前期通过矮秆高粱和本地玉米远缘杂交成功选育出矮秆dwarf-12,经过前人研究该矮秆基因可能由br2控制,由于无不良性状,为了利用、发掘优良的矮秆自交系,又将dwarf-12和本地白玉米杂交,选育出优良矮秆自交系d8227,前人将得到的矮秆玉米材料d8227经过与不同高度的玉米组合,鉴定出具有较好的配合力,为增加矮秆玉米种质资源,提高玉米产量,对其进行深入的研究。以d8227和dwarf-12为研究材料,比较矮秆亲本和子代之间的主要农艺性状差异,观察茎秆细胞学差异;用d8227和4个不同背景自交系进行遗传交配设计,分析矮秆基因的遗传模式;构建定位群体,用BSA方法,进行高通量测序,对矮秆基因进行初步定位,并对定位区间已知的矮秆材料进行等位性鉴定,明确目标基因与已知基因的关系。结果表明,d8227株高比亲本株高增加9.35%,穗位增加31.50%,d8227叶片减少,茎节长度增加,d8227的穗质量、行粒数、百粒质量、穗长、粒深比dwarf-12增加52.21%,5.26%,23.76%,6.93%,12.02%;利用石蜡切片方法,用显微镜观察d8227和dwarf-12穗上、穗位、穗下的横切、纵切细胞特征,d8227纵切细胞排列松散,细胞明显伸长;dwarf-12细胞排列有规则、紧凑,经过测量细胞面积,d8227穗位、穗下细胞面积显著高于dwarf-12,这主要是由于d8227细胞伸长导致。通过遗传分析,矮秆基因为隐性单基因,基因初步定位,将矮秆基因定位于1号染色体190~215 Mb,选取区间已经定位的矮秆玉米进行等位性鉴定,2 a种植结果表明,d8227与123d、Na360不是等位基因,可能与125d、123d为等位基因,需要后续精细定位和深入研究。综合来看,d8227是一个性状优良的中等矮秆材料,具有育种潜力,但还需进行精细定位等深入研究来判断其利用价值。

朱砂根是紫金牛科中药植物,主要活性成分为齐墩果烷型三萜类化合物朱砂根皂苷。为探索朱砂根三萜皂苷生物合成的分子基础,采用Illunima HiseqTM 4000对无菌水、2 mmol/L SA处理的3年生朱砂根植株进行转录组测序,基于Blast完成Unigene分类、功能注释、代谢通路分析、蛋白功能注释、差异表达基因分析、代谢途径关键基因挖掘等。共获得41.63 Gb数据,拼接组装获得102 491条Unigenes,平均长度831 bp,注释率50.21%。筛选出3 417个SA应答差异表达基因,其中2 725个基因上调,692个基因下调。差异表达基因显著富集于次生代谢物生物合成、代谢途径、氨基糖和核苷酸糖代谢、糖酵解/糖异生、碳代谢等通路。与朱砂根三萜皂苷相关的代谢通路,包括萜类骨架生物合成(ko00900)和倍半萜与三萜生物合成(ko00909),共筛选出8个关键酶、11条差异表达Unigenes。SA处理后萜类骨架生物合成MVA途径HMGR、HMGS、MVK、GGPS、SS、SQE基因差异表达显著,MEP途径DXS、DXR、MCT、CMK、MDS、HDR基因差异表达不显著。催化生成齐墩果烷型五环三萜前体的关键酶β-香树素合成酶基因(β-AS)表达量下调,后修饰基因CYP450s(CYP72A67)表达量也下调。荧光定量qPCR值与RNA-seq表达量FPKM值变化趋势一致。推测SA通过诱导MVA 途径的关键酶基因表达影响朱砂根三萜皂苷的积累,MEP途径中的酶基因可能参与其他支路次生代谢产物的合成。

为研究蓝莓3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)的性质和功能,探明3-O-葡萄糖基转移酶在花青素合成过程中发挥的作用,以成熟的蓝莓果实为材料,利用同源克隆获得了3GT基因的单一拷贝,运用生物信息学软件分析预测蓝莓3GT的序列特征。结果表明:3GT基因长度为1 371 bp,编码456个氨基酸,位于蓝莓的4号染色体末端,含有3个外显子和2个内含子。蛋白的分子式为C₂₂₇₉H₃₅₂₁N₅₉₅O₆₅₀S₁₅,理论等电点(pI)为6.14。信息分析预测3GT蛋白有37个磷酸化位点,亲水指数小于0为亲水性蛋白,不稳定系数大于40为不稳定蛋白,无跨膜区和信号肽;蛋白质二级结构由α-螺旋(Hh)、延伸链(Ee)、β-转角(Tt)和无规则卷曲(Cc)4种结构形式组成,其中α-螺旋占比最高,达40%;3GT属植物糖基转移酶家族(GTB-型),PSPG结构域中第44位是组氨酸,糖基供体可能为UDP-半乳糖;与猕猴桃亲缘关系最近,同源性为67%;分子对接显示蓝莓3GT与矢车菊素分子存在4种相互作用力;蓝莓3GT启动子上游可能具有与光响应、抗胁迫响应及特定激素响应相关的顺式作用元件。本研究克隆得到了蓝莓3GT基因,通过在线网站和预测软件对其进行了生物信息学分析和功能预测。

