素保持一致,采用外源H₂O₂和二苯基氯化碘ROS抑制剂(DPI)预处理甘薯幼苗之后再进行缺钾处理,检测缺钾处理后不同时间点下甘薯根系内源H₂O₂相对含量、抗氧化基因表达水平及酶活力指标的变化,记录甘薯的形态特征,探索ROS信号对缺钾胁迫下甘薯苗期生长的影响。研究结果表明,缺钾处理下,甘薯生物量降低,叶色变淡;甘薯幼苗根系ROS相对浓度在第14天荧光强度表现最高;甘薯根系中抗氧化相关基因的表达量普遍升高,H₂O₂预处理表达量升高更显著;与-K处理相比,H₂O₂和DPI预处理均可提高甘薯叶片中的抗氧化酶活性,不同种酶活性在缺钾处理21 d内的变化趋势有所差异;不同处理的影响效应存在品种差异。H₂O₂可作为胁迫信号分子,提高甘薯幼苗抗氧化基因表达水平,提高抗坏血酸酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的酶活,从而清除多余ROS,有效缓解缺钾胁迫对甘薯幼苗生长的抑制,而DPI可以抑制内源H₂O₂的产生,维持抗氧化酶活,保护甘薯幼苗ROS酶促清除系统,避免组织的氧化损伤。

为了探究马铃薯捕光色素结合蛋白基因的功能,对捕光色素结合蛋白基因StCP24(LOC102586836)进行生物信息学分析,并用农杆菌介导法将其转入马铃薯品种东农310中,获得转基因马铃薯株系。在不同光照强度条件下培育无性系转基因株系和对照,测定植株的生长指标、叶片生理指标、荧光参数和基因相对表达量等,通过超微结构观察明确该基因对叶绿体形态的影响。生物信息学分析结果表明,StCP24蛋白为亲水性蛋白,StCP24基因的启动子中包含光响应、防御和应激反应等元件;系统发育分析表明,马铃薯StCP24基因编码的氨基酸与栽培种番茄中StCP24基因编码的氨基酸亲缘关系最近。在不同光照强度处理下,转基因株系的茎粗、叶面积、叶片质量、根长、叶绿素a含量、叶绿素b含量、Fv/Fm、ETR、ETRmax、qP显著高于野生型对照。StCP24基因的过量表达可以使类囊体质粒片层堆叠得更加紧密且堆叠程度更高。综上,StCP24基因过量表达可以增加叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量,提高光合作用光反应中电子传递速率,促进转基因马铃薯植株生长。

探究马铃薯基因的表达模式,为后续研究基因对马铃薯病害的抗性影响提供理论依据。以马铃薯为试验材料,克隆获得3个马铃薯内源小G蛋白基因StRac5、StRac7、StRac13,并对其进行生物信息学分析和表达模式分析。结果表明,StRac5、StRac7、StRac13与拟南芥和水稻中的小G蛋白含有相似的保守序列,均属于ROP蛋白。StRac5和StRac13的蛋白结构域与拟南芥AtRop1、AtRop3、AtRop5、AtRop6及水稻OsRac5、OsRac6、OsRac7相同,StRac7与拟南芥AtRop9的蛋白结构域相同。系统进化树分析表明,StRac7属于第Ⅱ类,与拟南芥AtRop9遗传距离最近;StRac13属于第Ⅲ类,与拟南芥AtRop7遗传距离最近;StRac5属于第Ⅳ类,与水稻OsRac5和OsRac6遗传距离最近。在马铃薯不同组织中,StRac5、StRac7、StRac13基因的相对表达量均为叶>根>茎;与其在茎中表达量比较,StRac5、StRac7和StRac13在叶中的表达量分别增加了1 222.4%,2 531.3%,468.2%;接种晚疫菌后,StRac5、StRac7和StRac13基因的相对表达量均出现先升高后降低的趋势,StRac5和StRac13基因的相对表达量在接菌24 h后较0 h分别上调了62.2%,40.4%,StRac7基因的相对表达量在接菌72 h后较0 h上调了827.8%;经过ABA、SA、GA和6-BA处理后,StRac5、StRac7、StRac13基因的相对表达量呈现下调的趋势;JA和IAA处理后,StRac5、StRac7、StRac13基因的相对表达量呈现上调的趋势。因此,StRac5、StRac7和StRac13基因能够响应马铃薯晚疫病的侵染,在不同组织和不同激素处理下表达模式也存在一定差异。

为探究如何缓解马铃薯生产中由于光照不足带来的影响,以马铃薯品种东农310为试验材料,设置 3 个遮光处理:正常光照(Z₀ ,遮光率为 0)、单层遮光网遮盖处理(Z₁)、双层遮光网遮盖处理(Z₂ )。在马铃薯块茎形成期喷施不同浓度表油菜素内酯(0 mg/L,记作CK;0.02 mg/L,记作E₁;0.10 mg/L,记作E₂)。设置3个测定期,对株高、叶绿素a含量、叶绿素b含量、光合参数、荧光动力学参数、单株产量等指标进行测定分析;并测定植株叶片 12 条LHcb基因相对表达量。结果表明,Z₁条件下较为适合东农310生长,而Z₀条件下产生光抑制,各指标较Z₁降低;Z₂条件下光照不足,各指标较Z₁降低。喷施EBR能够有效提高单株产量,在Z₀条件下E₂处理较CK显著提升32.62%,Z₁条件下E₁、E₂处理分别较CK显著提升48.38%,24.24%,Z₂条件下E₂处理较CK显著提升18.45%;在单株块茎干物质质量方面,Z₀条件下E₂处理较CK提升 27.24%,Z₁条件下E₁、E₂处理较CK提升40.09%,26.56%,且差异显著。遮光程度增加和喷施 EBR 可提高12条LHcb基因相对表达量,有利于叶片提高光能的捕获与利用。

旨在明确愈伤处理对贮藏期甘薯品质影响,为甘薯高质量贮藏提供理论基础。通过对2种鲜食型甘薯心香与烟薯25分别进行贮藏,在不同的贮藏期(0,7,15,30,60,90 d)分别取样,在贮藏期设置不同程度的模拟损伤,分别为对照、高温愈伤、浅层损伤后愈伤、深层损伤后愈伤。愈伤条件为相对湿度85%,室温35 ℃的培养箱中愈伤48 h,随后测定接种软腐病病原菌后的发病病斑直径,表皮防御酶活性(PPO、POD、PAL),薯块淀粉、蛋白质、可溶性糖等营养物质含量变化。结果表明,随着贮藏期延长,甘薯块根接种软腐病病菌后病斑直径增大。经过愈伤处理的甘薯较普通环境贮藏的甘薯具有更强的软腐病抗性。贮藏至90 d,2个品种薯块受到浅层损伤愈伤后处理的病斑扩散直径仅为对照处理的74.6%,71.1%。贮藏前期0~30 d各处理防御酶活性均保持较高水平。贮藏后期90 d 2个品种损伤处理愈伤后防御酶活性均显著高于对照处理,贮藏期60 d 2个品种块根受到损伤愈伤后蔗糖含量显著高于对照处理。贮藏期甘薯在受到不同程度的损伤后经过愈伤处理可以显著提升甘薯表皮的防御酶活性,降低感染软腐病后病菌扩散速度,提高甘薯的软腐病抗性。损伤程度对甘薯愈伤效果存在影响,受到浅层损伤愈伤后在防御酶活性及贮藏品质方面均优于受到深层损伤后愈伤的甘薯。

