克隆小麦籽粒超氧化物歧化酶(SOD)基因,开发与SOD活性相关的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记,对选育高SOD活性小麦品种具有重要意义。根据基因ID,设计特异性引物克隆得到TaSOD-B1基因gDNA序列;在小麦基因组遗传变异及Ensembl Plants数据库比对得到单核苷酸多态性(SNP)位点,开发与小麦SOD活性密切相关的KASP标记,并通过287份来自国内外冬小麦品种(系)SOD活性与基因型间的相关性分析进行标记的实用性验证。利用6对特异性引物扩增中国春品种TaSOD-B1基因片段,拼接得到5B染色体上的TaSOD-B1基因,基因全长为6 491 bp,包含1 650 bp的开放阅读框(ORF),共编码549个氨基酸,预测分子质量为60.80 ku,由12个外显子及11个内含子构成,内含子符合典型的GT-AG结构。基于TaSOD-B1基因第1外显子的第44碱基处经测序验证确实存在的差异位点开发KASP标记,检测结果表明,等位变异类型为TaSOD-B1a的基因型为AA,与高SOD活性相关,用荧光基因FAM(显示为蓝色)标记;等位变异类型为TaSOD-B1b的基因型为GG,与低SOD活性相关,用荧光基因HEX标记(显示为红色)。对287份国内外冬小麦品种(系)进行检测发现,不同基因型的SOD活性差异达到显著水平。基于TaSOD-B1序列成功开发出1组与SOD活性相关,并可用于SOD活性遗传改良的KASP标记。

探究棉花GhERF14基因与尖孢镰刀菌致病力的关系,解析尖孢镰刀菌致病分子机制,初步探究棉花GhERF14基因对枯萎病的响应及对相关抗病基因的调控作用,为培育抗枯萎病的棉花新品种提供一定的理论依据。利用基因克隆、病毒诱导基因沉默(VIGS)构建了GhERF14 基因非保守结构域干扰载体pTRV2-GhERF14,通过实时荧光定量(qRT-PCR)技术和VIGS技术,研究枯萎病菌胁迫和激素处理后,GhERF14和下游与木质素(Lignin)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)相关基因,抗氧化酶基因及病程相关蛋白(PR)基因的表达特征,分析其在棉花抗病过程中的作用,表明抑制GhERF14基因的表达可显著降低茉莉酸、水杨酸以及乙烯合成及信号通路相关基因的表达。利用VIGS 技术将 GhERF14 基因沉默后,棉株对枯萎病菌更敏感,表明GhERF14在尖孢镰刀菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。

为了深入挖掘稻曲病菌真菌病毒的多样性,以从海南省患病水稻样本中分离到的1株稻曲病菌异常菌株Uv263为试验材料,鉴定该菌株中潜在的真菌病毒,解析真菌病毒基因组结构与功能的关系。结果表明,Uv263菌株被1种新型真菌病毒侵染,命名为Ustilaginoidea virens RNA virus 7(UvRv7)。UvRV7为双链RNA病毒,全长5 082 bp,GC含量为60.29%。UvRV7编码的开放阅读框1编码外壳蛋白(CP),开放阅读框2编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。BlastP比对表明,UvRV7的RdRP氨基酸序列与病毒Thelebolus microsporus totivirus 1的RdRP氨基酸序列的相似性最高,为48.49%。基于UvRV7的RdRP氨基酸序列的多重比对结果表明,UvRV7的RdRP序列共包含8个保守基序,其中在第Ⅵ个基序中鉴定到1个RdRP保守结构域中最典型的GDD基序。系统发育分析表明,UvRV7与Thelebolus microsporus totivirus 1的亲缘关系最近,并且与单分体病毒科中维多利亚病毒属的典型成员形成了1个进化分支。基因组特征和进化分析结果均表明,UvRV7是维多利亚病毒属中一个新发现的真菌病毒种类。透射电镜观察表明,UvRV7形成1个约45 nm的球状病毒粒子。水平传播和垂直传播试验也表明,UvRV7可以通过分生孢子高效垂直传播,并且在营养体亲和的菌株间高效水平传播。综上所述,阐明了稻曲病菌中新报道的单分体病毒UvRV7的全基因组结构特征及其进化关系。

为了解魔芋感染白绢病后内源激素与相关基因表达量的变化,进而揭示魔芋参与对白绢病响应的主要激素通路,采用液相色谱串联质谱对3月龄珠芽魔芋感染白绢病0,1,3,6 d 的内源激素含量进行测定,并利用实时荧光定量PCR技术对脱落酸、茉莉酸和水杨酸通路基因表达水平进行分析。结果表明: 感染白绢病后会导致魔芋多种内源激素含量发生变化,随着感染白绢病时间的延长,其中生长素类代谢物吲哚-3-乙酸含量呈先升高后下降的趋势,而吲哚-3-丁酸含量呈下降的趋势;反式玉米素含量则显著下降;脱落酸的含量呈先升高后下降的趋势;茉莉酸类代谢物含量和水杨酸类代谢物的含量均显著高于对照组。魔芋感染白绢病1,3,6 d茉莉酸含量分别为对照组的2.31,2.31,5.08倍,水杨酸含量分别为对照组的5.53,4.60,7.38倍。脱落酸、茉莉酸和水杨酸代谢通路相关的8个基因均被激活,表达量显著提高。感染白绢病后打破了魔芋内源激素稳态,激活了魔芋茉莉酸、水杨酸及脱落酸激素通路相关基因的表达,茉莉酸和水杨酸通路在魔芋对白绢病抗性胁迫中可能具有重要的作用。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)是一种转录后基因沉默技术,广泛应用于植物基因功能研究。然而,到目前为止,国内关于建立甘蓝VIGS基因沉默体系的报道较少。旨在甘蓝上建立以八氢番茄红素脱氢酶基因(Phytoene desaturase,PDS)作为有效视觉指示基因、病毒载体PCVA/PCVB介导的基因沉默体系。以甘蓝、大白菜和萝卜为植物材料,通过构建PCVA-PDS载体,对甘蓝PDS进行沉默。通过构建PCVA/PCVB-PDS-GFP转化农杆菌,并采用注射法侵染甘蓝和烟草叶片下表皮细胞、真空负压侵染甘蓝幼苗,结合实时荧光定量PCR技术,研究病毒介导的基因沉默体系在甘蓝中的适用性,并将该体系应用于另外2个具有代表性的十字花科作物—大白菜和萝卜。结果表明,载体PCVA/PCVB-PDS-GFP转化的农杆菌侵染甘蓝及烟草叶片细胞后,细胞膜可以观察到荧光出现;通过真空负压侵染甘蓝幼苗14 d后,新生叶片出现光漂白现象,并呈现范围逐渐扩大的趋势;实时荧光定量PCR分析显示,PDS同源基因在试验组中的相对表达量较对照组分别下降3.2,1.7倍;侵染大白菜和萝卜幼苗后,观察到大白菜和萝卜的叶脉及部分叶片出现白化现象,同时伴随一定程度的叶面卷曲。综上所述,通过对PDS基因沉默后甘蓝叶片出现光漂白现象,证明病毒介导的基因沉默体系在甘蓝植株中实现了有效的复制和传播,大白菜萝卜叶片出现白化也表明,VIGS系统同样可以应用于其他十字花科作物,进一步扩展了该沉默系统的应用范围。甘蓝VIGS沉默体系的建立,为十字花科作物相关基因功能研究提供了理论基础。

为探究豆伞滑刃线虫与寄主植物互作的分子机制,通过构建豆伞滑刃线虫体前端特异cDNA文库与RACE技术相结合的方法克隆获得1个豆伞滑刃线虫类FMRF酰胺多肽基因Bd-FLP-12,并应用生物信息学方法进行序列分析,应用Southern杂交和半定量RT-PCR方法分别检测基因拷贝数和在不同发育阶段的表达水平。序列分析表明,Bd-FLP-12编码蛋白由90个氨基酸残基组成,其中含有1个信号肽序列和1个FLP-12成熟肽序列,无跨膜结构域,属于分泌型蛋白。根据Southern杂交结果推测,Bd-FLP-12基因在豆伞滑刃线虫基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR结果显示,Bd-FLP-12在豆伞滑刃线虫各龄期均有表达,但在卵期相对比较微弱。综上,首次在豆伞滑刃线虫中克隆获得Bd-FLP-12基因全长序列,解析了该基因的结构、性质和表达特征,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