为将雄性不育基因应用于甜玉米杂交制种中,达到降低劳动成本且保证种子纯度的目的。以来源于甜玉米自交系K78的雄性不育自发突变体male sterility 2020 (ms2020)为材料,构建ms2020与甜玉米自交系M08的F₁及相应的F₂遗传群体,通过表型鉴定、遗传分析和基因定位研究ms2020甜玉米雄性不育突变体。表型鉴定结果表明:F₁群体均表现为雄性可育,F₂群体出现了育性分离。不育植株能够正常抽雄,但花药不开裂、散粉异常,花药变小且颜色淡黄;1% I₂-KI染色发现不育植株的花药内包含不能正常着色的败育花粉粒。遗传分析结果表明:育性正常植株与不育植株的比例符合3∶1,表明ms2020雄性不育突变体是由单基因控制的隐性突变体。利用BSA技术,初步将目的基因定位在7号染色体短臂上;随后利用初定位区间内的20对SSR标记对不育基因进行定位,将不育基因精细定位在标记S1和W10之间,物理距离为11.30 kb。该区间内包含Zm00001d018802和Zm00001d018803 2个注释基因;通过候选基因功能分析,推测已报道为玉米雄性不育基因的编码谷氧还蛋白的Zm00001d018802 (ZmMs22/ZmMSCA1)基因可能是导致ms2020雄性不育的关键候选基因。本研究鉴定了ms2020甜玉米雄性不育突变体的败育特征和遗传特性,为甜玉米雄性不育化杂交制种提供了材料;同时,本研究定位到突变体的关键候选基因,为进一步解析其雄性不育的分子机制奠定了基础。

元江普通野生稻(YP)是一份被称为植物活化石的种质材料,同时其也拥有大量的抗性(R)基因。为了鉴定元江普通野生稻中含有目前已知白叶枯病抗性基因的情况。以元江普通野生稻(YP)、渗入系后代(L214和G252)及其渗入系的感病亲本栽培稻合系35(HX35)作为供试材料,通过接菌鉴定、功能标记检测、同源克隆和实时荧光定量(qRT-PCR)技术来评价这些材料对白叶枯病的抗性。接菌鉴定结果显示,YP、L214、G252对供试的白叶枯病菌C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C9和PXO99^A均表现出抗性且病斑长度均小于2 cm;而HX35对供试的9个菌株均表现出感病且病斑长度远超6 cm。白叶枯病抗性基因检测结果显示,YP中含有Xa10的同源基因,HX35、L214、G252中含有xa23的感病同源基因。序列比对结果显示,抗病基因Xa10与YP中的Xa10启动子的效应因子结合元件(EBE_AvrXa10)区域序列差异较大。同样地,隐性感病基因xa23与HX35、L214和G252中的xa23启动子的效应因子结合元件(EBE_AvrXa23)区域序列一致。qRT-PCR结果显示,在接了PXO99^A菌株24 h后,YP、HX35、L214和G252中的免疫反应被激活,而YP中的Xa10和HX35、L214、G252中的xa23在所有处理时间段内均未被诱导表达。由此推测,YP、L214和G252中可能含有新的抗白叶枯病基因。

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子,以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点,筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列,命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析,发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件,初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能,构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明,该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达;转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示,PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。

旨在初探BMF基因在小尾寒羊卵泡发育过程中的生物学功能,为将来深入探索其调控机理提供理论依据。对小尾寒羊实施同期发情,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)及免疫荧光染色(IF)方法检测BMF基因及其编码蛋白在不同生理阶段卵巢中的表达量;随后分离不同直径的卵泡,分析目的基因在大、中、小卵泡中的表达差异。结果显示,BMF mRNA在撤栓后42 h卵巢中的表达量显著高于撤栓后18 h(P<0.05),其编码蛋白表达结果与mRNA基本一致;BMF蛋白主要表达于卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中;进一步分离卵泡,发现BMF基因及其编码蛋白表达量均在中卵泡中显著高于大卵泡和小卵泡(P<0.05)。以上结果表明,BMF基因可能参与卵巢周期性活动,在卵泡发育过程中发挥重要作用。

为了深入地讨论牦牛ANXA5基因序列的特点,阐述其组织及细胞表达特性,通过采集牦牛不同组织样品,如心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等,提取总RNA。采用PCR、生物信息学软件、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术对牦牛ANXA5基因进行克隆、序列分析及表达特性研究。结果显示,牦牛ANXA5基因CDS区长为966 bp,共编码321个氨基酸。与黄牛比较,发现共有6个碱基突变存在于牦牛ANXA5基因中。黄牛与牦牛的核苷酸和氨基酸同源性大于99%,与其他哺乳动物进行氨基酸同源性比较,结果也均在90%以上,说明ANXA5基因在长期进化中保守。在牦牛的肺组织中,ANXA5基因表达量最高,与其他组织差异极显著(P<0.01);在子宫和输卵管组织中表达量次之。ANXA5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中均有表达,且表达量随时间增长而逐渐升高。结果显示,培养72 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24,36 h颗粒细胞(P<0.01);培养48 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24 h颗粒细胞(P<0.01),显著高于培养36 h颗粒细胞(P<0.05),表明ANXA5在黄体化的颗粒细胞中表达量更高。然而,免疫组化结果显示,ANXA5的亚细胞定位于细胞质,在黄体细胞中表达较高。