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因,该基因编码区全长为3 165 bp,编码蛋白的长度为1 055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现,StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少,主要在不溶的沉淀中表达,最佳的诱导条件为37 ℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白,故对其进行包涵体变性处理,并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白,同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验,发现在119.62 ku处检测到目标条带,说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后,通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中,成功免疫出2个StSPS1的抗体,经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上,对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化,并成功制备了StSPS1蛋白的兔多克隆抗体。

花色苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质,在花色苷合成途径中,花色苷合成酶催化无色花色苷转化成有色的花色苷,在植物器官着色过程中起重要作用。为了解彩色马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因ANS的功能,以红皮红肉的彩色马铃薯品种红美为试验材料,利用RT-PCR技术克隆花色苷合成酶基因,通过生物信息学分析其特性,并将其过表达到拟南芥中进行功能验证。结果显示,该基因cDNA序列长为1 406 bp,包含1 368 bp完整的开放阅读框,编码 455个氨基酸残基。通过生物信息学分析克隆到的基因,并将该基因命名为StANS1a,GenBank登录号为ON512347,其氨基酸序列具有保守的结构域DIOX_N和2OG_FeⅡ_Oxy,分别位于氨基酸序列的52~166位和 215~312位。在拟南芥中过表达StANS1a,通过半定量RT-PCR检测其转录水平,转基因株系中都有StANS1a基因的表达,且表达量较非转基因拟南芥高;通过检测转基因植株中花色苷的含量,发现转基因植株花色苷含量比非转基因植株高2.17%~54.61%,表明StANS1a参与了花色苷的生物合成。同时也证明彩色马铃薯StANS1a基因在花色苷代谢途径中起着重要的作用。

为探究不同灌溉和垄作种植方式对旱地马铃薯水分利用效果和产量的影响,明确适宜旱地马铃薯产量和水分利用效率同步提高的耕作和灌溉处理组合模式,进一步为旱作马铃薯生产效能提供理论依据,于2019—2020年连续2个马铃薯生长季,在山西省岚县地区,以并薯26号为材料,设置水力驱动带状喷灌(G₁)和滴灌(G₂)2种灌溉处理和常规垄型种植(M₁)、凹型垄面种植(M₂)和露地平作种植(M₃)3种种植方式的二因素试验,深入研究灌溉方式与垄作种植相互效应对旱地马铃薯水分利用和产量的影响。结果表明,灌溉方式与垄作种植对旱地马铃薯田耗水特性、水分利用效率及产量均具有明显的调控作用;M₂处理较M₁和M₃处理显著增加土壤水分利用效率,提高自然降水和灌溉水的利用率;在G₁处理下,M₁和M₂处理水分利用效率、产量分别比M₃处理增加了14.08%,13.58%和23.28%,21.92%;在G₂处理下,M₁和M₂处理水分利用效率、产量分别比M₃处理增加了11.88%,11.50%和22.05%,20.45%,且以凹型垄作+水力驱动带状喷灌处理组合G₁M₂产量最高;相同垄作处理下,G₁处理的水分利用效率和产量最高。综合考虑,灌溉方式和垄作种植对旱地马铃薯水分利用效率和产量的调控效应,凹型垄面种植+水力驱动带状喷灌处理组合(G₁M₂)可作为适宜山西旱地马铃薯产量和水分利用效率同步提高的灌溉与耕作处理组合模式。

了解与刺槐不同根系分隔方式下的花魔芋生物学过程及代谢通路,为间作花魔芋根系中相关基因的表达调控及响应机制提供分子基础。采用高通量测序平台Illumina NovaSeq 6000,对不同盆栽根系分隔(塑料膜分隔FS、尼龙网分隔MS和不分隔NS)方式下的花魔芋根系进行转录组测序分析。测序共获得59.82 Gb数据,组装后得到92 358条Transcript和40 122条Unigene序列,其中Nr数据库注释的信息最多(23 960条Unigene),占总Unigene的59.72%。将各样本获得的转录组数据进行两两比较,FS_vs_MS、FS_vs_NS和MS_vs_NS的差异表达基因数分别为1 776,733,896个,其中上调表达基因数量占差异表达基因比例分别为33.1%,22.8%和50.8%。GO功能富集分析显示,差异表达基因主要涉及细胞质膜、细胞膜、细胞外围、细胞壁、外部囊状结构、细胞膜内在成分及质膜内在成分等。KEGG富集分析表明,尼龙网分隔和未分隔间作花魔芋根系相对于塑料膜分隔单作花魔芋较显著的差异代谢通路在于核糖体、氧化磷酸化和植物激素信号转导。本研究通过花魔芋根系转录组分析,为研究间作花魔芋根系基因的表达调控机制提供 基础数据资料。

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明:所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异,在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中,RPP13基因表达量的降低幅度为35%~60%。

为探究不同干旱胁迫时间处理下,二倍体马铃薯材料对干旱胁迫响应的分子机制,挖掘抗旱相关基因。以高抗旱二倍体资源A90为试验材料,利用转录组测序技术对PEG-6000胁迫下不同时间的差异表达基因进行分析,通过GO富集、KEGG通路分析与转录因子预测参与马铃薯干旱胁迫响应的差异表达基因,初步挖掘抗旱调控关键基因;并通过RT-qPCR对3个抗旱候选基因进行逆境胁迫表达分析。结果表明:A90在20%PEG-6000胁迫处理3,6,24 h与对照相比,共有2 519个差异表达基因,这些基因主要富集在植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等抗旱相关过程中。并且显著富集在通路上的340个共差异表达基因中有53个基因注释到了RLKs、AP2/ERF和Tify等15个转录因子家族中,其中StST/K1、StERF1和StTify1的表达量较高,有可能是抗旱调控关键基因。基因StST/K1和StERF1受到干旱和低温胁迫主要在材料的根和叶中上调表达,基因StERF1在盐胁迫下在材料的根、茎和叶中均上调表达;基因StTify1在受到干旱在材料的茎和叶中上调表达,受到盐胁迫在材料的根、茎和叶中均上调表达,但在低温胁迫下只在材料的茎中下调表达。由此说明,筛选出的3个基因均能够对干旱、盐和低温胁迫产生响应,可为今后马铃薯抗旱分子育种中相关抗旱候选基因研究提供一定的理论基础。

为了探究SBP1基因在植物自交不亲和方面的重要作用,以二倍体马铃薯野生种为材料,利用RT-PCR技术克隆获得马铃薯野生种 SpSBP1(登录号:MZ803088)的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析及 CRISPR/Cas9载体构建。结果显示,SpSBP1基因的cDNA全长为1 176 bp,包含92 bp的5'非编码区和163 bp的3'非编码区,其最大开放阅读框为921 bp,编码306个氨基酸。蛋白结构域分析显示,SpSBP1蛋白包括Smc超家族结构域以及RING finger和Zinc finger结构域。蛋白同源序列比对及系统进化树分析显示,马铃薯野生种SpSBP1与马铃薯野生种ScSBP1的同源性最高,其次为花烟草。生物信息学分析显示,SpSBP1分子质量为34.731 44 ku,理论等电点pI为5.10,推测得出该蛋白为酸性不稳定亲水性蛋白。二级结构预测该蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲所构成。同时该蛋白属于非分泌蛋白且不存在跨膜结构。从二倍体马铃薯野生种中克隆出了SpBP1基因,同时成功构建了CRISPR/Cas9载体,并进行了遗传转化试验。