为探究BnMLP2基因在苎麻抗旱过程中的作用,通过分析苎麻转录组数据,以中苎1号为材料得到了编码苎麻金属硫蛋白的BnMLP2基因。从苎麻转录组数据中筛选并克隆BnMLP2基因,进行生物信息学分析,包括序列比对、结构域预测及亚细胞定位预测。利用荧光定量PCR技术,测定BnMLP2基因在苎麻不同组织中的表达情况,并探究其在干旱胁迫下的表达变化。将BnMLP2基因导入拟南芥中,构建转基因植株。在干旱胁迫条件下,比较转基因拟南芥与野生型拟南芥的表型、生理生化指标差异,以及抗逆相关基因的表达情况。结果表明,苎麻BnMLP2基因开放阅读框全长共243 bp,编码80个氨基酸。BnMLP2与苹果MT或MLP的氨基酸序列亲缘关系最近,同属于金属硫蛋白家族成员;带有PFAM01439结构域,属于Ⅱ类金属硫蛋白;预测定位于细胞质。BnMLP2基因在苎麻各组织中均表达,并且BnMLP2的表达受干旱显著诱导,尤其在茎中的表达量最高。在干旱胁迫下,转BnMLP2拟南芥相较于野生型表现出更强的抗旱能力,具体表现为根长和鲜质量显著增加,表现出更强的抗氧化酶和γ-GCL活性,积累了更多的脯氨酸(Pro)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、植物螯合态(PCs)来调节细胞内的离子稳态,转基因株系丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)的含量显著低于野生型,约为野生型的55%,80%。此外,转基因拟南芥在干旱条件下钠离子和钾离子的含量最高为野生型的4.4,1.4倍。BnMLP2的过表达能诱导3个抗逆相关基因AtMT1a、AtNCED3、AtWRKY40的表达量提高,最高分别是野生型的1.5,1.9,2.8倍。上述结果表明,BnMLP2基因能够提高拟南芥对干旱胁迫的耐受能力。

为了探究NBS-LRR类基因RPM1在茄属植物抗黄萎病中的作用,以茄属中的野生茄-蒜芥茄为材料,在其转录测序的基础上,克隆RPM1基因同源序列,分析该序列编码蛋白的理化性质、分子结构,构建进化树,以及在烟草中进行亚细胞定位,同时检测蒜芥茄不同部位中RPM1基因的相对表达量,以及在接种大丽轮枝菌(黄萎病病原菌的一种)后4个时间点(0,24,48,72 h)的相对表达量。结果发现,在蒜芥茄中RPM1基因(命名为SsRPM1)序列全长2 772 bp,编码 924 个氨基酸。SsRPM1蛋白总分子质量为105.99 ku,是不存在跨膜结构的碱性亲水蛋白,该蛋白主要由α螺旋和无规卷曲构成,包括LRR、NBC和CC 3种结构域,欧白英RPM1蛋白与其亲缘性关系最近;在烟草中的亚细胞定位发现该蛋白位于细胞膜上;SsRPM1基因在蒜芥茄的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,其中茎的相对表达量最高,其次是叶,最后是根。在接种大丽轮枝菌后,总体上看,对照组和接菌处理组的SsRPM1基因表达情况皆呈现先上升后下降的趋势,在24 h最高。与对照组相比,接菌处理组的基因相对表达量较低,暗示蒜芥茄SsRPM1是响应黄萎病胁迫的负调控基因。

旨在从cDNA文库中筛选潜在与番茄褪绿病毒(ToCV)外壳蛋白(CP)互作的蛋白,探究ToCV的侵染机制及CP在侵染过程中的功能,以应对当前越夏、秋延后番茄生产中因番茄褪绿病毒病大肆传播而致使番茄产量和品质严重受影响的状况。以感染ToCV的Moneymaker番茄品种作为试验材料,采用Gateway技术构建感染ToCV的番茄核体系酵母cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP(CP-BD)。以CP为诱饵蛋白,通过核体系酵母文库筛选出上百种参与多种生理过程的潜在互作蛋白,并进一步通过一对一的酵母双杂交验证以及NCBI BLAST比对确定与ToCV CP互作的相关蛋白。构建了核体系酵母文库,初级文库总克隆数为1.60×10⁷,重组率达100%,平均插入片段长度超过1 000 bp;次级文库总克隆数同样为1.60×10⁷,重组率为100%,平均插入片段长度大于1 000 bp,达到质量标准,满足后续酵母杂交试验的条件。由文库筛选得到的ToCV CP互作蛋白涵盖了细胞过程、生物调节、细胞物质运输等类别,其中在病毒复制和运输、侵染宿主细胞以及调节宿主细胞的代谢和细胞周期等生物过程相关的蛋白数量较多。此外,还涉及蛋白质结合、核酸结合、水解酶活性等相关蛋白,其中RNA酶最为丰富,在病毒侵染过程中发挥重要作用。最终确定了HSPs、DnaJ与TCPs等30种与ToCV CP互作的蛋白,为后续深入研究ToCV的侵染机制及CP在侵染过程中的功能奠定了良好基础。

为系统研究果实硬度相关基因,通过基因组重测序BSA方法定位果实硬度关联区间,并根据其对应的参考基因组共线性区段和基因注释信息预测候选基因,为下一步基因克隆奠定基础。以稳定遗传的软肉自交系C18与硬肉自交系LE4杂交,F₂后代的果实硬度分离呈正态分布。在F₂群体中分别选取30株软肉和30株硬肉单株构建极端混合池,对混合池样本和双亲材料分别开展30×和10×覆盖度的全基因组重测序。重测序共获得1 891 040个单核苷酸多态性(SNPs)标记及376 603个插入缺失(InDels)标记,用于果实硬度性状的全基因组定位。BSA定位峰值位于茄子第6号染色体,从72 610 411到75 329 951 bp,共计2.71 Mb。根据通路富集和基因功能注释,筛选到候选基因Smechr0601726.1 和Smechr0601735.1。综上,通过基因组重测序BSA分析可知,茄子果实硬度可能由2个重要的候选基因进行调控,Smechr0601726.1编码多聚半乳糖醛酸酶基因,与果实硬度直接相关;Smechr0601735.1与抗坏血酸和阿糖二酸代谢密切相关,编码抗坏血酸过氧化物酶,与果实发育和硬度形成有关,可以延缓果实软化。

花青素合酶(ANS)是植物花青素合成过程中的关键酶,可以将无色的花色苷催化成红色、橙色、蓝色等不同颜色的花青素。为了探究ANS基因调控菊苣叶色的分子机制,首先对该基因进行生物信息学分析,随后选取红色结球型菊苣(印地欧)和绿色菊苣(普那)为材料,克隆得到菊苣ANS基因(CiANS),并对该基因在这2个材料中的氨基酸序列及蛋白结构进行了差异分析,最后对ANS基因的组织特异表达和蛋白的亚细胞定位进行了检测,并对ANS蛋白进行了原核表达。结果显示,CiANS与莴苣及栽培菊苣的ANS亲缘关系最近,Motif分析发现,CiANS蛋白基序在不同植物中均较为保守。2种菊苣中ANS的克隆结果表明,ANS基因全长均为1 068 bp,编码355个氨基酸,具有9个差异氨基酸,但在预测的三级结构上并未表现出明显的差异。qRT-PCR结果显示,CiANS基因在不同组织中均有表达,但在叶片中表达量最高,并且红色的结球菊苣中CiANS基因的表达水平显著高于绿色的普那菊苣。亚细胞定位结果显示,CiANS蛋白定位于细胞质和细胞核中。CiANS蛋白在原核载体上诱导表达后大小共为45 ku,与预期蛋白大小一致。综上所述,菊苣叶色差异的形成很可能与ANS基因的表达量差异有关,研究结果为解析菊苣叶色分子调控网络及花青素代谢遗传改良提供了理论依据。

低温是影响山茶在我国北方分布的主要因素,为进一步扩大山茶的分布范围,提升北方园林植物的多样性,以山茶科山茶属植物耐冬山茶岛城春早的叶片为材料,通过Gateway重组技术构建酵母文库,获得的初级文库总克隆数为1.44×10⁷ cfu,次级文库总克隆数为1.12×10⁷ cfu,重组阳性率为100%,酵母文库滴度为1.00×10⁸ cfu/mL,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准。利用双酶切同源重组方式构建诱饵载体pGBKT7-CjCBF1,其在酵母细胞中无毒性及自激活活性。使用质粒共转法进行筛库,获得46个与CjCBF1相互作用的候选蛋白,功能涉及植物生长发育、开花结实及响应胁迫等多个方面,选取CjRAV1作为候选蛋白。参考耐冬山茶转录组数据库和茶树基因组数据库设计引物,克隆得到CjRAV1基因,该基因CDS全长为1 023 bp。生物信息学分析结果显示,该基因编码341个氨基酸,相对分子质量为37.99 ku,蛋白质等电点9.10,不稳定指数34.74,脂肪指数76.60。选取与CjRAV1同源性较近的物种进行氨基酸序列比对并构建系统发育树,发现其与狭叶油茶、君迁子以及中华猕猴桃亲缘关系较近。为了降低筛库的假阳性概率,构建pGADT7-CjRAV1载体,与pGBKT7-CjCBF1进行点对点验证,证实二者之间存在互作关系,为后续深入研究耐冬山茶低温应答分子机制奠定基础。