为深入探究甜玉米果皮厚度发育的分子机制,利用华南农业大学甜玉米课题组选育的果皮厚度差异较大的甜玉米自交系M03和M08为试验材料,对其授粉后15,19,23 d的果皮进行转录组测序。联合差异表达基因分析与加权基因共表达网络(WGCNA)分析,鉴定甜玉米乳熟期果皮厚度相关的共表达基因模块,根据模块内基因的连接度鉴定核心基因,利用qRT-PCR验证核心基因表达量的可靠性。比较M03和M08不同时期果皮转录组数据共筛选出4 748个差异表达基因(DEGs),DEGs主要富集到碳水化合物代谢过程、植物-病原体相互作用、植物MAPK信号通路。WGCNA分析共构建了18个共表达模块,通过筛选得到4个具有生物学意义且与果皮厚度显著相关(相关系数的绝对值>0.60)的特异性共表达模块,分别是Turquoise、Yellow、Magenta和Pink模块。GO和KEGG功能富集分析结果均表明,特异性模块富集到的天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及植物MAPK信号通路在甜玉米果皮厚度发育中具有重要的作用。选取连接度最高的前20个基因进行核心基因筛选,通过基因功能注释最终筛选到包括MYB转录因子、细胞周期蛋白(CYC15)、β-淀粉酶、细胞凋亡调节基因(BCL-2)在内的13个核心基因。以核心基因为节点构建的共表达网络中还包括生长素转录因子(ARF、AUX/IAA)、乙烯反应元件结合因子(ERF)、亮氨酸拉链(bZIP)等转录因子,功能预测表明,这些基因可能在甜玉米果皮厚度调控中发挥重要作用。

分蘖高于主茎是困扰高粱品种整齐度和机械化生产的重要原因之一,为了阐明高粱调控分蘖高度基因的作用机制,提高高粱品种整齐度、选育适宜机械化生产高粱品种,依据前期的定位结果,利用15份分蘖与主茎整齐一致和17份分蘖高于主茎的高粱品种组成自然群体对候选基因进行验证,发现SNP3位点影响分蘖高度,所属基因为Sobic.009G213300.1.v3.2,命名为SbTH,位于水解酶_4保守区域。以分蘖高度与主茎一致的K35-Y5和分蘖高于主茎的1383为材料,通过实时荧光定量PCR分析SbTH基因在高粱不同组织中的表达模式。结果表明,2个材料SbTH基因在根和叶中均有表达,虽然表达量有差异,但趋势基本一致;1383主茎和分蘖茎基因表达量和趋势也基本一致,而K35-Y5在主茎开花期时呈反向表达,主茎表达量达到最高,同期的分蘖茎表达量降到最低。分析认为,SbTH在K35-Y5分蘖中表达量低,控制了分蘖节间的过度生长,形成主茎与分蘖高度一致的株型,而在1383分蘖中表达量高,促进分蘖节间的生长,使得分蘖比主茎高,SbTH基因在主茎开花期的差异表达是影响分蘖株高的关键。

SEPALLATA1(SEP1)基因是重要的MADS-box家族基因,在植物开花时间调控中发挥重要作用。为明确牡丹中PlSEP1基因在牡丹开花过程中的生物学功能及表达特性,进一步了解其参与开花时间调控的机制,基于前期得到的牡丹二次开花品种海黄花芽发育过程转录组数据中筛选到的一个MADS-box家族基因PlSEP1,应用实时荧光定量PCR检测PlSEP1基因在牡丹花芽发育过程中的相对表达量,通过在拟南芥中过量表达PlSEP1基因探究其发挥的功能。结果显示,获得的PlSEP1基因具有735 bp的CDS序列,共编码244个氨基酸。经生物信息学分析得知,PlSEP1编码的蛋白具有稳定的亲水性,并且不含信号肽。进化分析显示,PlSEP1与拟南芥、大豆亲缘关系较近;亚细胞定位发现,PlSEP1蛋白在细胞核中表达;实时荧光定量PCR结果表明,PlSEP1在花芽中表达量最高,且在分化期达到最高。拟南芥中过量表达PlSEP1会导致开花时间提前,表明PlSEP1参与调控开花过程。

为了探讨柑橘MYB96基因在柑橘抗逆过程中的作用,以甜橙、柠檬、金柑、芦柑为试验材料,克隆得到4个柑橘MYB转录因子家族基因,分别命名为CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96,并对其生物信息学以及不同非生物胁迫处理下的表达模式进行分析。结果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96的开放阅读框长度分别为1 032,1 035,1 035和1 032 bp,其编码的蛋白分别由343,344,344,343个氨基酸组成,分子量分别约为38.16,38.27,38.22,38.13 ku,等电点分别为6.31,6.35,6.35,6.31,均为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果均定位于细胞核。这4个基因编码的蛋白二级结构相似,主要由α螺旋和无规卷曲构成;具有高度保守的R2和R3结构域;在进化关系上,与克莱门氏小柑橘CcMYB96亲缘关系最近。CsMYB96基因的启动子中含有脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTR)、厌氧响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等非生物胁迫响应相关顺式作用元件。qRT-PCR结果分析表明,甜橙CsMYB96能被低温和干旱胁迫诱导表达;柠檬ClMYB96和金柑FmMYB96在高盐胁迫下被诱导表达;而芦柑CrMYB96的表达量在低温、干旱和高盐胁迫下都有不同程度的下调表达。