为了明确6个彩色马铃薯新品系NNCS-1、NNCS-5、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-33和NNCS-37在细胞遗传学和DNA分子水平上的遗传差异,以马铃薯材料MIN-021为对照,采用染色体制片法和SSR标记技术,对其花粉育性、花粉母细胞减数分裂中期 Ⅰ 染色体构型和SSR进行了分析。结果表明,6个彩色马铃薯新品系的花粉育性依次分别为44.00%,66.78%,74.44%,60.70%,78.10%,80.22%,其染色体配对构型依次为8.45Ⅰ+6.09Ⅱ+7.35Ⅲ+1.33Ⅳ、6.91Ⅰ+7.13Ⅱ+5.73Ⅲ+2.41Ⅳ、5.19Ⅰ+9.16Ⅱ+4.51Ⅲ+2.74Ⅳ、6.55Ⅰ+8.35Ⅱ+4.97Ⅲ+2.46Ⅳ、4.02Ⅰ+10.15Ⅱ+3.40Ⅲ+3.37Ⅳ和3.31Ⅰ+10.42Ⅱ+2.99Ⅲ+3.72Ⅳ,表明在细胞学水平上各品系间有一定的差异。利用筛选出的10对SSR适宜引物,对各新品系及对照材料的基因组DNA进行扩增获得SSR多态性位点151个,多态性位点比率占86.78%,各材料间遗传差异较大。用筛选出的特异性引物C42建立了1张能识别出6个彩色马铃薯新品系及对照的SSR指纹图。以平均遗传距离(GD值)0.62为基准,将7个材料分为3类:新品系NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5和对照(MIN-021)为一类;新品系NNCS-33和NNCS-1各单独为一类。

为了探究不同田间持水量对马铃薯根系生长的影响,提高西北地区马铃薯产量。于2018在大田遮雨棚内进行,以马铃薯品种海斯薯为试验材料,采用膜下滴灌的灌溉方式。根据不同田间持水量梯度设置6个处理(分别为T1:85%~95%、T2:75%~85%、T3:65%~75%、T4:55%~65%、T5:45%~55%和T6:不灌水处理),研究不同田间持水量对马铃薯根系特性、产量及其相关性的影响。结果表明,随着田间持水量的下降根系分布逐渐加深,在田间持水量大于45%,根系主要分布在垄面0~10 cm处;当田间持水量小于45%时,根系主要分布在垄侧20~40 cm处。持水量高于65%处理下的块茎产量和大薯率高于其他处理,补偿效应显著(P<0.05);其中,持水量75%~85%处理下产量最高,平均产量为884.06 g/株,较T6处理增产257.61%。相关性分析发现,田间持水量与垄面根长、根表面积、大薯率和块茎产量呈显著(P<0.05)正相关,垄面根系长度和表面积与马铃薯块茎产量显著正相关(P<0.05)。综上所述,田间持水量大于65%时,能显著提高垄面的根长、根表面积和产量,其中,持水量75%~85%处理下产量最高。

为探讨硅酸钠增强马铃薯黑痣病抗性的分子机制,将硅酸钠诱导马铃薯转录组中表达量较高的基因StWRKY11进行克隆和生物信息学分析。从马铃薯中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增该基因并克隆,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及分析。结果表明,从马铃薯大西洋中克隆了阅读框为1 005 bp的StWRKY11基因,编码334个氨基酸,表达蛋白分子式为C₃₀₁₃H₅₀₂₃N₁₀₀₅O₁₂₆₀S₁₉₉,分子质量为81.867 94 ku,理论等电点(pI)为5.09,原子总数为10 500。表达蛋白含有一个典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为CX₅CX₂₃HXH,属于第二类Ⅱd亚家族;表达的为疏水稳定性蛋白,无跨膜区和信号肽结构域,二级结构元件是α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规卷曲,其中无规则卷曲比例最高,达61.68%,共有29个磷酸化位点,可能定位于细胞核内。启动子上游具有与抗性胁迫响应相关的顺式调控元件及与生长发育和激素响应顺式作用调控元件。该基因与马铃薯StWRKY5基因的亲缘关系较近,编码蛋白的氨基酸同源性达到95%。

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒-甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列,利用Premier 5.0 软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物;以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板,在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增,初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系;通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化,建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系,并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示,优化的多重RT-PCR体系,各病毒引物之间不会出现交叉干扰,所扩增的4条目的条带清晰,能够明确区分上述4种甘薯病毒;挑战检测和灵敏度测试显示,此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒,不仅准确灵敏,而且降低了检测成本,提高了病毒检测效率。

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。

为了探索马铃薯小G蛋白StRab5b与花青素合成之间的关系,利用农杆菌介导的遗传转化,将StRab5b基因在马铃薯中超表达后,研究StRab5b基因对马铃薯花青素含量和PAL 活性的影响。结果表明,超表达StRab5b基因显著增加了马铃薯叶片、茎段和薯块中的花青素含量。与对照相比,转基因马铃薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5叶片花青素含量分别增加了42%,24%,54%,茎段中花青素含量分别增加了59%,37%,32%,薯块中花青素含量分别增加了118%,82%,105%;同时,StRab5b基因对植物花青素合成关键酶PAL活性也有促进作用,与对照相比,转基因马铃薯植株StRab5b-L2、StRab5b-L3和StRab5b-L5叶片PAL活性分别增加了88%,63%,66%,茎段中PAL活性分别增加了48%,38%,31%,薯块中PAL活性分别增加了98%,78%,64%。综上所述,小G蛋白StRab5b通过调控PAL活性,增加了马铃薯中花青素的含量。

为深入研究炭疽病抗病机制提供候选基因,从分子水平探索炭疽菌侵染对山药炭疽病基因转录水平的影响。苏蓣8号是高感炭疽病品系024经组培诱变所育成的高抗炭疽病山药新品种,为挖掘苏蓣8号炭疽病抗性基因,采用胶孢炭疽菌菌株4-2分别接种苏蓣8号和品系024,以未接种苏蓣8号的叶片为对照,利用转录组测序技术分析抗感材料在接种炭疽菌后不同时间点的差异表达基因。结果表明,抗感材料接种24,48,72,96 h共同差异表达基因个数分别为197,132,187,313个,去除各接种时间点共同差异表达的基因数,共获得711个差异表达基因。GO功能富集显示,差异基因主要与响应生物刺激、防卫反应、细胞壁代谢和氧化还原过程等有关。KEGG富集分析表明,生长素、茉莉酸和乙烯等防御相关的植物激素信号转导途径多个基因表达出现差异,其中5个生长素早期响应基因、茉莉酸和脱落酸合成关键酶基因均上调表达,乙烯响应因子ERF036下调表达,可能负向调控山药炭疽菌的侵染;参与次生代谢产物修饰的多个细胞色素P450基因、泛素连接酶及植物甾醇合成酶、防御素和凝集素基因上调表达;WRKY类、MYB类和TIFY类转录因子正向或负向调控抗病基因的表达,受转录调控的PR蛋白、NBS-LRR抗病基因、受体激酶等大量表达,抗氧化保护酶系统CAT和SOD成员在活性氧信号刺激下表达。此外,与淀粉和蔗糖合成有关酶上调表达,与淀粉分解有关酶下调表达。LAX4、IAA4、IAA21基因表达趋势与转录组测序结果基本一致,且在抗病品种表达量显著高于感病品种,推测生长素信号途径有利于山药对炭疽病的免疫反应。