植物钠氢反转运蛋白(NHX,Na⁺/H⁺ antiporter)在植物钠钾离子平衡、细胞pH值调节中起重要的作用。为探究黑麦耐盐性与NHX的关系,通过生物信息学流程对黑麦的NHX基因进行鉴定与分析,结合RT-qPCR技术对ScNHXs在盐胁迫下的表达模式进行检测,为探究NHX基因在黑麦中的潜在功能以及黑麦耐盐基因挖掘等研究提供参考信息。共鉴定获得10个黑麦NHX基因家族成员(ScNHX1~ScNHX10),系统进化树分析表明,其可分为Vac和Endo 2个亚家族,分别包含4,6个基因。其编码蛋白理化性质分析表明,分子质量为27.92~59.72 ku,氨基酸数目为253~546 aa,等电点为5.17~8.81,大多数蛋白属于酸性蛋白,均未预测到信号肽存在但均具有跨膜结构,亚细胞定位预测ScNHXs定位于质膜和液泡中。空间结构预测显示,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。基因结构和motif分析发现,ScNHXs的外显子数为13~24,且均具有保守的Na⁺/H⁺交换结构域。此外,顺式作用元件分析表明,ScNHXs启动子区域中均发现众多与激素响应以及非生物胁迫响应等生物过程相关的元件。黑麦转录组数据分析发现,在黑麦的不同组织中ScNHXs表达模式存在明显差异。RT-qPCR分析表明,ScNHXs对不同浓度NaCl胁迫有不同程度的响应,并且在较长时间内能够持续响应盐胁迫。综上所述,ScNHXs可能参与黑麦对盐胁迫的生物调节相关过程。

RNA聚合酶Ⅱ相关因子Paf1(RNA polymerase Ⅱ associated factor 1)复合物是由6个亚基组成的真核生物重要的转录调控因子,其对特定基因的表达调控作用与植物的生长、发育和环境信号响应等生命活动密切相关。为探究小麦Paf1对逆境胁迫的响应特征,采用同源序列比对方法鉴定小麦的各Paf1亚基基因,通过mCherry融合蛋白的过表达和荧光显微观察鉴定各亚基蛋白的亚细胞定位,使用qRT-PCR方法分析各亚基基因对不同逆境胁迫的表达响应。结果表明,小麦Paf1的亚基TaVIP3、TaVIP4、TaVIP5、TaVIP6和TaPHP均由1套部分同源基因编码,其余1个亚基TaVIP2则由2套部分同源基因编码。植物VIP2的N端含有1个长度可变的富含脯氨酸残基区段,小麦的TaVIP2 还特有1个富含谷氨酰胺残基区段。TaVIP2、TaVIP4、TaVIP5和TaVIP6均为细胞核蛋白,而TaVIP3和TaPHP蛋白则可同时分布于细胞质和细胞核。各亚基基因在不同组织中的组成型表达差异模式相似,在叶片中的表达统一受高温胁迫的上调和高盐、干旱胁迫的下调。综上所述,小麦响应逆境胁迫的反应涉及对转录调控因子Paf1亚基基因表达水平的调节。

为探究花椰菜抗病品种与感病品种在接种黑腐病菌后的转录组差异,挖掘与花椰菜抗黑腐病相关的基因,以花椰菜感病品种Y1-2和抗病品种EC-247为研究对象,分别提取接种黑腐病菌0,1,3,5 d的花椰菜叶片总RNA,利用Illumina RNA-Seq测序平台进行高通量无参转录组测序,采用实时荧光定量PCR技术对部分差异表达基因进行验证,筛选抗病相关的差异基因并对其表达量进行分析。结果显示,4个时间点与感病品种相比,抗病品种共有6 355个基因表现出显著差异;KEGG富集分析发现,在这些差异表达基因富集通路中,与植物抗病性紧密相关的通路受到关注,其中47个基因与植物-病原菌互作相关,61个基因参与植物激素信号传导途径;对这些相关基因的表达量进行聚类分析发现,植物-病原菌互作途径中1个CDPK基因、4个CML基因、1个PTK基因、1个CaM基因、1个RLK基因和1个SGT1基因,植物激素信号传导途径中3个生长素响应蛋白基因、1个TIFY基因、1个吲哚-3-乙酸酰胺合成酶基因、2个油菜素唑抗性蛋白基因和1个Shaggy相关的蛋白激酶zeta基因,在抗病品种中的表达量显著高于感病品种,并且抗感品种不同时间点的表达模式表明其积极响应病原菌侵染。综上,这些差异基因可能与花椰菜抗病相关,为花椰菜抗病分子育种提供了重要的基因资源和科学依据。

前期转录组学分析发现,ZmRAV1为玉米响应干旱胁迫的候选基因,为了深入研究该基因的功能,克隆了ZmRAV1基因,应用生物信息学分析了ZmRAV1的编码序列,并在拟南芥中过表达该基因,通过干旱条件下过表达拟南芥株系表型、生理生化指标的测定验证其功能。结果表明:ZmRAV1基因全长1 176 bp,共编码389个氨基酸,二级结构中无规则卷曲占比最多,是一种不含信号肽、非跨膜的亲水性蛋白。亚细胞定位显示,该基因编码蛋白位于细胞核。ZmRAV1基因在不同物种间具有较高的保守性。从系统发育树上看,ZmRAV1与五节芒同源基因亲缘关系最强,同源性较高。干旱胁迫处理后,萌发期过表达拟南芥株系的根长显著高于野生型(WT)拟南芥,幼苗期野生型经过干旱胁迫后出现枯萎甚至死亡,存活率低于过表达株系,且干旱处理后ZmRAV1过表达株系过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性均高于野生型,表明过表达ZmRAV1基因可提高拟南芥对干旱胁迫的抗性。综上所述,通过ZmRAV1基因编码序列的生物信息学分析以及转基因拟南芥株系的生理生化指标测定明确了ZmRAV1在响应干旱胁迫的过程中发挥正向调控的作用。

为进一步了解光合作用关键基因的作用,获得了玉米光合作用暗反应限速酶编码基因ZmC₄NADP-ME的功能缺失突变体(zmC₄nadp-me)。通过构建不同物种同源基因的进化树,表明ZmC₄NADP-ME及其同源基因在大多数植物中都是以多拷贝的形式存在,且不同同源基因间的表达模式不同。对zmC₄nadp-me的表型分析发现,与野生型相比,zmC₄nadp-me整株呈黄绿色,光照条件下,苗期叶片很快干枯死亡。对zmC₄nadp-me叶片的叶绿素荧光分析发现,Y(Ⅱ)及电子传递速率ETR(Ⅱ)显著降低,Y(NPQ)变化较小;但Y(NO)值显著升高;对zmC₄nadp-me的PS Ⅰ吸收能力(P700)进行测定后发现,zmC₄nadp-me电子传递速率ETR(Ⅰ)和实际光电子效率Y(Ⅰ)均出现了大幅下降,并且伴随着光照强度的增强,差距越来越显著;光照强度小于870 μmol/(m²·s)时,zmC₄nadp-me的Y(ND)大于对照,当光照强度大于227 μmol/(m²·s),zmC₄nadp-me的Y(NA)也开始逐渐大于WT。以上结果表明,ZmC₄NADP-ME对植物生长发育是必需的,当该基因被破坏后,PSⅡ遭到了严重胁迫,而且在任何光照强度下,植株都无法通过提高Y(NPQ)来缓解这种抑制。同时,说明当光照低于一定强度时,来自PSⅠ电子供体侧的抑制可能是造成PSⅠ抑制的原因之一,而随着光照的增强,PSⅠ电子受体侧的抑制逐渐成为抑制PSⅠ的重要因素。

甘蓝枯萎病是由尖孢镰刀菌黏团专化型(FOC)引起的土传真菌病害,严重影响甘蓝产量和品质。为了明确该病原菌中转录因子SNT2的生物学功能,利用同源重组和原生质体转化技术,成功获得了尖孢镰刀菌中SNT2基因敲除突变体ΔSNT2,并对其表型和致病力进行了分析。结果表明:尖孢镰刀菌中SNT2编码1 529个氨基酸,具有与DNA结合的SANT结构域,蛋白归属亲水性蛋白质。与野生型菌株相比,ΔSNT2突变体菌丝生长速率降低且分隔明显增加,分生孢子产孢量显著下降。基于外源胁迫结果显示,ΔSNT2在1 mol/L 山梨醇的渗透压胁迫中表现不敏感,但对0.1% H₂O₂、2 mol/L NaCl和0.05% 刚果红(CR)的氧胁迫、盐胁迫和细胞壁胁迫的耐受性降低,同时致病力测定结果表明,接种ΔSNT2突变体的病情指数显著低于接种野生型,SNT2的缺失导致尖孢镰刀菌致病力显著下降。综上,转录因子SNT2在病原菌与寄主互作过程中对于维持细胞壁的完整性具有重要作用,同时参与调控尖孢镰刀菌的生长发育和致病力。

