为了探索DUF760基因家族在水稻生长发育中的潜在功能,对水稻DUF760基因家族进行了全基因组鉴定、分类、启动子序列分析和表达谱分析。通过生物信息学技术在水稻和拟南芥中分别鉴定了6,8个DUF760家族成员。系统进化树分析将这些家族成员分成2个亚家族,二者在蛋白保守基序和基因结构上也存在一些特征差别。水稻DUF760家族基因启动子区域存在多个响应逆境胁迫和植物激素的顺式作用元件,ABRE(脱落酸响应)元件存在于家族所有成员的启动子序列中,OsDUF760-1启动子区域拥有9个脱落酸(ABA)相关的响应元件。在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平显著下调,而OsDUF760-3显著上调,二者在干旱胁迫处理水稻后的表达变化模式与ABA处理水稻后的表达变化模式一致,说明这2个基因可能通过ABA信号途径参与水稻干旱胁迫响应,并且扮演不同的角色。除对ABA和干旱胁迫处理具有较强响应外,水稻DUF760家族成员还对JA(茉莉素)、低温及稻瘟菌处理具有较强的响应表达变化。

为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料,根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段;通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体;用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆;再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株;最后,相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T₁转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明,OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化,穗长变短,叶片夹角下降,种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短,叶片对BL的响应不敏感;而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加,穗长变长,叶片夹角增加,种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长,叶片对BL的响应敏感。综上,这些结果为改变水稻植株结构进而增加籽粒产量提供理论支持并可能为后续研究OsBAK1和前体物质OsBAK1P的其他功能提供参考。

为了挖掘雄性不育种质资源,鉴定雄性育性基因,为玉米雄性不育化制种提供基础材料。以玉米雄性不育突变体x50为试验材料,研究突变体雄性不育表型,构建x50与自交系Mo17的F₁和F₂群体,确定突变体x50雄性不育性状的遗传模式。以F₂群体为材料,应用图位克隆技术定位雄性育性基因X50,通过基因等位性测验确定候选基因。结果显示,与野生型相比,雄性不育突变体x50花药不能从颖壳露出,花药体积较小且萎蔫,无成熟花粉粒形成。F₁群体植株均表现为雄性可育,F₂群体植株出现雄性育性分离,可育植株与不育植株分离比例符合3∶1,说明突变体x50不育性状受1对隐性核基因控制。通过图位克隆方法将雄性育性基因X50定位于玉米第2染色体分子标记2-4901与2-4963之间,物理区间为237.42~241.39 Mb。定位区间内候选基因分析发现,区间存在玉米雄性不育基因ZmMs33。以ms33纯合突变体ms33-6029和ms33-6052分别与x50杂合型+/x50杂交,杂交后代可育植株与不育植株分离比例符合1∶1,表明x50是ZmMs33基因一个等位突变体。玉米雄性不育突变体x50的鉴定为玉米杂交种子生产和ZmMs33基因功能研究提供了种质材料。

为发掘小麦品质性状相关数量性状位点(QTL),以小麦骨干亲本百农AK58和碧蚂4号衍生的包含248个株系的重组自交系群体为材料,利用4个环境获得的蛋白质含量、湿面筋含量、淀粉含量、沉降值和延伸性等品质参数及已构建的单核苷酸多态性(SNP)高密度遗传连锁图谱进行QTL定位。通过完备区间作图法共检测到60个品质性状相关QTL,分布于除6B以外的20对小麦染色体上。有21个QTL可以在2个或2个以上环境中被检测到,其中15个QTL的增效基因来自百农AK58,6个QTL的增效基因来自碧蚂4号。4A染色体上116.4~139.0 cM(629.36~701.53 Mb)是一个QTL簇,该区段同时定位了与蛋白质含量(QGpc.his-4A-2)、湿面筋含量(QWgc.his-4A-2)、沉降值(QSv.his-4A)和延伸性(QEx.his-4A)相关的QTL。分析重组自交系群体中1BL/1RS易位对品质性状的影响,发现1BL/1RS易位有助于提高籽粒蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值,对淀粉含量有一定的负效应,推测1BL/1RS易位系对品质性状的作用可能和其遗传背景相关。