钙调蛋白是植物体内一种重要的Ca²⁺受体蛋白,在钙信号途径及抗逆反应中发挥着重要作用。为研究番茄CaM蛋白在低温胁迫下的作用机制,以番茄品种Heinz1706、LA3969、冀粉2号、冀粉3号和农博粉霸15为材料,克隆得到了番茄钙调蛋白基因SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5,并进行序列分析和启动子区顺式作用元件分析;利用qRT-PCR技术分析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品种中15,5 ℃低温胁迫下的表达模式,并结合RNA-seq数据分析组织特异性表达情况。结果显示,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列均为450 bp,三者相似度为93.63%;所编码的氨基酸序列完全相同,属酸性稳定亲水蛋白,具有典型的CaM蛋白保守结构域。启动子顺式作用元件分析表明,3个基因的启动子区除含有必需的核心元件外,还含有多种生物及非生物胁迫响应元件,并呈现互补模式分布。不同程度低温胁迫表达模式分析表明,15 ℃胁迫下,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5种番茄材料中的表达模式均呈现出先降低后升高的趋势,其中SlCaM5基因的表达量升高更为显著;5 ℃胁迫下,SlCaM3、SlCaM4基因的表达水平变化不明显,而SlCaM5基因在处理后期表达量显著升高;表明SlCaM5在低温下维持着CaM蛋白的翻译水平。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同组织中的特异性表达情况显示,SlCaM3和SlCaM4在分生组织中具有较高的表达,而SlCaM5基因在不同组织中表达水平差异不明显。

为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用,以蓖麻叶片为材料,设计特异性引物,克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明,蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1 590 bp;编码528个氨基酸;蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白;亲水性数值为负值,属于亲水性蛋白;RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个;RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID: 3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中,与麻枫树的同源性最高,为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca²⁺结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术,分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达,结果表明,RcCDPK29基因主要在茎中表达,盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长,RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降,分别在2,8,24 h达到最低,与0 h差异显著;叶的表达量在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。根据RcCDPK29全长设计带有Sma Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点的引物扩增出序列全长,用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切后与表达载体 pCG-3300连接。成功构建了CRcCDPK29的表达载体。因此,RcCDPK29在蓖麻受到盐胁迫时起重要作用。

NPF转运蛋白家族在植物转运硝态氮过程中起重要作用。为明确茶树中NPF基因的序列特征,用PCR扩增的方法在茶树中分别扩增出一个茶树氮转蛋白基因CsNPF5的DNA和cDNA全长,为2 096,1 440 bp。序列分析指出,该基因含有3个外显子和2个内含子,开放阅读框(ORF)为1 440 bp。序列分析结果显示,该基因编码479个氨基酸,相对分子质量约为53.12 ku,等电点为7.13,其编码蛋白的N端含有一个PTR2 Pfam结构域;亚细胞定位分析指出该基因编码蛋白定位于细胞质内;CsNPF5蛋白与中华猕猴桃NPF蛋白具有较高的同源性,相似度为79.54%;聚类分析指出,CsNPF5及其同源蛋白分别聚类成3个进化分支,且与来自中华猕猴桃NPF18同源蛋白聚到同一进化支上。同时qRT-PCR分析结果表明,在0~48 h氮素处理下CsNPF5在叶中的表达存在不同程度的上调表达,且基因上调表达丰度随NO₃^-浓度升高,响应时间更快,且在2 mmol/L NO₃^-处理24 h后,CsNPF5在茶树叶片中表达量出现峰值,这表明该基因表达受氮素诱导。

为了探索DUF760基因家族在水稻生长发育中的潜在功能,对水稻DUF760基因家族进行了全基因组鉴定、分类、启动子序列分析和表达谱分析。通过生物信息学技术在水稻和拟南芥中分别鉴定了6,8个DUF760家族成员。系统进化树分析将这些家族成员分成2个亚家族,二者在蛋白保守基序和基因结构上也存在一些特征差别。水稻DUF760家族基因启动子区域存在多个响应逆境胁迫和植物激素的顺式作用元件,ABRE(脱落酸响应)元件存在于家族所有成员的启动子序列中,OsDUF760-1启动子区域拥有9个脱落酸(ABA)相关的响应元件。在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平显著下调,而OsDUF760-3显著上调,二者在干旱胁迫处理水稻后的表达变化模式与ABA处理水稻后的表达变化模式一致,说明这2个基因可能通过ABA信号途径参与水稻干旱胁迫响应,并且扮演不同的角色。除对ABA和干旱胁迫处理具有较强响应外,水稻DUF760家族成员还对JA(茉莉素)、低温及稻瘟菌处理具有较强的响应表达变化。