为加速粉果番茄新品种选育,利用CRISPR/Cas9技术编辑SlMYB12基因快速创制粉果番茄新种质。在番茄红色果实调控基因SlMYB12的第一个外显子区域选取2个片段作为靶序列构建CRISPR/Cas9双元表达载体,以红果番茄R18-10C为试验材料,通过农杆菌介导的叶盘转化法进行遗传转化,利用特异引物筛选无转基因成分的纯合突变体植株,并对其相关农艺性状和果实营养品质进行调查分析。经测序检测发现共获得了3种不同变异类型的纯合突变体,均属于碱基缺失导致的移码突变。与野生型红果番茄相比,SlMYB12基因编辑的突变体植株生长正常,植株高度、单果质量、单株产量、果实可溶性固形物含量、番茄红素含量等性状无显著差异,但其成熟果实表现为粉色,果皮中柚皮素查尔酮含量显著降低。综上所述,利用CRISPR/Cas9技术成功编辑番茄MYB12基因,获得了稳定遗传的粉果番茄新种质。

PHR1是平衡植物抗病性与低磷胁迫抗性的关键因子。为研究马铃薯StPHR1基因的性质和功能,探明StPHR1在马铃薯抵抗早疫病菌侵染过程中的作用。以马铃薯为材料,采用PCR技术克隆得到了马铃薯StPHR1基因CDS序列,利用生物信息学软件分析预测StPHR1的结构、理化性质和亲缘关系,随后利用qRT-PCR技术分析StPHR1在早疫病菌侵染马铃薯时和不同激素处理下的表达量,并通过激光共聚焦扫描显微技术进行了蛋白质亚细胞定位分析。结果表明:StPHR1基因CDS全长为1 353 bp,编码450个氨基酸。蛋白分子式为C₂₁₄₇H₃₃₉₉N₅₉₅O₇₁₁S₁₈,分子质量为49.51 ku,理论等电点为5.07,编码亲水性不稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构,二级结构主要由无规则卷曲和α螺旋组成。系统进化树分析发现,StPHR1蛋白与拟南芥的亲缘关系最近;保守结构域分析发现,StPHR1蛋白和其他PHR1一样,在其蛋白C末端同时具有MYB-CC和MYB保守结构域。相对表达量分析发现,StPHR1被茄链格孢和水杨酸显著诱导表达,推测StPHR1可能在茄链格孢侵染马铃薯和水杨酸响应方面起重要作用;亚细胞定位显示,StPHR1蛋白定位于细胞核中。推测StPHR1可能通过其MYB转录因子活性和响应水杨酸参与调控马铃薯对茄链格孢菌的抗性。

西葫芦的裸仁种子在籽用西葫芦的加工中具有很大的天然优势。为探究西葫芦种子无壳性状的遗传机制,以西葫芦高代自交系种子有壳17pu10(P₁)和种子无壳17pu08(P₂)为亲本,构建F₁(P₁×P₂)、F₂和BC₁群体,对后代群体的西葫芦种子性状进行鉴定。结果发现,后代群体的西葫芦有壳种子与无壳种子的数目比例符合3∶1分离比,表明西葫芦种子无壳性状受到单基因调控,且种子无壳基因表现为隐性。利用籽用西葫芦BC₁群体对无壳基因进行初步定位,结果表明,籽用西葫芦无壳基因定位于标记InDel3157329和InDel3724121之间,遗传距离分别为1.4,2.6 cM,该区间物理距离为0.6 Mb。对该区间内的24个基因进行注释和功能分析发现,有4个基因直接或间接参与细胞壁、纤维素和木质素的生物合成;进一步分析这4个基因表达量的差异,发现只有Cp4.1LG12g04350、Cp4.1LG12g04370在种子发育时期表达量存在显著差异。由此推测,Cp4.1LG12g04350或Cp4.1LG12g04370为控制无壳性状的候选基因。此外,还开发出与无壳基因连锁的InDel标记,可作为西葫芦无壳性状鉴定的标记,以加快优质西葫芦种子无壳品种的选育。

黄瓜白粉病是危害黄瓜生产的主要病害之一,制约了黄瓜的安全生产。定位黄瓜抗白粉病相关基因,有助于理解黄瓜对白粉病抗性的遗传规律和分子机制,也为抗病育种提供了多样化的基因资源。以黄瓜抗病自交系QK和感病自交系QG为亲本,构建了QK×QG的 F₁、F₂ 群体。采用极端性状混池重测序(BSA-seq)的方法对黄瓜白粉病抗性基因进行初步定位,结合转录组数据和基因注释信息对抗病表型关联区间进行缩短,发掘序列变异,筛选关键基因。人工接种结果显示:F₁ 植株全部表现感病,说明白粉病杭性可能由隐性基因控制;F₂群体表现出从抗病到感病的连续正态分布。利用BSA-seq、SNP-Index 方法和QTG-seq法,分析结果的交集为5号染色体的19—21 Mb区段,该区段共有77个注释基因在样本间存在SNP差异,其中非同义突变共有33个。转录组测序(RNA-seq)结果显示,感病材料中共有309个上调基因,697个下调基因。在5号染色体的候选区段内有13个基因的表达量在接病后差异显著,基于差异表达基因和BSA分析结果将该区段内的候选基因缩减为3个,其中仅LOC101207011基因内检测到SNP突变。候选基因LOC101207011是由第656位的Val突变为了Leu,实时荧光PCR也验证该基因与黄瓜抗白粉病具有连锁关系。

为了解PsbS蛋白在烟草中的表达特征,从烟草品种K326的cDNA中克隆了NtPsbS基因全长序列,利用DNAMAN软件对水稻、番茄、大豆等7种作物PsbS蛋白的氨基酸序列与NtPsbS蛋白的氨基酸序列进行比对,并使用MEGA 11软件采用邻接法建立系统发育树对其进行遗传进化分析;利用qRT-PCR技术检测烟草不同生育时期NtPsbS基因的组织表达水平;构建pS1300-PsbS-GFP植物表达载体研究其成熟蛋白亚细胞定位特性;对烟草品种K326进行各类非生物胁迫处理,研究该基因在非生物胁迫条件下的表达模式。结果表明,NtPsbS基因全长825 bp,编码274个氨基酸;NtPsbS蛋白与番茄SlPsbS蛋白相似性最高,达到91%;NtPsbS在旺长期和成熟期烟草品种K326的叶、根、茎、种子等部位均有表达,在叶片中表达量最高;成熟NtPsbS蛋白定位于烟草叶绿体内;NtPsbS在盐胁迫、冷胁迫及脱落酸ABA处理下表达量均显著升高。综上所述,NtPsbS基因在不同生育时期的烟草叶片中表达量最高,对盐胁迫、冷胁迫及脱落酸ABA处理均有响应,说明该基因可能参与烟草体内抗盐、抗冷胁迫及ABA代谢通路,为后续开展NtPsbS基因的功能特性解析提供了参考。

为探究广藿香Trihelix家族基因PatASIL2的序列特征、亚细胞定位及表达模式,以广藿香转录组获得的ASIL2基因序列设计特异性引物,以广藿香cDNA为模板,克隆PatASIL2基因,随后对其进行生物信息学分析;构建PatASIL2-EGFP融合蛋白表达载体并转化拟南芥原生质体,检测PatASIL2的亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PatASIL2基因在广藿香不同组织、外源茉莉酸甲酯(MeJA)喷施及非生物胁迫(盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫)下的表达情况。结果显示,PatASIL2含长度为1 035 bp的开放阅读框,编码344个氨基酸。PatASIL2不具有跨膜结构和信号肽,属于不稳定的亲水蛋白,含有41个丝氨酸磷酸化位点和1个Myb_DNA-bind_4保守结构域。系统进化分析显示,PatASIL2归类到Trihelix转录因子家族的SIP1亚家族,与芝麻SiASIL2同源性较高。亚细胞定位结果表明,PatASIL2为细胞核定位蛋白。qRT-PCR结果表明,PatASIL2在广藿香的嫩叶、成熟叶、老叶、根和茎中都有表达,尤其在老叶中的表达量最高;在MeJA处理后,PatASIL2基因的表达量在12~24 h显著升高;盐胁迫下,PatASIL2基因的表达量在3~24 h显著升高;在干旱胁迫下,PatASIL2基因的表达量在24 h显著升高;在冷胁迫下,PatASIL2基因在12 h表达量显著升高。

捕光叶绿素a/b结合蛋白在植物光合进程及非生物胁迫响应中发挥着重要的作用。为了研究陆地棉GhLhcb2A1基因特征、表达特性以及在低温和干旱响应中的功能,以冀棉262叶片cDNA为模板进行PCR扩增,获得了GhLhcb2A1基因的CDS全长,通过生物信息学分析了基因及其编码蛋白的基本特征,利用qRT-PCR技术检测了基因的组织表达特性以及低温和干旱响应表达模式,采用病毒诱导的基因沉默技术验证了GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中的功能。研究结果表明,GhLhcb2A1基因CDS全长为798 bp,编码265个氨基酸。GhLhcb2A1在叶片中高表达,在低温和干旱处理的叶片和根中显著上调表达,并在低温和干旱处理3 h的叶片中达到最大值,分别是对照叶片中的17.42,30.03倍,在低温处理6 h和干旱处理12 h的根中达到最大值,分别是对照根中的11.65,65.04倍。亚细胞定位结果表明,GhLhcb2A1蛋白在细胞叶绿体中表达。GhLhcb2A1基因沉默植株与对照植株相比,低温和干旱处理造成的植株失水干枯等表型更严重,叶片积累的丙二醛含量显著升高,脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性则显著降低,说明GhLhcb2A1基因沉默植株对低温和干旱胁迫的抵抗力降低。以上研究表明,GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中发挥正调控的作用。