WRKY转录因子是植物非生物胁迫反应中的重要调节子。荞麦耐贫瘠,磷利用率较高。为了探究WRKY基因在荞麦磷饥饿反应中可能的调节作用,以苦荞麦为材料,采用逆转录PCR方法,从低磷处理的根RNA样品中获得了FtWRKY6基因的编码序列。FtWRKY6 cDNA长1 572 bp,编码524个氨基酸,含有2个典型的WRKY保守结构域,锌指类型为C₂H₂,归属于第Ⅰ类WRKY,与绿茶CsWRKY24在氨基酸水平上的同一性较高(55.5%)。拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,FtWRKY6定位于细胞核中;酵母单杂交试验表明,FtWRKY6具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,在根中FtWRKY6的表达受低磷和3种重要的低磷反应相关激素—吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)显著诱导。上述结果提示,FtWRKY6具有转录因子的基本结构与生化特征,在根中可能通过IAA、GA、CTK信号通路的交互作用介导苦荞麦在低磷条件下的响应过程。

为了对大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE的功能进行初步鉴定,并对其生物学特性及表达模式进行分析,通过生物信息学分析、PCR扩增及qRT-PCR等方法来对大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE进行研究。由于大麦G1614为大麦MOREX品种的姊妹系,且大麦MOREX品种公布了参考基因组数据,所以通过将短穗二柄草BdMUTE基因同大麦G1614基因组进行序列同源比对,得到大麦HvMUTE基因序列。从大麦材料G1614幼芽中的第1片叶片中取样,克隆得到大麦HvMUTE基因651 bp的编码区。生物信息学分析结果表明, HvMUTE蛋白是位于细胞核中的无明显亲水疏水性的不稳定蛋白质,并且其蛋白质三维结构含有螺旋-环-螺旋(HLH)结构。系统进化树分析结果表明,HvMUTE蛋白同小麦和山羊草的MUTE-Like蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,在干旱条件下,HvMUTE基因表达量无明显变化,这一结果同前人研究有所不同,猜测与大麦为单子叶植物,气孔结构中存在副卫细胞同双子叶植物气孔结构形态不同有关。

为探究CaMADS6表达量与辣椒花器官发育之间的关系,以辣椒不育系9704A和保持系9704B为试验材料,克隆CaMADS6进行生物信息学预测,并分析该基因在两系中的时空表达特性。结果表明,从9704A和9704B中克隆得到的CaMADS6编码区序列一致,序列长744 bp,编码247个氨基酸残基。CaMADS6蛋白相对分子量为28.67 ku,理论等电点为8.98,为亲水性蛋白,无跨膜结构,二级结构中α螺旋占57.49%、延伸链占8.91%、无规则卷曲占28.74%。CaMADS6与辣椒CaFUL2同源性100%,蛋白结构域具有典型的MADS-box特征;CaMADS6在两系各发育时期不同器官中均有表达,表达量大小均为花蕾中最高、其次为叶和茎,根中几乎不表达。9704A茎中CaMADS6表达量在苗期、花蕾期和成株期3个发育时期中均显著低于9704B茎中的表达量,叶中CaMADS6表达量在成株期极显著低于9704B叶中表达量。花蕾中CaMADS6表达量在花蕾期和成株期均极显著高于9704B花蕾中表达量,分别为9704B的2.2,3.5倍;CaMADS6在两系植株花器官不同部位均能表达,表达量由大到小依次为花萼、花冠、子房、花药,其中9704A花萼和花冠中CaMADS6表达量极显著或显著低于9704B,分别为9704B花萼、花冠中CaMADS6表达量的66%,83%,花药中CaMADS6表达量为9704B表达量的34倍,两者差异极显著,推测CaMADS6基因在花药中的异常表达与辣椒雄性不育密切相关。