为了克隆山药异戊烯基转移酶基因,预测该基因编码蛋白的结构和特性,并检测该基因在山药珠芽发芽期的表达特征,采用同源克隆的方法克隆山药IPT 基因,使用生物信息学的方法预测蛋白质的序列和结构,通过实时荧光定量PCR检测基因的表达量。结果表明,在山药中克隆到了长为1 398,1 044,1 349 bp的3条核酸序列,依次命名为DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b,基因登录号依次是:MW353160、MW353016、MW353017,各基因的阅读框长度依次为1 137,861,1 011 bp,编码氨基酸长度分别为378,286,336 aa。分析氨基酸生物信息得知,DoIPTs属于不稳定外在膜亲水性蛋白,DoIPT5b存在2个信号肽,其余无信号肽;3个蛋白的二级结构预测与三级结构模型图相符;DoIPTs的编码区与其他植物的异戊烯基转移酶蛋白高度同源。DoIPTs编码区域显示,DoIPTs N端含有P-loop NTPase结构域GXXGXGKS(T),具有催化形成细胞分裂素的能力。实时荧光定量PCR分析结果表明,在22 ℃无外界水条件下珠芽发芽时表皮中DoIPT5a的表达量最高,在潮湿环境下DoIPT1和DoIPT5b基因的表达量最高;多效唑处理能够使DoIPTs基因的表达上调。结果为进一步研究山药DoIPTs基因的功能奠定了基础。

为了探究不同浓度外源褪黑素对冷驯化后低温胁迫下马铃薯幼苗生长的影响,以云南主栽马铃薯品种合作88为材料,采用人工模拟低温胁迫(4 ℃ 14 d ,-2 ℃ 12 h)的方法,研究了不同外源褪黑素浓度(50,100,150 μmol/L)对低温胁迫下马铃薯幼苗生长及活性氧代谢系统的影响,以探讨外源MT缓解低温胁迫对马铃薯幼苗伤害的可行性。结果表明,与低温胁迫的马铃薯幼苗相比:50 μmol/L MT处理的幼苗的存活率提高了38.89百分点,株高和茎粗分别提高了2.92%,1.86%,SS、SP和Pro的含量分别增加了12.66%,13.80%,1.96%,POD和CAT的活性分别提高了29.24%,351.62%;100 μmol/L MT处理的幼苗的株高和茎粗分别提高了16.97%,2.82%,MDA和H₂O₂的含量分别降低了19.35%,0.48%,POD和CAT的活性分别提高了55.44%,213.56%,GSH的含量提高了13.61%;150 μmol/L MT处理的幼苗的存活率提高了27.78百分点,株高和茎粗分别提高了5.62%,13.20%,MDA的含量降低了9.45%,Pro的含量增加了38.70%,SOD、POD和CAT的活性分别提高了52.61%,25.25%,300.94%,AsA和GSH的含量分别提高了3.48%,3.97%。表明施加外源MT后可以不同程度的通过促进幼苗的生长、降低叶片的MDA和H₂O₂含量、促进SS、SP、Pro的积累、提高SOD、POD、CAT的活性、增加AsA和GSH的含量,从而缓解低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害,进而提高马铃薯幼苗的抗低温胁迫的能力。综上,50 μmol/L MT处理可较优得提高马铃薯幼苗在低温胁迫下的抗逆性。

旨在探究甘薯贮藏的调控手段，为调控甘薯贮藏提供理论依据。从肥料入手，以商薯19、心香2个品种为试验材料，通过控制一定量的氮肥和磷肥，并施用不同梯度的钾肥，统一收获后挑选大小一致且无破损的甘薯，放置于14℃，湿度为85%的冷库中贮藏，并在贮藏期0，15，30，60，90 d进行取样制样，分别测定其腐烂率及其细胞壁成分和酶活性，从而探究不同的施钾量对甘薯腐烂率及其细胞壁成分和降解酶活性的影响。结果表明，不同施钾量处理后的甘薯贮藏期间出现不同程度的腐烂，其中商薯19施钾量为150 kg/hm²（商薯19 K₂）和心香施钾量为225 kg/hm²（心香K₃）在90 d内耐贮性表现较好，腐烂率最低，分别为18.25%，23.00%，且商薯19 K₂具有较高的纤维素含量，其含量高达80.63 mg/g。心香K₃的原果胶含量显著高于其他处理，平均高1.14%，且其β-Gal酶活性较其他处理显著较低。对于甘薯施用中钾处理能减缓甘薯细胞壁成分的降解，提高其细胞壁完整性的保持能力，从而降低腐烂率。

为了揭示半干旱地区覆膜与补灌技术下马铃薯产量与根际土壤微生物学特性等相关指标的响应关系，在甘肃省定西市灌溉试验站开展马铃薯覆膜与补充灌溉大田试验，设全覆膜膜下滴灌（PFID）、半覆膜膜下滴灌（PHID）、全覆膜垄作沟灌（PFIF）、无膜垄作沟灌（PNIF）、全覆膜畦田灌水（PFIB）、全覆膜畦田不灌水（PFIBN）等6个处理，以平作无膜不灌水（PNIN）为对照，分析各处理对马铃薯产量、根际土壤有机质（TOM）、有机碳（TOC）、微生物量碳（MBC）、微生物量氮（MBN）、脲酶、过氧化氢酶等土壤学特性的影响。结果表明：在滴灌和沟灌补充灌溉方式下，根际土壤微生物学特性指标对覆膜程度响应关系不同，全覆膜处理的MBC和MBN显著高于半覆膜处理，而半覆膜或不覆膜处理的脲酶、过氧化氢酶活性却显著高于全覆膜处理；所有补灌处理（PFID、PHID、PFIF、PNIF、PFIB）的脲酶、过氧化氢酶活性均显著高于对照PNIN处理，补灌处理的马铃薯产量、单株结薯个数和单株薯质量也均显著高于PNIN处理，尤其是PHID处理产量达44 603.70 kg/hm²，较对照显著增产51.00%。相关分析表明，马铃薯产量与MBC、脲酶活性、过氧化氢酶呈极显著正相关（P <0.01），与TOM、TOC显著正相关（P <0.05）。