通过克隆尖孢镰刀菌亚麻专化型FolSid1基因,确定该基因在镰刀菌中的生物学功能以及蛋白定位。通过与尖孢镰刀菌近缘菌同源比对,克隆得到FolSid1的基因序列,基于同源重组原理,使用Split Marker法构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒,通过PEG介导法转入野生型原生质体中,获得基因敲除突变体(ΔFolSid1),对突变菌株做表型鉴定和致病力分析,分析该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。构建含有FolSid1基因的绿色荧光表达载体pZESH1,对FolSid1-EGFP融合蛋白进行亚细胞定位。结果表明,FolSid1基因序列全长5 392 bp,含有3个内含子。与野生型和外插入突变体相比,尽管敲除突变体ΔFolSid1分生孢子形态和大小没有不同,但产量显著下降;形态学观察发现,敲除突变体的生长速度明显减慢;亚麻试验显示,缺失突变体的致病力明显降低;基因的亚细胞定位试验显示,FolSid1蛋白主要定位于菌丝细胞的细胞膜上。FolSid1基因能够调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的菌丝营养生长、分生孢子发生且对亚麻具有致病性。

大豆P34蛋白主要存在于种子中,其上游启动子很可能具有调控下游基因在种子中高表达的特性。为进一步研究大豆P34蛋白基因的组织表达模式及其启动子的调控活性,通过qRT-PCR方法检测大豆P34蛋白基因在大豆不同组织中的表达情况;克隆大豆P34蛋白基因5'端上游序列(GmP34P),生物信息学分析其转录起始位点和顺式元件;构建表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,检测转基因烟草中GUS的表达。结果表明,P34蛋白基因在大豆种子中的表达量极显著高于根、茎、叶和花的表达量;克隆获得GmP34P序列长度为1 380 bp,预测分析表明,该序列的转录起始位点为第1 342位上的碱基A,序列中含有多种与种子高表达相关的顺式作用元件,如RY element、Skn-1 motif、2S seed protbanapa等;获得含有GmP34P启动子驱动GUS基因的植物表达载体pCAM-GmP34P;通过潮霉素、PCR及RT-PCR筛选阳性转基因植株;对pCAM-GmP34P阳性转基因烟草植株,进行qRT-PCR检测,结果显示,相对于其他组织,GUS基因在转基因烟草种子中的表达量达到极显著差异;GUS组织化学染色结果显示,GmP34P启动子能够调控下游GUS基因在种子中高表达。

WRKY是植物特有的一类转录因子,在非生物胁迫应答、种子休眠与发芽、生长发育等方面起重要作用。为揭示大豆WRKY转录因子家族中GmWRKY44基因的功能和潜在的分子机制,对大豆Williams 82中GmWRKY44基因进行了生物信息学分析及功能验证。结果表明,GmWRKY44基因CDS全长1 077 bp,编码358个氨基酸;结构预测与进化分析结果显示,其编码的蛋白质二级结构由23.46% α-螺旋、4.75% β-折叠、58.94%无规则卷曲和12.85%延伸链构成,三级结构与二级结构相统一;含一个保守的WRKY结构域,锌指结构为C₂H₂类型,属WRKY IIc亚家族;该基因是拟南芥AtWRKY71的同源基因,相似度为35.56%,两者具有相似的基因结构。RT-qPCR分析表明,GmWRKY44响应盐胁迫,表达量先下降后上升。在盐胁迫下,野生型(Col-0)和GmWRKY44过表达拟南芥株系的萌发率和根长均受到一定程度抑制,但GmWRKY44过表达株系明显优于Col-0。另外,在盐处理后,GmWRKY44过表达株系生长受抑制程度低于Col-0。生理指标分析发现,在盐胁迫下,GmWRKY44过表达株系的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于Col-0,而丙二醛(MDA)含量显著低于Col-0。以上表明,GmWRKY44过表达可以提高转基因拟南芥的耐盐性。

为了探索花生高油育种新途径,建立一种直接育成高油花生种质的新方法,采用离体诱变育种技术进行花生高油新种质创制。以吉花9号胚小叶为诱变试材,吉花9号和吉花54为对照试材,以博来霉素作为诱变剂。胚小叶消毒后放置在梯度诱变培养基中,筛选博来霉素诱变半致死浓度,体胚萌发成苗后以无菌花生苗作为砧木采用插接法进行无菌嫁接,嫁接成苗后移栽至田间。对2个已知调控花生脂肪合成基因WRI1进行生物信息学分析,并通过籽粒中WRI1基因表达和诱变植株粗脂肪含量相关性进行试验可行性验证。当博来霉素质量浓度在3 mg/L时,诱变效果最佳。吉花9号突变体IM13-3的粗脂肪含量高于吉花9号(CK₁,试材品种对照)和吉花54(CK₂,高油品种对照)。2个WRI1基因WRI1X2和WRI1X1分别编码366,357个氨基酸,都是不稳定亲水性蛋白。在籽粒中WRI1基因表达量与粗脂肪含量呈显著正相关。率先采用博来霉素作为花生离体诱变诱变剂,通过此离体诱变方法获得吉花9号高油突变体IM13-3,粗脂肪含量为56.64%。测定了高油突变体WRI1基因表达量,与对照品种存在显著差异。证明花生离体诱变方法育种方法可行性。

为探究甘蓝型油菜溶血磷脂酸酰基转移酶2(LPAT2)基因的功能,从甘蓝型油菜中PCR 同源克隆了BnaLPAT2的一个拷贝(A07),将其构建过表达载体p35S∷BnaLPAT2-A07和种子特异表达载体pNapin∷BnaLPAT2-A07,利用农杆菌介导法遗传转化甘蓝型油菜中双6号,通过转化植株的PCR检测,分别获得15株和11株转基因阳性植株。经实时荧光定量(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)检测,过表达T₃油菜多数组织中BnaLPAT2-A07基因的表达量较野生型均有显著提升;而种子特异性表达的T₃油菜各组织中BnaLPAT2-A07基因都集中在种子的发育与成熟期超强表达。索氏抽提法检测到由35S启动子或Napin启动子驱动的BnaLPAT2-A07转基因油菜种子中的含油量较野生型分别提升1.39,2.36百分点。气相色谱法检测转基因油菜的脂肪酸组分结果显示,亚麻酸的含量较野生型分别提升3.13,1.47百分点。研究结果表明,BnaLPAT2-A07基因具有促进甘蓝型油菜种子油脂合成的功能,但BnaLPAT2-A07对亚麻酸特异选择性功能还需进一步验证。

对甜瓜CmPIPs基因家族鉴定和表达模式分析,为进一步探究甜瓜CmPIPs基因家族功能及甜瓜遗传改良提供理论依据和支持。利用TBtools、MEME、MEGA X、Plant-CARE工具对CmPIPs进行生物信息学分析,利用GraphPad Prism 10软件对CmPIP2;7在甜瓜授粉后不同时期中果皮中的表达量以及CmPIPs各成员在不同组织和不同浓度的植物激素处理幼叶中的表达量进行可视化解析。结果显示,CmPIP2;7与CsPIP2;8亲缘关系最近;12个CmPIPs家族成员主要分布在1,3,4,5,9,10,11号染色体上;除CmPIP2;8有3个外显子区,其余成员均有4个外显子区;CmPIPs各成员的启动子区域有多个顺式作用元件,如生长素、赤霉素、脱落酸等激素应答元件;CmPIP2;7在甜瓜的快速生长期以及成熟期的表达量显著上调;CmPIPs各家族成员在甜瓜的不同组织中均有表达;生长素浓度为40.0 μmol/L时,CmPIP2;4表达量显著上调,CmPIP1;1、CmPIP2;1、CmPIP2;2和CmPIP2;3的表达量极显著下调;脱落酸浓度为0.4,4.0,40.0 μmol/L时,CmPIP1;1、CmPIP2;1、CmPIP2;3、CmPIP2;9表达量均显著下调;茉莉酸甲酯浓度为44.640 μmol/L时,CmPIP2;1和CmPIP2;5表达量显著下调,CmPIP2;2、CmPIP2;3、CmPIP2;7、CmPIP2;9表达量显著上调;乙烯利浓度为4.0 mmol/L时,CmPIPs各成员表达量均显著上调。明确了CmPIPs基因家族成员的基因结构、序列特征、进化关系以及共线性关系,对其表达模式进行了解析。