为了解香瓜茄果实主要类黄酮成分以及不同栽培种间类黄酮物质的代谢差异,以我国当前主栽的淡椭圆形果实(LOF)和甜圆形果实(SRF)2个香瓜茄栽培种类型为对象,对成熟果实进行转录组和代谢组联合分析。结果表明,香瓜茄果实中类黄酮组分共鉴定出9类二级代谢产物,41种三级代谢产物,黄酮醇含量最高。具有显著差异的代谢物有21种,主要分布在黄烷醇类、黄酮碳糖苷等6类二级代谢物质中。LOF的二氢黄酮、黄烷醇类、异黄酮的含量高于SRF,而黄酮醇等其他类黄酮化合物则在SRF中含量较高。RNA-seq分析共鉴定出与类黄酮代谢相关的基因503条,其中类黄酮合成通路上游的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)等关键基因表达在LOF中较SRF均上调,而黄酮醇合成酶基因(FLS)表达则在SRF中高于LOF。根据转录组的结果,4个类黄酮合成酶的表达趋势与RT-PCR的检测结果一致。研究结果表明,在不同香瓜茄资源LOF和SRF中存在大量的类黄酮化合物及其合成酶基因,但不同类黄酮成分及其合成代谢相关酶在不同资源含量均存在差异。

为探究不同干旱胁迫时间处理下,二倍体马铃薯材料对干旱胁迫响应的分子机制,挖掘抗旱相关基因。以高抗旱二倍体资源A90为试验材料,利用转录组测序技术对PEG-6000胁迫下不同时间的差异表达基因进行分析,通过GO富集、KEGG通路分析与转录因子预测参与马铃薯干旱胁迫响应的差异表达基因,初步挖掘抗旱调控关键基因;并通过RT-qPCR对3个抗旱候选基因进行逆境胁迫表达分析。结果表明:A90在20%PEG-6000胁迫处理3,6,24 h与对照相比,共有2 519个差异表达基因,这些基因主要富集在植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等抗旱相关过程中。并且显著富集在通路上的340个共差异表达基因中有53个基因注释到了RLKs、AP2/ERF和Tify等15个转录因子家族中,其中StST/K1、StERF1和StTify1的表达量较高,有可能是抗旱调控关键基因。基因StST/K1和StERF1受到干旱和低温胁迫主要在材料的根和叶中上调表达,基因StERF1在盐胁迫下在材料的根、茎和叶中均上调表达;基因StTify1在受到干旱在材料的茎和叶中上调表达,受到盐胁迫在材料的根、茎和叶中均上调表达,但在低温胁迫下只在材料的茎中下调表达。由此说明,筛选出的3个基因均能够对干旱、盐和低温胁迫产生响应,可为今后马铃薯抗旱分子育种中相关抗旱候选基因研究提供一定的理论基础。

为降低青梗菜硝酸盐含量,在采收前对其进行断营养处理。生理分析发现,断营养5 d青梗菜产量无明显变化,但根、叶柄和叶片的硝酸盐含量分别降低了49.77%,23.90%,33.39%。转录组比较发现,断营养5 d青梗菜根、叶柄和叶片分别鉴定出301,2 270,2 271个差异表达基因(DEGs)。基因本体论(GO)分析表明,这些DEGs均主要富集在氮(N)代谢、碳(C)代谢和活性氧(ROS)代谢过程中。在N代谢过程中,根、叶柄和叶片硝酸盐摄取转运蛋白NPF7.2基因下调表达;叶柄和叶片NPF7.2的上游调控因子ERF104下调表达;叶片硝酸盐再转运蛋白NPF2.13和NPF1.1基因上调表达;根和叶片硝酸盐同化关键酶谷氨酰胺合成酶(GS)基因上调表达。在C代谢过程中,叶柄和叶片蔗糖合成关键酶磷酸蔗糖合酶(SPS)基因上调表达。在ROS代谢过程中,根的超氧化物歧化酶(SOD)基因和抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因上调表达;叶柄和叶片细胞色素P450、过氧化物酶体和脂肪氧化酶下调表达;叶片过氧化氢酶(CAT)基因和过氧化物酶(POD)基因上调表达。综上,在青梗菜采收前5 d进行断营养处理,不仅可以保证产量不受影响,还可以降低硝酸盐含量,提高品质。