为探索1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)是否参与香鳞毛蕨对环境的抗逆功能,用PCR克隆并鉴定了香鳞毛蕨DfDXR基因,并通过在线预测网站对其蛋白序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了DfDXR基因在不同化学物质和逆境胁迫处理下相对表达量的变化。结果表明,成功克隆出DfDXR基因的CDS序列全长1 434 bp,编码477个氨基酸,DXR蛋白二级结构为alpha-beta型。蛋白质多序列比对以及进化树分析表明,DfDXR与铁线蕨AcDXR亲缘关系较近,与苹果和桃等植物的DXR蛋白亲缘关系较远,Motif分析表明,该蛋白含有PLN02696结构域,该结构域为DXR蛋白的保守结构域,亚细胞定位预测DXR蛋白定位于叶绿体上,与其他物种一致。对qRT-PCR数据进行分析显示,DfDXR的相对表达量在茉莉酸甲酯(MeJA)和聚乙二醇(PEG)处理后总体都呈现上调的趋势,并分别在1,12 h达到最高;NaCl处理下呈“降—升—降”的趋势,但各处理时间下的表达量均低于对照组;水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(ETH)、高温(HT)以及低温(LT)处理下,DfDXR的相对表达量也发生明显变化。在香鳞毛蕨响应不同非生物胁迫过程中,DfDXR均发挥调控作用,且DfDXR对不同化学物质和逆境胁迫的响应时间不同。

为探究甘蔗 PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系,以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象,通过RT-PCR技术对ScPRT1 (GenBank 登录号:MT747433)基因进行克隆,生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明,该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框;其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有核定位信号;该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域;ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR 结果显示,ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大,在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调;受黑穗病菌胁迫后,在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达,在感黑穗病品种中下调表达,都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示,ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中,与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中,有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白,这暗示它们之间存在直接的相互作用。以上结果表明,ScPRT1在甘蔗激素信号传导以及响应黑穗病菌侵染过程中发挥重要作用。

为了挖掘雄性不育种质资源,鉴定雄性育性基因,为玉米雄性不育化制种提供基础材料。以玉米雄性不育突变体x50为试验材料,研究突变体雄性不育表型,构建x50与自交系Mo17的F₁和F₂群体,确定突变体x50雄性不育性状的遗传模式。以F₂群体为材料,应用图位克隆技术定位雄性育性基因X50,通过基因等位性测验确定候选基因。结果显示,与野生型相比,雄性不育突变体x50花药不能从颖壳露出,花药体积较小且萎蔫,无成熟花粉粒形成。F₁群体植株均表现为雄性可育,F₂群体植株出现雄性育性分离,可育植株与不育植株分离比例符合3∶1,说明突变体x50不育性状受1对隐性核基因控制。通过图位克隆方法将雄性育性基因X50定位于玉米第2染色体分子标记2-4901与2-4963之间,物理区间为237.42~241.39 Mb。定位区间内候选基因分析发现,区间存在玉米雄性不育基因ZmMs33。以ms33纯合突变体ms33-6029和ms33-6052分别与x50杂合型+/x50杂交,杂交后代可育植株与不育植株分离比例符合1∶1,表明x50是ZmMs33基因一个等位突变体。玉米雄性不育突变体x50的鉴定为玉米杂交种子生产和ZmMs33基因功能研究提供了种质材料。

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明:所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异,在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中,RPP13基因表达量的降低幅度为35%~60%。

为了揭示南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄PTI免疫的分子机理,以番茄品种新金丰1号 MiPDCD6超表达苗为试验材料,以番茄品种新金丰1号组培苗为对照,通过转录组测序技术分别对番茄MiPDCD6超表达苗和对照苗进行转录组测序。 以番茄栽培品种Heinz 1706基因组作为参考基因组进行对比,利用FPKM法计算基因表达量,设定参数(|log₂ FC|>1且P<0.05)筛选差异表达基因。利用Gene Ontology(GO)数据库进行差异表达基因GO功能富集分析,统计每个GO term中的差异表达基因数目,计算出基因富集的显著性,找出富集显著的功能条目。利用KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway富集分析,超几何分布检验方法计算每个Pathway中差异表达基因富集的显著性。以FDR和基因数量来衡量KEGG的富集程度。结合基因差异表达分析和功能富集分析,研究MiPDCD6蛋白对番茄PTI免疫相关通路基因的影响。结果发现:在超表达MiPDCD6番茄植株中,与野生型番茄相比,MiPDCD6过表达番茄植株中有2 366个差异表达基因(DEGs),其中1 354个上调基因,1 012个下调基因。 这些DEGs中,通过GO和KEGG注释,植物激素信号转导(sly04075)、植物-病原互作(sly04626)、植物MAPK信号通路(sly04016)和丙环素生物合成(sly00940)等KEGG通路中富集到大量的差异表达基因。SA生物合成途径包括ICS和PAL,MiPDCD6过表达番茄植株中SA合成通路PAL1和PAL-like基因以及SA信号转导途径TGA9、TGA10-like和PR1a2基因均显著下调,表明MiPDCD6基因可能抑制SA合成,从而抑制植物PTI免疫。

为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶,为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中,转化大肠杆菌 BL21(DE3)诱导表达;用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果;用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育,预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明,工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍;Pel419含375个氨基酸,N末端前22个氨基酸为信号肽,理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸,不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构,属于Pec lyase C家族;Pel419的Ca²⁺结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面,并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量,并获得了Pel419关键结构信息。