ACA作为Ca²⁺-ATPase的亚家族成员之一,在维持植物细胞内Ca²⁺浓度平衡以及调节植物生长发育响应非生物胁迫等方面发挥着重要的作用。为进一步了解生菜ACA基因家族功能,运用生物信息学方法对生菜ACA基因家族成员进行鉴定与分析。结果表明:在生菜中共鉴定到17个ACA基因,命名为LsACA1~LsACA17;LsACA基因不均匀地分布在8条染色体上;亚细胞定位预测结果表明,LsACA蛋白全部定位于细胞质膜;LsACA基因家族成员之间的内含子数量差异较大(0~32个),LsACA蛋白共鉴定到15个保守结构域,氨基酸数量为21~50个;二级结构占比情况为:α-螺旋>无规则卷曲>延伸链>β-折叠;根据系统发育分析将LsACA蛋白分为5个亚家族Group Ⅰ~Group Ⅴ;根据共线性分析发现,6对基因存在片段复制,其共线性基因对的Ka/Ks均小于1,说明在进化中以纯化选择为主。通过qRT-PCR方法分析了LsACA基因家族成员在不同钙离子浓度处理下的表达模式,结果表明:与对照相比,低钙处理的钙敏感型品种宝石绿中有12个LsACA基因表达量极显著下调,而钙不敏感型品种耶罗有9个LsACA基因表达量极显著上调,1个LsACA基因表达量显著上调。研究鉴定了生菜ACA基因家族成员,并进行了生物学分析,揭示了LsACA基因家族成员的特征。

查尔酮合酶(CHS)是调控植物类黄酮通路早期生物合成的重要结构基因,在植物生长发育和逆境响应中发挥作用。前期通过表达量分析,在马铃薯CHS家族中筛选到花青素生物合成关键基因StCHS4和StCHS5。为进一步探究马铃薯StCHS4和StCHS5在类黄酮和花青素生物合成中的功能,首先利用在线网站分析StCHS4和StCHS5蛋白结构,之后以pRI101双元表达载体为基础,通过同源重组法构建35S∷StCHS4-GFP和35S∷StCHS5-GFP植物过表达载体,并将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株中。利用本氏烟草进行瞬时转化,明确StCHS4和StCHS5蛋白亚细胞定位情况。以红花烟草为试验材料,分别进行瞬时超表达和稳定遗传转化,分析StCHS4和StCHS5基因过表达后总类黄酮和总花青素的含量变化。结果表明:StCHS4和StCHS5蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,StCHS4为不稳定的亲水蛋白,StCHS5为稳定的亲水蛋白。StCHS4和StCHS5分别与辣椒CHS和番茄CHS1亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示,StCHS4和StCHS5蛋白均在细胞质和细胞膜中表达。烟草瞬时超表达中,StCHS4和StCHS5基因在注射3~5 d显著促进花青素累积。分别获得3个阳性烟草转基因株系,与野生型相比,转基因植株中StCHS4和StCHS5显著高表达,总类黄酮和总花青素含量均高于野生型。StCHS4-OE3和StCHS5-OE1转基因植株中的总类黄酮含量显著提升,StCHS5-OE1和StCHS5-OE2中花青素含量分别提高89%,131%。上述结果表明,StCHS4和StCHS5是马铃薯类黄酮通路中关键CHS基因,过表达可促进花青素与类黄酮生物合成。

DNA损伤会对植物的生长发育造成严重的影响,NBS1是参与损伤修复的重要基因,为研究NBS1与其可变剪切体NBS1-3之间的功能差异。根据NBS1和NBS1-3基因序列分别设计特异性引物,以野生型拟南芥叶片RNA反转录得到的cDNA第一链为模板,克隆NBS1和NBS1-3,对2个基因序列和蛋白质三维结构进行分析。同时,创制了NBS1、NBS1-3过表达株系,获得突变体nbs1纯合株系,并检测NBS1基因在NBS1及NBS1-3过表达植株的相对表达量。为进一步阐明NBS1与可变剪接体NBS1-3之间的功能差异,用0.6 mmol/L甲基黄酸甲酯(MMS)对野生型、nbs1突变体和过表达植株进行处理,观察损伤面积。定量检测结果显示,NBS1基因在NBS1及NBS1-3过表达植株的表达量均高于野生型。根尖PI染色结果表明,0.6 mmol/L MMS处理后,nbs1突变体植株相对损伤面积最大,而NBS1-3过表达植株相对损伤面积最小,其次依次为NBS1过表达植株和野生型。因此,在DNA损伤修复方面,NBS1-3可能比NBS1发挥更大的作用。

为了解析绣球WRKY转录因子家族的成员特征及其在绣球叶斑病应答中的作用,利用生物信息学方法,对绣球无尽夏基因组中的WRKY家族成员进行全基因组鉴定,并系统分析了蛋白质理化特征、基因结构、系统进化、共线性和家族成员在多主棒孢菌侵染下的表达模式。结果表明:绣球全基因组中共鉴定到84个非冗余的HmWRKY成员,均属于亲水性蛋白,在绣球18条染色体上呈现不均匀分布,编码氨基酸112~1 046个;所有成员可分为3个亚组,即Group Ⅰ~Group Ⅲ,均含有WRKYGQK和C2H2组成的DNA结合域;HmWRKY成员的序列长度变化较大,从512 bp到40 338 bp,并且检测到8个存在共线性的基因对,Ka/Ks的比值均小于1,说明HmWRKY家族在进化中趋于纯化选择;同时,18个HmWRKY成员在绣球叶斑病菌侵染后表现出显著差异表达的特性,其中9个上调表达、9个下调表达。以上结果表明,HmWRKY基因在绣球响应叶斑病中可能具有重要作用。

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)作为类黄酮与木质素的主要生物合成酶,与植物黄酮类化合物的形成存在紧密的联系。为了探索甘草4CL基因家族与异甘草素的合成、积累的关系,测定甘草在干旱胁迫后,异甘草素的含量,及甘草4CL基因家族表达特性和生物信息学分析,了解异甘草素积累特性与甘草4CL基因的关系。结果显示,异甘草素主要积累在甘草根中,且干旱胁迫能显著提升甘草根中的异甘草素含量,在聚乙二醇(PEG)胁迫2 h后的含量是对照组(0 h)的3.91倍。干旱胁迫可诱导地下部分中的Gu4CL基因上调,Gu4CL2、Gu4CL4和Gu4CL5经PEG胁迫诱导后表达量较高,而Gu4CL2在PEG胁迫后上调最为明显,Gu4CL2表达与异甘草素含量变化相似。Gu4CL基因的生物信息学分析显示,11个基因都有2个保守的多肽基序BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG),并且11个基因分布在11个Scaffold片段上。启动子顺式作用元件分析发现,Gu4CL2、Gu4CL4和Gu4CL5基因较其他Gu4CL基因包含更多的脱落酸和茉莉酸响应元件。因此,干旱胁迫可能诱导茉莉酸、脱落酸的合成,调控甘草根中Gu4CL2、Gu4CL4和Gu4CL5基因的表达,提升异甘草素的积累。

当前,传统育种手段已经不能完全满足棉花市场及生产的需求,可以利用分子生物技术来加快棉花品种的更新,转录因子为棉花基因功能研究和遗传育种提供了重要的帮助。MYB转录因子家族作为最大的转录因子家族之一,在多种植物中存在,并且在植物的生长发育过程中行使着多种功能。MYB转录因子具有很高的研究价值,在模式植物中的功能已经得到较为深入的研究,但在非模式植物,特别是棉花中的研究仍然较为有限,大多集中在陆地棉中。为进一步了解MYB转录因子,对部分植物及棉花中MYB转录因子的相关研究进展进行了综述,主要涵盖了它们的分类依据、结构特点、进化方式以及在响应生物及非生物胁迫、棉花纤维发育和次生代谢等方面的作用,并对目前已知的棉花MYB转录因子的相关功能进行了分析。通过对这些内容的综述,有助于加深我们对棉花MYB转录因子的了解,为后续研究不同棉种中MYB转录因子以及深入研究它们的功能和机制提供了重要的参考。

为了给姊妹系材料的有效利用提供理论指导,加速小麦安农1687品种的推广,为小麦新品种的遗传改良提供参考。以小麦安农1687及其姊妹系和双亲为材料,通过对小麦材料的田间农艺性状进行表型鉴定和利用55K芯片对小麦材料进行基因型鉴定相结合的方法,同时借助SPSS分析数据和RIdeogram包绘图发现双亲和部分姊妹系组合在穗长这一性状上存在极显著差异,亲本安农1106和西农822、姊妹系系Q6、系8和系105、系133在19条染色体上共存在909个差异SNP位点,5B染色体上包含500个,富集在5B染色体物理位置的63~87 Mb和400~410 Mb区间内。对区间内的候选基因进行克隆测序,发现编码生长素诱导蛋白的2个基因TraesCS5B01G225000和TraesCS5B01G058700的CDS区在双亲和姊妹系组合间分别存在着5个错义突变和2个错义突变,造成了氨基酸的改变,同时基因TraesCS5B01G225000的突变导致密码子变为终止密码子TGA,氨基酸合成终止。因此,推测这2个基因可能对于小麦穗长有着一定的影响。