原花青素是植物中广泛存在的一类黄酮类化合物,是人类膳食的重要营养成分,在防治病虫害方面也发挥着重要作用,花青素还原酶(ANR)是合成原花青素的关键酶。以大果球红花品种为材料,克隆得到2个CtANR基因。生物信息学分析表明,CtANR2和CtANR3的编码区分别为1 020,1 023 bp,对应基因组序列中均含有5个外显子和4个内含子,第1个外显子长度不同,其余4个外显子长度一致,内含子长度差异较大。CtANR2和CtANR3基因编码蛋白质的氨基酸数目分别为339,340个,二级结构都主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,都属于水溶性蛋白,但CtANR2蛋白不稳定,而CtANR3为稳定的亲水性蛋白。此外,2个蛋白质都不存在信号肽和跨膜结构,可能定位于细胞外。序列比对及系统进化分析表明,CtANR2和CtANR1同源性最高,亲缘关系最近,3个CtANR蛋白与菊科植物ANR蛋白进化关系最近,与茄科、锦葵科和桑科植物ANR蛋白也同属一个大分支。组织特异性表达分析发现,CtANR2和CtANR1组织表达模式相似,都是在花中的表达量最高,初期果球表达量最低,而CtANR3则在苞片中表达量最高,根和初期果球中表达量最低。三者在不同激素胁迫下呈现出不同的表达模式,CtANR2和CtANR1在不同激素处理后表达量均下降,而CtANR3在5种激素处理后表达量均有不同程度的升高。以上结果表明,红花3个CtANR基因可能在红花不同发育阶段及抵抗非生物胁迫中有不同的分工。

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式,在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料,克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析,包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示,RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCML42与巴西橡胶树一致性最高,达86.84%。qRT-PCR结果显示,RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达,在经NaCl处理后,RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达,在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器,通过与钙调素结合蛋白结合进而对植物细胞进行调控。当植物受到环境中NaCl侵害时,CML可以参加体内钙离子的调节,进而减轻盐胁迫对植物体的损害。综上,推测RcCML42在盐胁迫条件下的蓖麻信号转导中起重要作用。

为探索1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)是否参与香鳞毛蕨对环境的抗逆功能,用PCR克隆并鉴定了香鳞毛蕨DfDXR基因,并通过在线预测网站对其蛋白序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了DfDXR基因在不同化学物质和逆境胁迫处理下相对表达量的变化。结果表明,成功克隆出DfDXR基因的CDS序列全长1 434 bp,编码477个氨基酸,DXR蛋白二级结构为alpha-beta型。蛋白质多序列比对以及进化树分析表明,DfDXR与铁线蕨AcDXR亲缘关系较近,与苹果和桃等植物的DXR蛋白亲缘关系较远,Motif分析表明,该蛋白含有PLN02696结构域,该结构域为DXR蛋白的保守结构域,亚细胞定位预测DXR蛋白定位于叶绿体上,与其他物种一致。对qRT-PCR数据进行分析显示,DfDXR的相对表达量在茉莉酸甲酯(MeJA)和聚乙二醇(PEG)处理后总体都呈现上调的趋势,并分别在1,12 h达到最高;NaCl处理下呈“降—升—降”的趋势,但各处理时间下的表达量均低于对照组;水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(ETH)、高温(HT)以及低温(LT)处理下,DfDXR的相对表达量也发生明显变化。在香鳞毛蕨响应不同非生物胁迫过程中,DfDXR均发挥调控作用,且DfDXR对不同化学物质和逆境胁迫的响应时间不同。

播期和密度是影响玉米产量的2个关键因素。为明确不同玉米品种在黄淮海地区对夏播播期和密度的响应特征,以中农大788和科河699为试验材料,设置6月10日、17日、24日3个播期,以及67 500(A),75 000(B),82 500(C)株/hm² 3个播种密度,调查其生育进程、形态指标、产量及产量构成因素。结果表明,随着播期推迟,玉米吐丝前的生育进程加快,籽粒灌浆期延长,第3播期(6月24日)的籽粒无法正常成熟。晚播(第3播期)相较于早播(第1播期即6月10日),中农大788穗位高和科河699株高、穗位高均显著增加,2个品种茎粗均显著减小;2个品种空秆率和倒伏率均随播期推迟而增加;中农大788主要由于千粒质量降低,导致产量降低21.8%,科河699穗数、穗粒数、千粒质量均显著降低,导致减产41.3%。密度C较密度A,2个品种株高、穗位高、空秆率、倒伏率均显著增加,茎粗则显著减小。中农大788在密度B获得最大产量且显著高于密度A,分别为12 450,11 097 kg/hm²。随密度增加科河699空秆率增加,导致穗数并未显著增加,穗粒数减少,密度C较密度A产量显著降低,分别为7 548,9 464 kg/hm²。播期密度互作仅对倒伏率有极显著影响,对植株形态指标、空秆率、产量及产量构成因素影响不显著。综合来看,中农大788平均产量高于科河699,前者在晚播和高密条件下空秆和倒伏率低,产量更稳定。实际生产中,夏玉米应尽量早播,晚播可通过选择适宜的品种减少产量损失,选育耐密品种是增密增产的关键。