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点,以秦川牛为研究对象,利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列,利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征,以GAPDH为内参基因,采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示,秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸,CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性,且与瘤牛的同源性最高;CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白,主要由α-螺旋及不规则卷曲构成;亚细胞定位分析表明,CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体;蛋白互作分析表明,其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用,提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程;组织表达分析表明,CDS1基因在各个组织均有广泛表达,且在睾丸中表达量最高,在脑的表达水平也较高,二者均显著高于其他组织的表达水平,在心的表达量最低。

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养,经电镜观察和IFA试验进行鉴定,通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增,SnapGene V4进行序列拼接和比对,利用DNAMAN V6对基因组末端5'UTR和3'UTR二级结构进行展示和比较,应用MEGA V7进行遗传进化分析,最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒,均鉴定为PPV1型毒株,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致,其中5'-UTR序列高度保守,呈Y型结构;而3'-UTR呈U型结构,个别碱基有所差异;VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示,突变株生长趋势相对较快,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。

WRKY转录因子是植物非生物胁迫反应中的重要调节子。荞麦耐贫瘠,磷利用率较高。为了探究WRKY基因在荞麦磷饥饿反应中可能的调节作用,以苦荞麦为材料,采用逆转录PCR方法,从低磷处理的根RNA样品中获得了FtWRKY6基因的编码序列。FtWRKY6 cDNA长1 572 bp,编码524个氨基酸,含有2个典型的WRKY保守结构域,锌指类型为C₂H₂,归属于第Ⅰ类WRKY,与绿茶CsWRKY24在氨基酸水平上的同一性较高(55.5%)。拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,FtWRKY6定位于细胞核中;酵母单杂交试验表明,FtWRKY6具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,在根中FtWRKY6的表达受低磷和3种重要的低磷反应相关激素—吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)显著诱导。上述结果提示,FtWRKY6具有转录因子的基本结构与生化特征,在根中可能通过IAA、GA、CTK信号通路的交互作用介导苦荞麦在低磷条件下的响应过程。

为了对大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE的功能进行初步鉴定,并对其生物学特性及表达模式进行分析,通过生物信息学分析、PCR扩增及qRT-PCR等方法来对大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE进行研究。由于大麦G1614为大麦MOREX品种的姊妹系,且大麦MOREX品种公布了参考基因组数据,所以通过将短穗二柄草BdMUTE基因同大麦G1614基因组进行序列同源比对,得到大麦HvMUTE基因序列。从大麦材料G1614幼芽中的第1片叶片中取样,克隆得到大麦HvMUTE基因651 bp的编码区。生物信息学分析结果表明, HvMUTE蛋白是位于细胞核中的无明显亲水疏水性的不稳定蛋白质,并且其蛋白质三维结构含有螺旋-环-螺旋(HLH)结构。系统进化树分析结果表明,HvMUTE蛋白同小麦和山羊草的MUTE-Like蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,在干旱条件下,HvMUTE基因表达量无明显变化,这一结果同前人研究有所不同,猜测与大麦为单子叶植物,气孔结构中存在副卫细胞同双子叶植物气孔结构形态不同有关。

为探究CaMADS6表达量与辣椒花器官发育之间的关系,以辣椒不育系9704A和保持系9704B为试验材料,克隆CaMADS6进行生物信息学预测,并分析该基因在两系中的时空表达特性。结果表明,从9704A和9704B中克隆得到的CaMADS6编码区序列一致,序列长744 bp,编码247个氨基酸残基。CaMADS6蛋白相对分子量为28.67 ku,理论等电点为8.98,为亲水性蛋白,无跨膜结构,二级结构中α螺旋占57.49%、延伸链占8.91%、无规则卷曲占28.74%。CaMADS6与辣椒CaFUL2同源性100%,蛋白结构域具有典型的MADS-box特征;CaMADS6在两系各发育时期不同器官中均有表达,表达量大小均为花蕾中最高、其次为叶和茎,根中几乎不表达。9704A茎中CaMADS6表达量在苗期、花蕾期和成株期3个发育时期中均显著低于9704B茎中的表达量,叶中CaMADS6表达量在成株期极显著低于9704B叶中表达量。花蕾中CaMADS6表达量在花蕾期和成株期均极显著高于9704B花蕾中表达量,分别为9704B的2.2,3.5倍;CaMADS6在两系植株花器官不同部位均能表达,表达量由大到小依次为花萼、花冠、子房、花药,其中9704A花萼和花冠中CaMADS6表达量极显著或显著低于9704B,分别为9704B花萼、花冠中CaMADS6表达量的66%,83%,花药中CaMADS6表达量为9704B表达量的34倍,两者差异极显著,推测CaMADS6基因在花药中的异常表达与辣椒雄性不育密切相关。