为明确不同马铃薯品种叶片内生细菌多样性及差异，为马铃薯抗逆性机理及内生菌开发研究提供依据。利用LB培养基对云南省4个主栽马铃薯品种叶片内生细菌进行分离培养，根据形态特征和16S rDNA序列对菌株进行分类鉴定。从青薯9号马铃薯叶片中分离获得内生细菌3门8科9属10种，其中葡萄球菌属和微小杆菌属为优势菌属，相对多度均为18.18%；从会-2马铃薯叶片中分离获得内生细菌4门11科11属12种，其中不动杆菌属和假单胞菌属为优势菌属，相对多度均为15.38%；从合作88马铃薯叶片中分离获得内生细菌4门9科10属13种，其中不动杆菌属为优势菌属，相对多度为23.53%；从丽薯6号马铃薯叶片中分离获得内生细菌4门7科8属17种，其中葡萄球菌属为优势菌属，相对多度为22.22%。4个马铃薯品种叶片中可培养细菌共有37种，其中青薯9号、会-2、合作88和丽薯6号马铃薯叶片中独有的内生细菌分别有4，8，4，10种。马铃薯不同品种叶片内生细菌种类组成及优势菌属不同，可为马铃薯叶片内生菌功能研究提供菌种资源。

为了研究紫甘薯叶片响应UV-B辐射增强的分子机理，以滇紫甘薯24（DZS24）的叶片为试验材料，通过高通量测序技术对自然光照与人工增补UV-B辐射（T=7.2 kJ/（m² · d））下DZS24的叶片进行转录组测序分析。结果表明，477个基因表达发生显著变化，其中382个上调表达，95个下调表达，GO功能分析显示，差异表达基因主要显著富集在生物过程的氧化还原过程和分子功能的氧化还原酶活性中，KEGG代谢通路分析共富集到9条显著差异通路，其中次生代谢产物生物合成通路所包含的差异表达基因数量最多。紫甘薯叶片响应UV-B辐射增强的差异表达基因主要为类黄酮合成通路中的CHS（Tai6.1732、Tai6.53503、Tai6.45381）和DFR（Tai6.3019）及芥子油苷生物合成中的CYP83B1（Tai6.44115、Tai6.18064、Tai6.41206）和油菜素内酯生物合成中的CYP85A1（Tai6.2806、Tai6.19253、Tai6.15801），转录因子主要为C2H2、NAM、bHLH和RR-A-type。综上所述，紫甘薯叶片响应UV-B辐射增强的关键基因可能为IbCHS、IbDFR、IbCYP83B1和IbCYP85A1 ，主要转录因子可能为C2H2、NAM、bHLH和RR-A-type。

增强UV-B辐射会对植物造成损伤，褪黑素可以增强植物抗逆性。通过不同浓度褪黑素处理不同UV-B辐射下的马铃薯幼苗，测定其株高、光合参数（Pn、Gs、Ci、Tr）、荧光参数（Fv/Fm、ETR、qP、NPQ）、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC），分析褪黑素对UV-B辐射下马铃薯光合、荧光特性的影响，为揭示褪黑素对UV-B辐射下马铃薯植株的防御机制提供科学依据。以马铃薯品种合作88为试验材料，采用自然光照（CK）和3个增强的UV-B辐射（2.5，5.0，7.5 KJ/（m²·d）），在4种光照条件下分别设置0，25，50，100，150，200 μmol/L的褪黑素浓度处理马铃薯幼苗。马铃薯受到增强UV-B辐射后株高、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、光合参数、荧光参数（除NPQ）都降低，施加褪黑素后有所升高。褪黑素能提高马铃薯对UV-B辐射的抗逆性，使其植株增高，光合能力增强，但过高的褪黑素浓度也会对植物造成一定的损伤。

为获得兼抗多种病毒（类病毒）的马铃薯植株，分别克隆了靶向PVX、PVY和PSTVd蛋白的P25、HC-Pro和Virp1基因，以拟南芥pre-miR159a为骨架设计了针对P25、HC-Pro和Virp1基因的amiRNA序列，通过Overlapping PCR将3个amiRNA片段连接，并导入植物双元表达载体pCAMBIA1300-221，构建植物表达载体p1300-221-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1，经PCR及酶切验证，表达载体构建正确。农杆菌介导法将含目的基因质粒菌液侵染马铃薯品种费乌瑞它脱毒微型薯片，经再生、压力筛选，抗性植株分化及植株壮苗共获得转化株系15株，PCR检测结果表明，其中10株检测到与目的基因大小一致的片段（729 bp）。qRT-PCR结果显示，外源amiR -P25-HCPro-Virp1基因在10个转化植株中均有表达，相对表达量在7.68~21.37。对T₀阳性转化植株的攻毒试验，将PVX、PVY和PSTVd病毒等量混合液摩擦接种至6~8叶期的植株叶片，20 d后观察发现，对照植株感病严重，出现植株矮小、叶片斑驳等症状，而转化植株未表现出感病症状，生长正常。RT-PCR进行病毒特异性检测，结果显示，转化植株中也未检测到病毒序列，这表明转amiR-P25-HCPro-Virp在转化植株中能稳定表达，转化植株能够兼抗PVX、PVY和PVSTd 3种病毒（类病毒）。得到了同时兼抗PVX、PVY和PVSTd转化植株，且抗性显著，为马铃薯抗病毒育种提供了新的遗传资源。

初探StTCP13基因在盐胁迫方面的功能，为StTCP13在马铃薯非生物逆境响应的功能研究奠定基础。采用同源克隆策略获得StTCP13基因编码区全长，利用生物信息学分析蛋白结构域并构建系统进化树，qRT-PCR技术分析该基因表达模式，双酶切法构建StTCP13-pGEX6P1原核表达载体，利用大肠杆菌BL21表达StTCP13-GST标签融合蛋白，观察转StTCP13大肠杆菌BL21在盐胁迫培养基上的表型。结果显示，从马铃薯品种费乌瑞它中克隆得到了StTCP13基因，成功构建了StTCP13-GST标签融合蛋白的pGEX-6P-1原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中诱导表达了目的蛋白。生物信息学分析结果表明，该基因CDS全长669 bp，编码一个由222个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质含有1个保守的TCP结构域，融合蛋白大小约为51 ku。系统进化树结果显示，马铃薯StTCP13与潘那利番茄SpTCP13、甜椒CaTCP13亲缘关系较近。表达分析结果显示，该基因在根中表达量最高，在芽眼中表达量最低，其表达受高盐胁迫诱导。盐胁迫表型分析结果表明，StTCP13能提高大肠杆菌对高盐胁迫的耐受性。综上，说明StTCP13在响应盐胁迫逆境中发挥一定功能。