潞玉13是由山西农业大学谷子研究所育成的优良玉米品种。该品种抗旱性好、耐逆性强,社会效益显著。为比较杂交种潞玉13亲本1572和海921抗旱耐逆特性,采用20% PEG模拟干旱对潞玉13杂交种及双亲种子的萌发和幼苗生长相关参数进行了比较,结果表明,在正常条件下,潞玉13、1572和海921发芽参数无显著差别,但干旱条件下的发芽率、发芽势、发芽指数、萌发抗旱指数均受到抑制,而海921受抑制程度显著高于1572和潞玉13,揭示1572种子活力明显高于海921,在干旱胁迫下有较高的发芽率和发芽优势,对干旱有较强的适应能力。随后选取逆境应答关键基因ZmCIPK16和ZmSAM1,用荧光实时定量PCR方法研究它们在1572和海921自交系苗期不同非生物逆境胁迫以及不同生育期干旱胁迫下的表达情况,结果显示,ZmCIPK16和ZmSAM1广泛参与了1572和海921苗期干旱、盐、低温、高温和ABA以及在不同生育期的干旱应答,相比较在自交系1572中能更积极参与对干旱等逆境的响应。这些结果揭示自交系1572是优良的抗旱耐逆种质,可能在杂交种潞玉13抗旱耐逆方面贡献大于自交系海921。

为探明糯小麦籽粒淀粉组分和理化特性对灌水的响应,在大田条件下,采用裂区设计,主区为2个糯小麦品种(临糯88,软质;晋麦99号,硬质),副区为3种灌水处理(S₁,越冬水;S₂,越冬水+拔节水;S₃,越冬水+拔节水+灌浆水),同时以不灌水作为CK,分析灌水对2个糯小麦籽粒产量、淀粉含量、淀粉组分、粒径分布、面粉糊化特性及品质的影响,并对其进行相关性分析。结果表明,随灌水次数增加2个糯小麦品种籽粒产量及其构成因素均提高,2 a平均S₃处理下较S₁和S₂处理下临糯88分别增产 63.59%和 9.02%,晋麦99号分别增产 64.15%和 6.95%;S₂处理下2个糯小麦品种淀粉含量均最高,临糯88、晋麦99号较CK分别提高1.75,5.54百分点;临糯88支链淀粉含量随灌水增加先升后降,S₂处理显著高于其他处理,晋麦99号支链淀粉含量随灌水增加而降低,S₁处理显著高于其他处理;淀粉直/支则与之相反。供试品种淀粉粒的粒径分布为1.0~45.7 μm,其数目分布呈单峰曲线变化,体积和表面积分布均呈双峰曲线变化,随灌水次数增加,B型淀粉粒数目先升后降,面粉糊化温度先降后升,峰值时间前移,但均以S₂灌水处理最显著;蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值均随灌水次数增加而降低。本试验条件下,灌越冬水+拔节水在稳产的同时,可提高临糯88的淀粉含量、B型淀粉体积比例,降低淀粉直/支比;灌越冬水+拔节水+灌浆水在高产的同时,可降低晋麦99号的淀粉直/支比,改善硬质糯小麦的糊化特性。灌水能有效调控糯小麦籽粒淀粉组分和粒度分布,从而改变了淀粉的理化性质。