为探究不同干旱胁迫时间处理下,二倍体马铃薯材料对干旱胁迫响应的分子机制,挖掘抗旱相关基因。以高抗旱二倍体资源A90为试验材料,利用转录组测序技术对PEG-6000胁迫下不同时间的差异表达基因进行分析,通过GO富集、KEGG通路分析与转录因子预测参与马铃薯干旱胁迫响应的差异表达基因,初步挖掘抗旱调控关键基因;并通过RT-qPCR对3个抗旱候选基因进行逆境胁迫表达分析。结果表明:A90在20%PEG-6000胁迫处理3,6,24 h与对照相比,共有2 519个差异表达基因,这些基因主要富集在植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等抗旱相关过程中。并且显著富集在通路上的340个共差异表达基因中有53个基因注释到了RLKs、AP2/ERF和Tify等15个转录因子家族中,其中StST/K1、StERF1和StTify1的表达量较高,有可能是抗旱调控关键基因。基因StST/K1和StERF1受到干旱和低温胁迫主要在材料的根和叶中上调表达,基因StERF1在盐胁迫下在材料的根、茎和叶中均上调表达;基因StTify1在受到干旱在材料的茎和叶中上调表达,受到盐胁迫在材料的根、茎和叶中均上调表达,但在低温胁迫下只在材料的茎中下调表达。由此说明,筛选出的3个基因均能够对干旱、盐和低温胁迫产生响应,可为今后马铃薯抗旱分子育种中相关抗旱候选基因研究提供一定的理论基础。

原花青素是植物中广泛存在的一类黄酮类化合物,是人类膳食的重要营养成分,在防治病虫害方面也发挥着重要作用,花青素还原酶(ANR)是合成原花青素的关键酶。以大果球红花品种为材料,克隆得到2个CtANR基因。生物信息学分析表明,CtANR2和CtANR3的编码区分别为1 020,1 023 bp,对应基因组序列中均含有5个外显子和4个内含子,第1个外显子长度不同,其余4个外显子长度一致,内含子长度差异较大。CtANR2和CtANR3基因编码蛋白质的氨基酸数目分别为339,340个,二级结构都主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,都属于水溶性蛋白,但CtANR2蛋白不稳定,而CtANR3为稳定的亲水性蛋白。此外,2个蛋白质都不存在信号肽和跨膜结构,可能定位于细胞外。序列比对及系统进化分析表明,CtANR2和CtANR1同源性最高,亲缘关系最近,3个CtANR蛋白与菊科植物ANR蛋白进化关系最近,与茄科、锦葵科和桑科植物ANR蛋白也同属一个大分支。组织特异性表达分析发现,CtANR2和CtANR1组织表达模式相似,都是在花中的表达量最高,初期果球表达量最低,而CtANR3则在苞片中表达量最高,根和初期果球中表达量最低。三者在不同激素胁迫下呈现出不同的表达模式,CtANR2和CtANR1在不同激素处理后表达量均下降,而CtANR3在5种激素处理后表达量均有不同程度的升高。以上结果表明,红花3个CtANR基因可能在红花不同发育阶段及抵抗非生物胁迫中有不同的分工。

为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料,根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段;通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体;用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆;再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株;最后,相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T₁转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明,OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化,穗长变短,叶片夹角下降,种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短,叶片对BL的响应不敏感;而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加,穗长变长,叶片夹角增加,种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长,叶片对BL的响应敏感。综上,这些结果为改变水稻植株结构进而增加籽粒产量提供理论支持并可能为后续研究OsBAK1和前体物质OsBAK1P的其他功能提供参考。

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式,在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料,克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析,包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示,RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCML42与巴西橡胶树一致性最高,达86.84%。qRT-PCR结果显示,RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达,在经NaCl处理后,RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达,在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器,通过与钙调素结合蛋白结合进而对植物细胞进行调控。当植物受到环境中NaCl侵害时,CML可以参加体内钙离子的调节,进而减轻盐胁迫对植物体的损害。综上,推测RcCML42在盐胁迫条件下的蓖麻信号转导中起重要作用。

赤霉素途径是植物开花调控中的一条重要途径。为了解赤霉素途径相关基因在萝卜开花调控中的作用,利用生物信息学方法对萝卜赤霉素生物合成和信号转导相关基因的结构、理化性质、染色体分布、启动子顺式作用元件和组织特异性表达进行了分析,并对不同开花期萝卜材料中这些基因的表达水平进行了实时荧光定量 PCR检测。结果表明,萝卜基因组含有46个赤霉素生物合成和信号转导相关基因,CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2分别有2,1,2,2,9,5,12,1,1,4,3,4个,它们不均匀分布于9条染色体上,其编码蛋白质分子质量为21.32~127.80 ku,等电点为4.72~9.04;基因结构和保守结构域分析发现,这46个基因的外显子数为1~21个不等,且一些保守基序为大部分基因所共有。启动子顺式作用元件分析表明,这46个基因的启动子含有与光、赤霉素、生长素、ABA、SA、低温、干旱等响应的顺式作用元件。利用萝卜基因表达数据库分析发现,这46个基因在不同组织和不同发育时期的表达量不同;实时荧光定量PCR检测表明,这些基因在早开花材料心里美萝卜和晚开花材料野萝卜中的表达量有明显差异,暗示其可能与萝卜的生殖生长有较密切的关系。

为明确杜梨赤霉素受体(GID1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现,PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_35S-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株。