为明确6个马铃薯新品系NNS-P 11、NNS-H 6、NNS-H 4、NNS-C 10、NNS-L 9和NNS-Y 40的分子细胞遗传学差异，对下一步新品种育成鉴定和登记利用提供依据。以马铃薯材料MIN-021作对照，利用常规压片法和SSR分子标记技术，对其花粉育性、PMCMⅠ染色体配对构型及SSR进行了比较分析。结果表明：6个马铃薯新品系间花粉育性有一定差异，新品系NNS-Y 40的花粉育性较低（39.95%），新品系NNS-P 11、NNS-H 4、NNS-C 10的花粉育性较高（81.12%，77.94%，77.76%），新品系NNS-H 6和NNS-L 9花粉育性居中（67.27%，69.71%）。6个新品系染色体配对构型依次为1.08 Ⅰ+14.89 Ⅱ+1.18 Ⅲ+3.40 Ⅳ、2.35 Ⅰ+11.96 Ⅱ+3.59 Ⅲ+2.74 Ⅳ、2.10 Ⅰ+14.21 Ⅱ+1.35 Ⅲ +3.02 Ⅳ、3.31 Ⅰ+13.98 Ⅱ+ 2.99 Ⅲ+1.94 Ⅳ、3.45 Ⅰ+12.94 Ⅱ+2.81 Ⅲ+2.56 Ⅳ和8.23 Ⅰ+6.92 Ⅱ+6.07 Ⅲ+1.93 Ⅳ。试验筛选出SSR适宜引物10对，对各新品系及对照材料基因组DNA扩增，获得82个SSR多态性条带，多态性比率占78.10%。各材料的遗传距离（GD）变幅为0.244 4～0.687 5，以GD值0.40为基准，划分为3类：第一类为新品系NNS-P 11、NNS-L 9、NNS-Y 40和对照MIN-021，第二类为新品系NNS-H 6和NNS-H 4，新品系NNS-C 10单独为一类。试验建立了能明确鉴别7个供试材料的SSR指纹图。

为了研究马铃薯WRKY57基因（PGSC transcript number PGSC0003DMT400072958）功能，通过RT-PCR克隆得到马铃薯耐旱品种PB06的StWRKY57基因cDNA序列，命名为StWRKY57-PB。利用生物信息学方法对其序列特征进行了分析；以pGEX-KG为基本骨架，构建了StWRKY57-PB蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了表达和纯化分析。结果表明，StWRKY57-PB基因开放阅读框（ORF）长981 bp，编码蛋白属于WRKY转录因子家族Ⅱ c类，含326个氨基酸残基，含有WRKY结构域（WRKYGQK）和一个类锌指结构基序（C-X₄-C-X₂₃-H-X₁-H）。序列比对及构建系统发育树结果表明，它与马铃薯基因组数据库及NCBI公布的WRKY57（XP_006348711.1）有4个氨基酸的差异，与番茄WRKY57分子距离较近，相似性为93%，与拟南芥WRKY57亲缘关系较远，相似性为57%。二级结构预测发现，StWRKY57-PB所编码蛋白由延伸链、α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成，四者比例分别为13.50%，16.56%，7.98%，61.96%。在0.5 mmol/L IPTG诱导下，该蛋白质在3种大肠杆菌表达菌株BL21、Rosetta和Tuner中稳定表达，利用GST亲和树脂分离纯化了GST-StWRKY57-PB融合蛋白，Western Blot验证了蛋白质的表达和纯化。对进一步确定该蛋白质的体外活性及生物学功能具有重要意义。

为揭示甘薯及其野生种之间的遗传多样性，分析甘薯及其野生种之间的遗传关系，利用SCoT分子标记对22份甘薯及其野生种三浅裂野牵牛和三裂叶薯的PCR扩增结果、遗传多样性、进化关系、群体结构进行分析。结果表明：43条SCoT引物共检测到278条稳定条带，每条引物可检测4~12个条带； SCoT-8、SCoT-20、SCoT-26、SCoT-36、SCoT-35 5条引物多态性丰富，可用于甘薯及其野生种研究的分子标记。基于分子标记的遗传多样性分析表明，三浅裂野牵牛的遗传多样性最高，甘薯次之，三裂叶薯最小。遗传聚类和群体遗传结构分析结果将参试22份种质材料分为三大类群，各材料归类基本和其所属物种一致，不同物种间的血缘交流少，遗传组成相对单一，比较而言，甘薯与三浅裂野牵牛之间的血缘交流比三裂叶薯之间的血缘交流多，其与三浅裂野牵牛之间的遗传关系较三裂叶薯更近。综上，研究结果初步证明SCoT分子标记在甘薯进化研究中具有潜在应用价值，同时揭示了甘薯与其近缘野生种之间的不同遗传关系，为今后甘薯育种中引入三浅裂野牵牛等野生种血缘，提高甘薯遗传多样性提供了理论支持。

为进一步明确甘薯镉元素的时空积累规律，探索甘薯薯肉低镉积累特性形成的原因，利用原子吸收光谱仪检测了在镉中度污染土壤和镉重度污染土壤生长条件下湘薯20号各组织器官镉分配与积累的时空差异，并用荧光定量PCR检测分析了与之对应的甘薯镉积累相关同源基因的表达差异。研究发现，镉污染土壤中甘薯的镉积累符合根>茎>叶的特性，当土壤镉浓度增加至0.6 mg/kg或2.0 mg/kg时，相对于阴性对照，各部位镉含量增加的倍数分别为3.05~8.75和6.25~26.89；各组织器官随生长时间延长植株镉积累量逐渐增加，地上部茎叶镉积累速率高于薯肉镉积累速率，且叶片中积累的镉不易发生二次转移，因而新叶中镉含量低于老叶。植物镉积累和转运相关的基因在甘薯基因组存在同源基因，且多数存在多个同源拷贝，虽然这些基因在一定程度上随着镉积累量的增加而被诱导表达，但是各拷贝之间的时空表达模式存在差异。相对于镉积累调控相关基因的表达，胁迫响应相关基因受镉胁迫诱导表达的趋势更为明显。镉污染土壤中甘薯的镉积累随着土壤镉浓度增加而增加，随着生长时间延长而增加。甘薯薯肉的镉积累规律较为特殊，薯肉镉积累量低于薯皮、茎、叶等部位，且随着生长时间的增加，薯肉镉积累速率也远低于地上部茎叶。植物镉积累和转运相关的基因在甘薯基因组存在同源基因，且多数存在多个同源拷贝，各拷贝之间的时空表达模式存在差异，推测这种表达差异与甘薯的镉积累特性有关。

为明确山东省高密地区马铃薯疮痂病的病原菌种类及其特征，2018-2019年从山东省高密市马铃薯主产区采集具有疮痂病病斑的马铃薯块茎，从病斑上共分离纯化到178个链霉菌菌株；采用薯片法、萝卜幼苗法及温室盆栽柯赫氏法则对马铃薯进行致病性试验，筛选到178个致病性较强的菌株。此外，将高密市5个地区所分离的马铃薯疮痂病菌株进行形态学鉴定、PCR分子鉴定和病原菌致病基因检测，之后根据16S rDNA基因的差异采用分子手段对所分离的致病菌株进行种类鉴定并构建系统发育树。结果显示：引起山东高密地区马铃薯疮痂病的病原菌主要包括4种链霉菌，分别为Streptomyces acidiscabies、Streptomyces scabies、Streptomyces luridiscabiei和Streptomyces griseoaurantiacus，与聚类分析结果相一致。其中Streptomyces acidiscabies为链霉菌优势种群且新菌株鉴定为Streptomyces griseoaurantiacus，为国内新报道病原菌，说明我国山东高密地区马铃薯疮痂病病原菌种类和分布较为复杂。