为了探讨1-甲基环丙烯(1-MCP)对红星苹果贮藏品质、生理以及电子鼻特性的影响,以红星苹果为研究对象,测定1-MCP处理后常温贮藏(20±1)℃过程中果实呼吸速率、乙烯释放速率、内在品质及外观色泽和电子鼻响应情况。结果表明:随着贮藏时间延长,红星苹果采后呼吸速率、乙烯释放速率升高,分别于10,15 d达峰值后降低。同时,果实硬度下降、可滴定酸含量降低,SSC先升高后降低;果皮a^*值、b^*值、C^*值和ΔE^*值升高。1-MCP处理抑制红星苹果贮藏期呼吸速率和乙烯释放速率,延缓果实硬度、SSC和TA含量下降,同时抑制果皮a^*值、b^*值、C^*值和ΔE^*值升高。电子鼻检测表明,1-MCP处理明显减少了硫化物和萜烯类化合物(W1W)、氮氧化合物(W5S)、有机硫化物和芳香族化合物(W2W)、甲基类芳香物(W1S)以及醇类和醛酮芳香化合物(W2S)的生成。判别分析(LDA)能区分不同贮藏时期对照和1-MCP果实的电子鼻感应值。载荷分析表明,W1W、W5S、W2W、W1S和W2S等5个传感器对区别不同贮藏时期对照和1-MCP处理的贡献较大。1-MCP处理可延缓红星苹果软化,使其保持较低的固酸比,对于维持常温贮藏下果实风味和色泽具有显著效果;但1-MCP降低了果实电子鼻敏感传感器的响应值,在一定程度上减少了挥发性物质的生成。相关分析表明,红星苹果电子鼻敏感探头响应值与果实品质显著相关,为电子鼻作为红星苹果快速无损检测提供了依据。

为选育优质抗稻瘟病保持系软华B,以携带稻瘟病抗性基因Pi46和Pi2的优质籼稻H281作为供体亲本、以软华B为轮回亲本,利用分子标记辅助选择(MAS)技术结合系谱选育法,聚合2个外源基因以改良保持系软华B。对性状稳定的改良株系进行稻瘟病抗性鉴定、稻米品质分析等。通过回交及多代自交,并结合分子标记检测,获得以软华B为遗传背景且含有2个纯合目标基因的BC₁F₆群体2个、BC₂F₅群体2个、BC₃F₄群体2个。田间自然诱发鉴定结果表明,不同回交世代改良材料在自然病圃均抗稻瘟病;育性鉴定结果显示,回交世代对不育系的不育度为52.7%~100.0%;农艺性状考查及米质分析表明,改良株系基本保留了软华B的主要农艺性状和稻米品质特性。SNP基因芯片分析结果显示,BC₁F₆的背景回复率为74.42%~77.77%,BC₂F₅的背景回复率为86.42%~87.75%,BC₃F₄的背景回复率为92.27%~92.59%。利用连续回交、自交和分子标记辅助选择等技术可有效聚合多个抗性基因,获得抗稻瘟病的新保持系,快速实现保持系软华B的分子改良,为选育抗病、优质的杂交稻组合提供良好的亲本材料。

为了明确粗糙脉孢菌NC-3菌株在水稻秸秆还田上的应用潜力,采用室内培养和盆栽试验相结合的方法,分析NC-3菌株在水稻秸秆上的定殖,对水稻秸秆降解,纤维素、半纤维素、木质素、总酚酸含量以及油菜发芽率和成苗率的影响。结果表明,NC-3菌株能在灭菌的水稻秸秆上迅速定殖(72 h长满菌丝和孢子)。相比无菌水,培养7,14,21 d,NC-3菌株处理的水稻秸秆降解率分别提高2.3,7.3,3.2百分点;秸秆纤维素、木质素以及总酚酸含量分别下降2.0,10.7,10.4百分点,0.7,0.9,1.3百分点和7.6%,6.9%,6.4%。NC-3菌株对水稻秸秆、纤维素、木质素和总酚酸的降解作用主要发生在培养的前14 d(0~14 d),对半纤维素的降解作用在培养14 d后逐渐增强。添加水稻秸秆会显著降低油菜发芽率和成苗率,且随秸秆用量的增加抑制作用增强,但接种NC-3菌株能显著提高油菜发芽率和成苗率(相比无菌水,分别提高3.3,9.7百分点)。总之,接种脉孢菌NC-3菌株能有效加快水稻秸秆降解和酚酸类物质转化,可有效提高油菜发芽率和成苗率。