为研究核桃种质资源涩味的遗传多样性,以4个不同核桃涩味群体共118份种质资源为材料,利用SSR毛细管电泳荧光标记技术进行遗传多样性研究,并构建树状聚类图。结果表明:12对引物共检测到93个等位变异位点,变异范围为2~18,平均每对SSR引物可检测到7.75个等位位点;多态性信息量(PIC)为0.357 9~0.785 2,平均0.541 1。4个群体的多态位点数Np为91、多态位点百分率PPB为97.85%、观测等位基因数Na为1.978 5、有效等位基因数Ne为1.198 5、Shannon's信息指数I为0.209 7、Nei's多样性指数H为0.126 3、总遗传多样性指数Ht为0.126 7、群体内遗传多样性指数Hs为0.122 2,说明4个核桃群体的遗传多样性和变异度不高。群体间遗传分化系数Gst为0.035 5,说明群体内遗传变异占总变异的96.45%。其中稍涩群体多态性位点百分率最大,为72.04%,说明稍涩群体在4个群体中遗传多样性最丰富。UPGMA聚类分析表明,4个群体的遗传相似系数为0.989 8~0.997 1,群体的整体相似系数高,说明这4个群体的遗传距离很近。当相似系数为0.993 4时,可将4个群体分成2组。其中,第1组包括不涩、稍涩和较涩3个群体,剩余涩群体单独为一组。通过计算不同群体93个位点的基因频率,发现12对引物的41个位点可将不同涩味等级的资源区分开。利用SSR分子标记技术对4个核桃群体进行与涩味相关的遗传多样性分析,根据转录组测序结果筛选出12对引物用于SSR分析,共扩增出93个SSR位点,多态位点百分率为97.85%,说明引物的多态性高,适用于核桃的遗传多样性分析,为培育轻涩味的优良品种提供技术指导,可用于后续核桃涩味的遗传多样性及育种研究。

为探究肉桂酸-4-羟化酶(C4H)对金线莲类黄酮含量积累的影响,以金线莲为研究对象,利用硝酸铝显法测定其不同组织的总黄酮含量;基于同源克隆技术和RACE技术从金线莲分离克隆出C4H基因(ArC4H,GenBank登录号ON455229);利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析金线莲不同组织C4H基因表达量。结果表明,金线莲不同组织黄酮类物质含量有显著差异(叶>茎>根),其中叶片的总黄酮含量是根和茎的3倍多;系统进化树分析,发现金线莲与大多数兰科植物的亲缘关系比较接近,ArC4H基因的开放阅读框为1 518 bp,编码505个氨基酸,属于细胞色素P450超家族成员之一,理论分子量为65.17 ku,等电点为9.21,属于亲水蛋白;ArFLS具有序列保守性,在不同组织中均有表达,qRT-PCR分析表明,该基因在茎中表达量最高,根中次之,在叶中表达量极低,且总黄酮含量也有相似的趋势。据此初步确定,该基因为金线莲ArC4H基因。

对多毛番茄全基因组的Dicer-like(DCL)、Argonaute(AGO)和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)基因家族进行生物信息学和表达模式分析,为深入研究DCL、AGO和RDR基因家族在多毛番茄响应非生物胁迫和病毒感染过程中的功能提供参考。以拟南芥DCL、AGO和RDR基因为参考序列,利用本地Perl语言和Pfam、SMART等软件检索多毛番茄LA1777基因组并确定多毛番茄DCL、AGO和RDR基因家族成员。通过ExPASy、GSDS 2.0、MEGA、Tbtools、SWISS-MODEL等工具对多毛番茄DCL、AGO和RDR家族基因进行生物信息学分析。根据非生物胁迫、番茄褪绿病毒(ToCV)处理和实时荧光定量PCR技术分析该类基因的表达模式。从多毛番茄中鉴定得到7个ShDCL、15个ShAGO和6个ShRDR基因,分别分布在第5,7,6条染色体上,其编码的蛋白与其他植物DCL、AGO和RDR结构相似,均含有该家族特有的保守结构域。系统发育分析表明,这些基因被分为4个亚组,与普通番茄之间具有较高的结构和功能相似性。ShDCL2a、ShDCL2c、ShDCL3、ShDCL4、ShAGO1b、ShAGO3、ShAGO4b、ShAGO5、ShAGO7、ShAGO10a、ShAGO10b、ShRDR1、ShRDR2、ShRDR3a、ShRDR6a和ShRDR6b在多种非生物胁迫和ToCV感染后显著上调表达,推测这些基因在非生物胁迫和病毒侵染过程中发挥着重要作用。

大白菜叶球的抱合方式是决定商品器官外观形状、口感和抗逆性的主要性状。为探究大白菜抱合方式形成的内在分子机理,以叠抱和舒心大白菜为试验材料,克隆得到转录因子BrPIF5基因的全长序列,并进行生物信息学分析,构建植物过表达载体以及利用农杆菌介导转化到烟草,获得阳性转化植株,通过qRT-PCR检测了BrPIF5基因在烟草中的表达水平。结果表明,BrPIF5基因编码的蛋白为亲水性蛋白,具有连续且完整的634 bp开放阅读框,蛋白内共含有210个氨基酸,该蛋白由较多α螺旋结构和无规则卷曲构成,其中存在1个AP2/ERF结构域。BrPIF5蛋白与其余9个基因家族成员共含有1个1号保守基序,且位置相较于其他基因家族成员存在差异,位于蛋白序列前端。系统进化树显示,BrPIF5基因与家族内的SoPIF15、BhPIF1、BoPIF4、AtPIF4和BrPIF4家族成员具有较近的进化关系。通过农杆菌介导的遗传转化方法获得过表达BrPIF5烟草株系,烟草阳性转化株表现出叶片向内卷曲,通过qRT-PCR检测发现,该基因在叠抱类型大白菜中表达量高于舒心大白菜,阳性烟草植株的基因表达量高于对照。进一步证明了BrPIF5基因控制大白菜叶片向内卷曲,从而促进叶球叠抱类型的形成。

为明确Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子基因VDAG_04814对大丽轮枝菌的生长发育及致病过程中的作用。利用聚乙二醇介导的同源重组构建VDAG_04814基因敲除突变体。将野生型菌株和突变体菌株分别接种至添加过氧化氢、氯化钠、氯化钾、山梨醇、十二烷基硫酸钠、刚果红的PDA培养基以及铺有无菌玻璃纸的培养基,分析其抗氧化胁迫、盐胁迫、渗透胁迫、细胞壁细胞膜完整性胁迫的水平和菌株穿透能力;测定其致病力,检测马铃薯植株中真菌生物量。经潮霉素筛选和PCR验证,正确的敲除转化子可扩增到上下游各1 500 bp及敲除片段序列全长4 500 bp的DNA条带。ΔVDAG_04814菌株生长速度缓慢、黑色素形成能力降低;在添加过氧化氢、氯化钠、氯化钾的氧化胁迫和盐胁迫培养基上,ΔVDAG_04814相较于野生型菌株受到的抑制率更高;在添加山梨醇的渗透胁迫培养基上,ΔVDAG_04814的生长抑制率显著低于野生型菌株;在添加十二烷基硫酸钠、刚果红的细胞壁细胞膜完整性胁迫培养基中生长并没有受到抑制;在铺有无菌玻璃纸培养基上,ΔVDAG_04814没有菌落长出,而野生型菌株有正常形态的菌落长出;致病力测定表明,ΔVDAG_04814菌株的致萎程度较野生型菌株显著下降,致萎指数为47.22~55.56。综合上述结果,VDAG_04814基因能够调控大丽轮枝菌的生长发育、抗胁迫能力、穿透能力以及对马铃薯的致病力,可为马铃薯黄萎病的防控提供新靶点。

温度胁迫是影响菠菜品质和产量的主要非生物胁迫之一,研究菠菜对温度胁迫响应的分子机制对菠菜抗逆育种具有重要意义。为给菠菜抗冷胁迫、热胁迫机制研究提供理论基础,以菠菜耐冷胁迫自交系D3和耐热自交系M10为试验材料,对其在冷胁迫和热胁迫下的转录组和代谢组进行了分析,以期探讨菠菜抗逆的转录和代谢机制。转录组学分析表明,在冷胁迫和热胁迫下,耐冷自交系D3和耐热自交系M10的差异基因富集最多的途径基本相同。代谢组学分析表明,冷胁迫下在基因与基因组数据库(KEGG)富集通路中共同富集在嘧啶代谢、赖氨酸降解通路中;热胁迫下在KEGG富集通路中共同富集在色氨酸代谢,甲苯降解,各种其他次生代谢物的生物合成,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸的代谢通路中;转录组学和代谢组学联合分析结合基因注释,确定了SpADH(sov2g036390)、SpSHMT(sov1g001130)、SpALDH-1(sov4g007150)为菠菜耐冷胁迫的候选基因,SpALDH-1(sov4g007150)、SpALDH-2(sov1g043320)、SpNPC(sov1g040610)为菠菜耐热胁迫的候选基因,其中,SpALDH-1(sov4g007150)在冷胁迫和热胁迫下都显著表达,可能是菠菜抗逆的相关调控基因。