为实现准确和快速鉴定PVS及其株系，明确PVS在马铃薯叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎中含量以筛选适合的检测部位，设计PVS通用简并引物，建立实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术体系，分析熔解曲线鉴定PVS^O和PVS^A株系。以马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯卷叶病毒（PLRV）阳性样品为对照检测其特异性。应用PVS^O和PVS^A重组质粒分别建立标准曲线，检测接种PVS^O和PVS^A马铃薯品种尤金和冀张薯12号的5个部位PVS含量。另外，应用该体系检测来源于11个省（市、自治区）的90个PVS阳性样品验证其实用性。PVS^O和PVS^A扩增后熔解曲线分别在85.77~86.00℃和87.78~87.91℃出现特异峰，PVS阴性样品及PVX、PVY、PVM、PVA和PLRV阳性样品的熔解曲线均无上述特异峰。PVS^O和PVS^A的标准曲线重组质粒浓度分别在1.09×10⁵~1.09×10⁹拷贝/μL和1.26×10⁵~1.26×10⁹拷贝/μL时，荧光信号基线的循环数平均值（Cycle threshold，Ct值）与PVS病毒粒子拷贝数对数之间具有良好的线性关系（决定系数R²=0.994 2和0.991 2）。尤金和冀张薯12号5个部位PVS^O和PVS^A拷贝数均大于10⁷数量级，均可用于检测，以PVS^O在叶柄中含量最高。11个省（市、自治区）的90个PVS阳性样品均可检测到。本研究建立的PVS RT-qPCR检测体系快速、准确、特异，并可依据样品熔解曲线鉴定PVS^O和PVS^A株系。叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎等5个部位组织均可用于检测，实用性强，可为生产脱毒种薯提供技术支持。

为了探讨块茎形成相关基因表达量的变化，利用pH值4的磷酸溶液对植株根进行了4 d的胁迫处理，之后收集匍匐茎茎尖形成弯钩之前（Ⅰ）、匍匐茎弯钩时期（Ⅱ）、匍匐茎刚膨大时期（Ⅲ）、初具块茎形态特征时期（Ⅳ）的匍匐茎作为试验材料。出苗后生长45 d的植株形成的匍匐茎中Ⅱ时期匍匐茎所占比例最高。生长45 d时酸处理的植株所形成的块茎数量最多，其结薯数量比生长55，60 d酸处理植株的结薯数量显著高53.2%，74.5%。匍匐茎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时期，酸处理植株的StHd3a、StFD、StSUSY4、StHXK、StPIN1、StABA、StSP6A表达量均显著高于对照组；匍匐茎Ⅰ时期和Ⅱ时期，酸处理植株的StGA的表达量比对照显著高49.4%，25.1%，StAGL8的表达量比对照显著高119.7%，140.1%，而StAGPase的表达量比对照显著低60.1%，41.7%，StSSS的表达量比对照组显著低23.2%，21.6%；另外，酸处理植株StCOL的表达量与对照相比无显著性差异。综上，酸处理是通过调控被测基因的表达量或表达模式（除StCOL基因）而影响块茎形成的复杂过程。

通过设置不同的灌水处理，研究了不同灌水时期组合对膜下滴灌马铃薯产量及水分利用效率的影响，以期为确定膜下滴灌马铃薯适宜的灌水方案提供理论依据。在总灌水量为1 725 m³/hm²、灌水次数均为7次的情况下，以不灌水处理为对照（CK），分别设置4个不同灌水时期组合，分别为B1（6月15日灌水300 m³/hm²、6月25日灌水225 m³/hm²、7月5日灌水300 m³/hm²、7月15日灌水300 m³/hm²、7月25日灌水225 m³/hm²、8月4日灌水225 m³/hm²、8月14日灌水150 m³/hm²）、B2（6月5日灌水150 m³/hm²、6月15日灌水300 m³/hm²、6月25日灌水225 m³/hm²，7月5日灌水300 m³/hm²、7月15日灌水300 m³/hm²、7月25日灌水225 m³/hm²、8月4日灌水225 m³/hm²）、B3（6月5日灌水150 m³/hm²、6月15日灌水300 m³/hm²、7月5日灌水300 m³/hm²，7月15日灌水300 m³/hm²、7月25日灌水225 m³/hm²、8月4日灌水225 m³/hm²、8月14日灌水225 m³/hm²）、B4（6月15日灌水300 m³/hm²、7月5日灌水300 m³/hm²、7月15日灌水300 m³/hm²、7月25日灌水225 m³/hm²、8月4日灌水225 m³/hm²、8月14日灌水225 m³/hm²、8月24日灌水150 m³/hm²）。结果表明：随着马铃薯生育时期的推进，叶面积指数、叶及叶柄和茎的干物质累积量以B1处理最高，均在出苗后65 d达到最大值；块茎干物质累积量在收获期达最大值，B1处理极显著高于其他处理。B1处理的块茎产量和商品薯率最高，分别达到53 246 kg/hm²，89.6%，与其他处理无显著差异，但水分利用效率显著高于其他处理。淀粉含量以CK最高，各灌水处理间无显著差异。Pro含量及MDA含量均以B1处理最低，显著低于CK。综上，B1灌水时期处理组合可作为膜下滴灌马铃薯生产中适宜的灌水时间组合。

为明确马铃薯StPR1基因在抗病中的作用，构建了植物表达载体pBI121-StPR1，并通过农杆菌转化法将StPR1基因导入烟草中，采用不同的致病菌对转基因烟草进行处理，对其抗病性及生理特性进行研究，包括细菌病害软腐病（胡萝卜软腐欧文氏菌、菊欧氏菌和胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种）和青枯病（茄科雷尔氏菌）、真菌病害干腐病（接骨木镰孢、燕麦镰孢）致病菌。结果表明，接种致病菌后，转基因型烟草和野生型烟草叶片上的病斑直径会随着病菌胁迫时间的延长而增大，并且转基因型烟草病斑直径明显小于野生型烟草；在生理特性分析中，野生型烟草和转基因烟草叶片中生理指标都会随着病菌胁迫时间的延长而呈上升趋势，但转基因烟草SOD、POD和CAT活性较野生型烟草均有不同程度的提高。抗病性及生理特性分析结果均表明，转基因烟草对于致病细菌和真菌均具有更强的抗性，说明StPR1基因在马铃薯植物抗病中起着重要的作用，为PR1基因在植物的抗病方面提供了理论基础。

为了探究来源于马铃薯中的StBAG3基因在马铃薯抗性建立过程中可能具有的功能，以夏坡蒂马铃薯的离体叶片为试验材料，利用马铃薯的瞬时表达体系对StBAG3基因的功能进行了初步的研究。结果表明，在瞬时表达StBAG3基因的马铃薯离体叶片上人工接种马铃薯晚疫病菌，24，48，72，96 h后接种位置病斑的相对面积较对照病斑显著减少了1.92~39.15百分点，说明瞬时表达StBAG3基因后显著提高了马铃薯对晚疫病菌的抗性水平。这一结果也从对接种部位坏死细胞的染色中得到了证实。H₂O₂定性和定量测定的结果表明，瞬时表达StBAG3基因后接种部位H₂0₂积累量在接种后0~48 h差异不显著，接种后72，96 h与对照差异显著，二者均在72 h达到最大值，分别为0.146，0.086 μmol/g。ROS清除酶活性测定的结果表明，接种后瞬时表达StBAG3基因部位SOD和CAT的活性随着接种时间推移，变化的模式有所差异，但二者在0~96 h均高于对照叶片，而POD的活性在接种后0~72 h与对照叶片没有显著差异，仅在接种后96 h显著高于对照叶片，间接证明了H₂O₂参与了StBAG3基因介导的正向调控马铃薯对晚疫病的抗性建立过程。由此可见，StBAG3基因能够提高马铃薯对晚疫病的抗性水平。