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一,旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先,根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物;然后,针对该引物组筛选了其最佳反应温度,检测了LAMP反应的特异性和灵敏度,并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明,本研究设计的引物组在61~68 ℃条件下均能实现对靶标基因的扩增,其中以66 ℃为最佳反应温度;在特异性检测中,引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢;在灵敏度检测中,对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下,25 min左右即可实现扩增;在对玉米根腐病样本检测中,在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。

为探究甘蔗 PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系,以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象,通过RT-PCR技术对ScPRT1 (GenBank 登录号:MT747433)基因进行克隆,生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明,该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框;其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有核定位信号;该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域;ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR 结果显示,ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大,在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调;受黑穗病菌胁迫后,在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达,在感黑穗病品种中下调表达,都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示,ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中,与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中,有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白,这暗示它们之间存在直接的相互作用。以上结果表明,ScPRT1在甘蔗激素信号传导以及响应黑穗病菌侵染过程中发挥重要作用。

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明:所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异,在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中,RPP13基因表达量的降低幅度为35%~60%。

为了揭示南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄PTI免疫的分子机理,以番茄品种新金丰1号 MiPDCD6超表达苗为试验材料,以番茄品种新金丰1号组培苗为对照,通过转录组测序技术分别对番茄MiPDCD6超表达苗和对照苗进行转录组测序。 以番茄栽培品种Heinz 1706基因组作为参考基因组进行对比,利用FPKM法计算基因表达量,设定参数(|log₂ FC|>1且P<0.05)筛选差异表达基因。利用Gene Ontology(GO)数据库进行差异表达基因GO功能富集分析,统计每个GO term中的差异表达基因数目,计算出基因富集的显著性,找出富集显著的功能条目。利用KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway富集分析,超几何分布检验方法计算每个Pathway中差异表达基因富集的显著性。以FDR和基因数量来衡量KEGG的富集程度。结合基因差异表达分析和功能富集分析,研究MiPDCD6蛋白对番茄PTI免疫相关通路基因的影响。结果发现:在超表达MiPDCD6番茄植株中,与野生型番茄相比,MiPDCD6过表达番茄植株中有2 366个差异表达基因(DEGs),其中1 354个上调基因,1 012个下调基因。 这些DEGs中,通过GO和KEGG注释,植物激素信号转导(sly04075)、植物-病原互作(sly04626)、植物MAPK信号通路(sly04016)和丙环素生物合成(sly00940)等KEGG通路中富集到大量的差异表达基因。SA生物合成途径包括ICS和PAL,MiPDCD6过表达番茄植株中SA合成通路PAL1和PAL-like基因以及SA信号转导途径TGA9、TGA10-like和PR1a2基因均显著下调,表明MiPDCD6基因可能抑制SA合成,从而抑制植物PTI免疫。

为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶,为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中,转化大肠杆菌 BL21(DE3)诱导表达;用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果;用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育,预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明,工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍;Pel419含375个氨基酸,N末端前22个氨基酸为信号肽,理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸,不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构,属于Pec lyase C家族;Pel419的Ca²⁺结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面,并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量,并获得了Pel419关键结构信息。