为探讨西瓜钙依赖蛋白激酶(CDPK)在嫁接以及非生物胁迫环境下的功能,利用RT-PCR技术从西瓜嫁接苗中克隆了ClCDPK(Cla97C01G019720)基因,对其进行了生物信息学分析。进一步根据ClCDPK序列设计带有Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的特异引物,进行扩增,双酶切后与pCAMBIA1300连接,成功构建目标基因的表达载体pCAMBIA1300-35S-ClCDPK。利用 RT-qPCR 技术,测定ClCDPK在自根苗(ZG)与嫁接苗(JJ)分别遭受盐、干旱胁迫后的基因表达量。结果表明,ClCDPK基因ORF为1 647 bp,编码548个氨基酸。其蛋白存在STKc_CAMK和FRQ1功能结构域,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测该蛋白位于细胞核,对ClCDPK与其他6种植物的CDPK进行进化树分析发现,其与葫芦科甜瓜、南瓜的CDPK亲缘关系较近,蛋白序列同源比对超过92.64%,具有较高的同源性。RT-qPCR表达结果显示,ClCDPK在嫁接苗表达量显著高于自根苗,随着胁迫时间的持续,嫁接苗和自根苗的ClCDPK表达量先升后降,并且同一胁迫处理下,嫁接苗的ClCDPK表达量高于自根苗。试验表明,ClCDPK正响应盐和干旱胁迫,并且嫁接苗抵御胁迫的能力高于自根苗。推测ClCDPK是西瓜响应嫁接的关键因子之一,从而提高了西瓜嫁接苗的抗盐抗旱能力。

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作为参与基础代谢的一类重要酶,在植物细胞代谢、光呼吸和防御活动中起重要作用。为了解西瓜中SHMT基因家族生物信息学功能,探究其在非生物胁迫下基因表达特性,进而为西瓜SHMT基因家族的功能开发以及选育西瓜抗逆基因提供基础。采用生物信息学方法鉴定西瓜SHMT家族成员,进一步利用RT-qPCR技术分析ClSHMTs在不同组织和非生物胁迫下的表达模式。结果显示,在西瓜全基因组中,共鉴定到8个ClSHMTs基因家族成员,该家族成员随机分布在6条染色体上,依次命名为ClSHMT1~ClSHMT8。每个基因家族成员的理化性质,如氨基酸数目、分子量、等电点等存在一定的差异。其编码的氨基酸个数为471~585,分子量为51.87~65.00 ku,等电点为6.57~8.52,均为亲水性蛋白;亚细胞定位预测主要分布于线粒体上。基因结构和蛋白保守基序分析显示,ClSHMTs结构由4~15个外显子以及3~14个内含子组成,且均含有SHMT保守结构域。进一步与黄瓜、小麦等6个物种进行系统进化分析可知,50个SHMTs分3个亚族,Group Ⅰ~Ⅲ。启动子顺式作用元件分析显示,ClSHMTs启动子上均含有大量光响应、植物激素、逆境胁迫等元件。表达模式分析显示,6个ClSHMTs在西瓜不同组织中均有表达,其中,ClSHMT1、ClSHMT4、ClSHMT5、ClSHMT8在叶中表达量显著高于其他组织;在低温、干旱和盐胁迫下,ClSHMTs表达丰度各异,但集中为上调表达。综上,本研究对西瓜SHMT基因家族进行系统性分析和下一步ClSHMTs的生物功能开发提供了基础。

为了探究马铃薯捕光色素结合蛋白基因的功能,对捕光色素结合蛋白基因StCP24(LOC102586836)进行生物信息学分析,并用农杆菌介导法将其转入马铃薯品种东农310中,获得转基因马铃薯株系。在不同光照强度条件下培育无性系转基因株系和对照,测定植株的生长指标、叶片生理指标、荧光参数和基因相对表达量等,通过超微结构观察明确该基因对叶绿体形态的影响。生物信息学分析结果表明,StCP24蛋白为亲水性蛋白,StCP24基因的启动子中包含光响应、防御和应激反应等元件;系统发育分析表明,马铃薯StCP24基因编码的氨基酸与栽培种番茄中StCP24基因编码的氨基酸亲缘关系最近。在不同光照强度处理下,转基因株系的茎粗、叶面积、叶片质量、根长、叶绿素a含量、叶绿素b含量、Fv/Fm、ETR、ETRmax、qP显著高于野生型对照。StCP24基因的过量表达可以使类囊体质粒片层堆叠得更加紧密且堆叠程度更高。综上,StCP24基因过量表达可以增加叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量,提高光合作用光反应中电子传递速率,促进转基因马铃薯植株生长。

小麦分蘖相关性状是小麦株型的重要特征,是决定植株结构并影响籽粒产量的重要因素。为了解小麦在不同水分条件下分蘖相关性状的遗传及其抗旱作用,并挖掘分蘖相关性状的位点,以240份小麦品种(系)为研究对象,通过对正常灌溉(NI)和干旱胁迫(DS)2种处理条件下的分蘖角度、有效分蘖数和单位面积产量的表型鉴定及抗旱性综合评价,结合90K基因芯片,进行相关性状的全基因组关联分析(GWAS),以期发现分蘖相关性状遗传位点并筛选优异种质材料。分蘖角度、有效分蘖数及单位面积产量在2种水分处理下表现出显著差异,变异系数为0.07~0.33。依据D值进行综合抗旱性评价,结果表明,中优206抗旱性表现最好。共检测到54个与分蘖角度等性状显著相关的稳定遗传位点,分布于除3D、4D和5D以外染色体上;在2种处理下共同检测到相同稳定位点有3个,分别在2B、4B和6B染色体上;另外,在不同性状中共同检测到4个“一因多效”位点,分别在2B、2D和5B染色体上。同时,对2B染色体分蘖角度显著相关的Ra_c491_902(R²=5.45%~17.91%)进行单倍型分析表明,存在TA-Hap1、TA-Hap2和TA-Hap3 3个单倍型,其中含有TA-Hap1单倍型品种(系)主要来源于黄淮冬麦区。对不同处理下检测到的稳定遗传位点进行候选基因筛选,共筛选出5个与分蘖角度相关的候选基因。对在Ra_c491_902上筛选出的基因进行基因注释得出,可能是编码细胞色素P450家族蛋白基因,可作为调控分蘖角度、植株抗旱以及防御等重要基因,探究基因与表型之间的关联,为小麦分蘖角度遗传机制奠定基础。

为研究枸杞LbaHY5基因的性质及功能,探明LbaHY5在枸杞果实发育中的作用,以宁夏枸杞宁杞1号为试材,采用生物信息学、亚细胞定位及qRT-PCR等方法对LbaHY5的结构和功能进行初步分析,结果表明:LbaHY5开放阅读框全长为483 bp,编码160个氨基酸,分子质量为17.52 ku,等电点为9.69,属于亲水性蛋白。保守结构和多序列比对分析显示,LbaHY5蛋白含有bZIP结构域,属于bZIP家族成员。进化树分析表明,枸杞LbaHY5蛋白与茄科植物如番茄、马铃薯等的HY5蛋白高度同源。此外,启动子分析表明,该基因启动子区域富含多种功能元件,这些元件分别与光信号、激素信号以及非生物胁迫应答等过程相关。亚细胞定位结果显示,LbaHY5蛋白定位在细胞核上。qRT-PCR检测发现,LbaHY5基因在花中表达量最高,茎中最低,且在果实发育时期表达量呈现逐渐上升趋势。研究表明LbaHY5可能参与枸杞花器官和果实生长发育。

为了明确广藿香Trihelix转录因子家族成员PatGTL1的序列特征及表达特性,并为后续深入研究PatGTL1转录因子的功能奠定理论基础。首先,以广藿香为材料提取总RNA并反转录得到cDNA,以此为模板根据转录组序列设计特异性引物克隆PatGTL1基因,随后利用生物信息学软件分析预测其理化性质、结构特征和亲缘关系;构建pAN580-PatGTL1-EGFP融合表达载体并转化拟南芥原生质体,考察PatGTL1亚细胞定位;进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定PatGTL1基因在广藿香不同组织中、外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理及非生物胁迫(包括盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫)下的表达模式。结果表明,PatGTL1开放阅读框为1 497 bp,编码498个氨基酸。PatGTL1为不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽,含有42个丝氨酸磷酸化位点,含有2个GT1保守结构域。进化树分析表明,PatGTL1属于Trihelix转录因子家族的GT-2亚家族,与芝麻SiGTL1同源性较高。亚细胞定位结果表明,PatGTL1定位于细胞核。qRT-PCR分析显示,PatGTL1在广藿香的根、茎、嫩叶、成熟叶和老叶中均有表达,尤以嫩叶中的表达量最高;在MeJA处理后,PatGTL1的相对表达量显著提高,在3~24 h呈上升趋势;在盐胁迫3 h PatGTL1表达量最高;干旱胁迫后PatGTL1表达量显著低于对照;冷胁迫后PatGTL1表达量呈先上升后下降的趋势,在12 h表达量最高。研究结果丰富了广藿香Trihelix转录因子家族的研究。