为探讨氮肥用量和栽插密度与鲜食型甘薯产量、品质及淀粉糊化特性的关系，以徐薯32和徐紫薯5号为试验材料，设置3个施氮量（N）水平和5个密度（D）水平，于2017，2018年进行了田间试验。结果表明：两品种的薯块产量随施氮量的增加呈下降趋势，随密度的增加呈先下降后上升趋势，总体上在N0（0 kg/hm²）和D1（43 785株/hm²）水平下薯块产量最高。施氮使2个甘薯品种的干物质率降低，而显著增加了蛋白质含量；随栽插密度的增加，干物质率、淀粉和蛋白质含量总体上呈先升高后降低的趋势，还原糖含量总体呈下降趋势，而可溶性糖含量呈波动变化，均在D3水平下最低。施氮总体上使两品种块根的淀粉最高黏度、最低黏度和崩解值明显降低，消减值均明显升高，造成蒸煮食味品质的下降；两品种的最高黏度、最低黏度、崩解值和最终黏度值均随着密度的增加呈波动变化，徐薯32在D3水平下最大，而徐紫薯5号在D2水平下最高；施氮量和栽插密度对甘薯淀粉RVA谱的影响存在品种间和特性间的差异。综合本试验结果，在土壤肥力较高的地块大量施氮使甘薯产量下降，并降低了薯块营养品质和食味品质；在43 785株/hm²的密度水平下薯块产量最高，但适当增加密度有利于营养品质和蒸煮食味品质的提高。

为研究种植模式（马铃薯燕麦间作）和施氮水平对马铃薯农艺性状及产量方面的影响，进行3种种植模式（马铃薯单作、燕麦单作和马铃薯燕麦间作）和4个施氮水平（0，75，150，225 kg/hm²）的裂区试验设计，旨在揭示种植模式和施氮量对马铃薯农艺性状及产量的影响规律以及种植模式和施氮对马铃薯农艺性状和产量的贡献程度，为进一步深入研究间作系统中氮素的运移提供一定的理论基础。研究结果表明，同一种植模式下，各施氮处理马铃薯株高、茎粗、干物质积累速率和叶绿素含量（SPAD）均随着生育时期的推进呈现先上升后降低的趋势，且表现为施氮作用的影响要高于种植模式。施氮处理下马铃薯产量均高于不施氮处理，间作增加幅度大于单作，施氮对产量的贡献程度要大于间作，与对照相比，单作施氮处理产量分别增加1.73%，10.29%，3.97%；间作施氮处理产量分别增加8.68%，31.23%，15.33%；施氮水平与间作种植模式交互作用下，马铃薯产量差异显著（P<0.05），不施氮间作产量低于单作，可能是由于两者间的种间竞争作用所致。不同施氮水平下，间作系统的土地当量比（LER）均大于1，间作优势明显，马铃薯燕麦间作的种间竞争力均小于0，燕麦的竞争能力强于马铃薯。马铃薯产量与每穴块数、每穴薯质量和大薯数呈正相关。综上，种植模式和施氮水平对马铃薯农艺性状和产量都有影响，并且施氮贡献效果要优于种植模式。

为了研究不同马铃薯品种苗期块茎钾素含量以及其他相关生理特性随供钾水平不同的变化规律，采用田间试验方法对东农310、延薯4号和中薯5号在3个供钾水平下开展研究。结果表明：在K₀、K₁、K₂这3种供钾水平下，不同品种块茎钾素含量差异显著，且东农310苗期的钾素含量远高于中薯5号以及延薯4号。对低钾和高钾条件下马铃薯钾素含量与叶绿素（SPAD）、根系活力（RV）、丙二醛含量（MDA）、蔗糖合成酶（SS）以及蔗糖磷酸合成酶（SPS）进行了相关性分析，钾素水平较低的情况下，根系活力以及相关酶活性成为影响钾素含量的限制因素；而在高钾条件下，钾素含量与SPAD呈正相关，而与其他均呈负相关。因此，随着钾素供给水平的提高，钾素的供应量成为块茎钾含量提高的限制因子。

为了探明不同水氮处理对设施膜下滴灌马铃薯块茎产量、品质及土壤硝态氮运移的影响，采用二因素三水平完全随机区组设计，分别设3个灌水处理（450，900，1 350 m³/hm²）和3个氮处理（150，225，300 kg/hm²）共计9个水氮组合处理，分别于收获期测定马铃薯产量、商品性、维生素C、淀粉、可溶性蛋白、可溶性糖、硝酸盐含量及各生育期不同土层硝态氮含量。结果表明：马铃薯产量及商品率均随着施氮量和灌水量的增加，呈现抛物线趋势变化，在施氮量为225 kg/hm²，灌水量900 m³/hm²时达到最大，分别为35 299.9 kg/hm²和77.9%。在相同灌水量下，随着施氮水平的增加，维生素C、硝酸盐含量及块茎吸氮量明显增加，在相同施氮水平下，随着灌水量的增加硝酸盐含量和氮肥偏生产力显著降低；同时，可溶性蛋白、块茎吸氮量和氮收获指数呈抛物线变化趋势，且各灌水处理间差异显著。马铃薯各生育期各处理硝态氮含量均为表层土（0~20 cm）最高，且在0~100 cm剖面呈降低趋势，马铃薯苗期及块茎形成期是NO^-₃-N向土壤下层移动的主要时期。因此，在设施覆膜滴灌马铃薯种植施氮量应控制在225 kg/hm²，灌水量900 m³/hm²为宜。

为了探讨河西绿洲地区水分处理对膜下滴灌马铃薯生长动态、耗水特征、品质、产量和水分利用效率的影响，以青薯168为试验材料进行大田试验，分别在马铃薯不同生育期设置轻度和中度水分亏缺，测定马铃薯株高、叶面积、产量及薯块有机质含量等指标。结果表明：与充分灌溉CK比较，块茎形成期轻度（WD3）水分处理马铃薯未显著降低产量，而水分利用效率和商品薯率分别提高22.07%，10.09百分点，薯块干物质、蛋白质、淀粉及还原糖含量均未显著性降低，但串薯比例比CK增高达8.20百分点；块茎膨大期进行轻度（WD5）和中度（WD6）水分处理均造成马铃薯显著减产（P<0.05），分别降低15.77%，18.93%，同时不利于薯块内有机物的积累，使薯块干物质、蛋白质和还原糖含量分别降低1.62百分点，28.50%，34.38%和3.38百分点，24.35%，46.88%；淀粉积累期轻度（WD7）和中度（WD8）水分处理对产量影响较小，但WD7处理使马铃薯商品薯率增高8.61百分点，薯块蛋白质和还原糖含量分别比CK增高3.11%和15.63%，但未使水分利用效率显著提高。因此，追求马铃薯较高的产量和水分利用效率，在块茎形成期轻度水分处理为最佳的灌水策略，而获得马铃薯较高品质，淀粉积累期轻度水分处理最佳。