为探究HIF-1α在CoCl₂影响奶牛胎盘滋养层细胞迁移及侵袭变化中的作用,揭示奶牛胎盘在缺氧条件下的形成机制,从早期妊娠奶牛胎盘中分离纯化奶牛胎盘滋养层细胞(BTCs),用吉姆萨染色法观察细胞形态,免疫荧光法检测上皮细胞标志蛋白角蛋白7(CK7)、Thy/CD90蛋白表达,后将pCI-neo-hTERT质粒转染至BTCs,用qPCR和Western Blot法检测细胞TERT mRNA及蛋白表达,用CCK8法测定细胞增殖率,用ELISA法检测细胞分泌胎盘催乳素(PL)的能力,进一步利用siRNA沉默细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,ELISA法检测细胞分泌血管内皮生长因子(VEGFA)能力,通过划痕试验及Transwell检测细胞迁移及侵袭能力。结果显示,分离纯化的BTCs为典型上皮样细胞,存在一定数量的双核细胞,并表达上皮细胞标志蛋白CK7,未见Thy/CD90表达,转染后的细胞可稳定表达端粒酶(TERT)mRNA及蛋白,连续传代50代未见细胞老化现象,且增殖率显著高于原代BTCs(P<0.05),分泌PL能力较原代BTCs无显著差异(P>0.05)。经CoCl₂处理后发现,BTCs细胞活力随CoCl₂处理浓度及时间的增加而降低,HIF-1α mRNA及蛋白表达随CoCl₂浓度的增加而减少(P<0.05),400 μmol/L CoCl₂作用于BTCs 24 h建立缺氧模型,VEGFA分泌和迁移侵袭能力在BTCs缺氧状态下显著升高(P<0.05),而将HIF-1α基因沉默后显著降低了BTCs分泌VEGFA和迁移侵袭能力(P<0.05)。总之,通过外源性TERT基因转导建立了永生化的BTCs(Bovine trophoblast cells),永生化后的细胞具有与原代细胞相似的生物学特性,BTCs在缺氧条件下具有更强的VEGFA分泌能力及迁移侵袭能力,且与HIF-1α基因表达的上调有关。

旨在筛选西门塔尔牛与安格斯牛肾周脂肪的差异表达基因,分析2个品种牛血清指标差异,以期对肾周脂肪的脂质代谢和内分泌功能进行解析,为牛品种选育打下基础。选取相同月龄的西门塔尔牛和安格斯牛各3头,饲喂前采集空腹血液分离血清进行血清生化指标测定;屠宰后,采取相同大小的肾周脂肪,提取总RNA后进行转录组测序分析,使用DEGseq方法对各个样品的基因表达水平进行差异检测,对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析,并使用实时荧光定量PCR验证测序结果。结果表明,安格斯牛血清中白蛋白(ALB2)、尿素氮(UREAL)和葡萄糖(GLUC3)含量显著低于西门塔尔牛(P<0.05),甘油三酯(TRIGL)含量显著高于西门塔尔牛(P<0.05)。转录组结果显示,2个品种牛肾周脂肪间的差异表达基因为1 743,其中1 361个基因上调表达,382个基因下调表达。差异表达基因GO功能富集结果显示,差异基因显著富集到52个生物学功能,主要与细胞过程和细胞有关;KEGG富集结果显示,差异表达基因主要在Fat digestion and absorption、cAMP、PPAR和Rap1等信号通路显著富集,最终筛选出与脂质代谢相关的基因SCD5、APOA4、PTX3、OLR1和PRKCZ。通过实时荧光定量PCR测定差异基因的相对表达量,结果显示,测序结果和实时荧光定量PCR结果一致,说明测序结果可靠,研究获得的差异基因可作为肉牛品种培育的基础资料。

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点,以秦川牛为研究对象,利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列,利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征,以GAPDH为内参基因,采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示,秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸,CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性,且与瘤牛的同源性最高;CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白,主要由α-螺旋及不规则卷曲构成;亚细胞定位分析表明,CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体;蛋白互作分析表明,其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用,提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程;组织表达分析表明,CDS1基因在各个组织均有广泛表达,且在睾丸中表达量最高,在脑的表达水平也较高,二者均显著高于其他组织的表达水平,在心的表达量最低。

旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析;在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下,于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞,提取细胞总RNA,逆转录 PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因,确定ORFV113的动态转录水平;以ORFV-JS株基因组为模板,PCR扩增ORFV113基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV113重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞,通过Western Blotting 鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明,ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守,属于ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒,ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,大小为60~70 ku,比预测分子量大10~20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰;亚细胞定位研究表明,ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上,本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养,经电镜观察和IFA试验进行鉴定,通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增,SnapGene V4进行序列拼接和比对,利用DNAMAN V6对基因组末端5'UTR和3'UTR二级结构进行展示和比较,应用MEGA V7进行遗传进化分析,最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒,均鉴定为PPV1型毒株,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致,其中5'-UTR序列高度保守,呈Y型结构;而3'-UTR呈U型结构,个别碱基有所差异;VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示,突变株生长趋势相对较快,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。