为了探究SBP1基因在植物自交不亲和方面的重要作用,以二倍体马铃薯野生种为材料,利用RT-PCR技术克隆获得马铃薯野生种 SpSBP1(登录号:MZ803088)的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析及 CRISPR/Cas9载体构建。结果显示,SpSBP1基因的cDNA全长为1 176 bp,包含92 bp的5'非编码区和163 bp的3'非编码区,其最大开放阅读框为921 bp,编码306个氨基酸。蛋白结构域分析显示,SpSBP1蛋白包括Smc超家族结构域以及RING finger和Zinc finger结构域。蛋白同源序列比对及系统进化树分析显示,马铃薯野生种SpSBP1与马铃薯野生种ScSBP1的同源性最高,其次为花烟草。生物信息学分析显示,SpSBP1分子质量为34.731 44 ku,理论等电点pI为5.10,推测得出该蛋白为酸性不稳定亲水性蛋白。二级结构预测该蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲所构成。同时该蛋白属于非分泌蛋白且不存在跨膜结构。从二倍体马铃薯野生种中克隆出了SpBP1基因,同时成功构建了CRISPR/Cas9载体,并进行了遗传转化试验。

为了探析GhERF105-like在棉花色素腺体发育或棉酚代谢中的功能,利用RT-PCR技术克隆了中棉所12的GhERF105-like基因,并进行了生物信息学分析及表达模式分析。结果显示,GhERF105-like编码区为711 bp,编码236个氨基酸。GhERF105-like蛋白分子质量为26.3 ku,理论等电点pI为 7.72;二级结构预测存在22.88%的α-螺旋、13.14%的延伸链、3.81%的β-转角和60.17%的无规则卷曲。GhERF105-like在第91—155位氨基酸处存在1个AP2结构域,预测有2个苏氨酸、1个酪氨酸和1个丝氨酸磷酸化位点位于AP2结构域内。系统进化分析表明,GhERF105-like及其同源蛋白基序组成在不同物种中保守程度较高,GhERF105-like与黄褐棉、达尔文氏棉、雷蒙德氏棉、海岛棉中同源蛋白的基序组成一致。GhERF105-like在有腺体棉中棉所12各个组织中的表达均显著或极显著高于无腺体棉中棉所12显性无腺体;GhERF105-like在不同有腺体棉品种/系叶片中的表达量不同,且均显著高于显性或隐性无腺体棉品种/系。GhERF105-like受ABA、BR诱导显著上调表达,但在MeJA、Eth、NaCl和PEG处理下显著或极显著下调表达。综上所述,GhERF105-like与棉花色素腺体发育密切相关,可能通过ABA、BR、Eth和JA通路调控腺体发育或棉酚代谢。

非生物胁迫如干旱、土壤盐碱化等严重影响着农作物的生长发育,农作物产量明显受限。大豆GmRPK2基因与拟南芥抗逆基因AtRPK1高度同源,为探究其抗逆功能和作用机理,构建了GmRPK2基因过表达载体并转化拟南芥筛选获得纯合体。抗逆性检测结果表明,在高盐、PEG和ABA处理下,GmRPK2过表达拟南芥种子的萌发率显著低于野生型,其幼苗阶段根的生长量也明显小于野生型。成株阶段抗逆性检测表明,盐、旱胁迫下过表达拟南芥的生长受抑现象更为明显。为探究其抗逆性降低的内在机理,对GmRPK2过表达拟南芥进行了生理指标检测。结果表明,高盐胁迫后其叶绿素含量明显低于野生型,其丙二醛和电导率则明显较高,DAB染色比野生型更深;旱胁迫后过表达拟南芥的脯氨酸和可溶性糖含量明显较低,失水率明显较高。荧光定量PCR检测发现,GmRPK2基因在拟南芥中过表达后明显抑制了SAD1、P5CS1和ADH1的表达。因此,GmRPK2基因可能通过抑制CDPK抗逆信号转导通路、降低脯氨酸积累和减弱ABA信号传导通路影响拟南芥的抗逆性。

糖基转移酶Ⅰ(GT Ⅰ)家族是糖基转移酶中的一类,其主要功能涉及黄酮类化合物糖基的转移、淀粉和蔗糖的合成等。为揭示GTⅠ基因家族在粳稻生长发育以及抗逆中的作用,为粳稻GTⅠ基因家族成员的功能研究提供基础,为水稻的品种改良和提高水稻耐高温提供思路,采用生物信息学方法鉴定出30个GTⅠ基因家族成员,并分析了粳稻GTⅠ基因家族成员的基因结构、蛋白质理化性质、染色体定位及基因进化、系统发育关系、保守结构域和蛋白质三维结构建模等。结果显示,粳稻的30个GT Ⅰ基因家族成员在水稻12条染色体上均有分布,其基因结构、保守基序和遗传进化相对保守,家族成员启动子均预测到脱落酸响应元件,家族蛋白质的三维结构保守含有6个β-折叠和7个α-螺旋。通过转录组数据与实时荧光定量分析,GTⅠ基因家族大部分成员对高温胁迫的响应出现在高温处理后第6小时,其中OS-GT29表达量呈持续高表达。GTⅠ基因家族在拟南芥和粳稻功能存在相似。

为分析陆地棉一个低毒Bt基因转化事件的特点,采用特异引物对该Bt基因进行鉴定。结果表明,该Bt基因片段大小拟合美国 Bt 抗虫基因设计引物的特征片段长度 310 bp,显示该种质系所含的Bt基因为美国抗虫基因。利用该种质系与海岛棉胜利1号配置杂交组合,其杂交F₁中Bt基因呈显性表达,分离F₂群体中有Bt、无Bt基因个体数拟合3∶1的理论分离比例,结果显示,该Bt基因是受1对显性基因控制的质量性状,即该外源基因以单位点方式插入陆地棉受体。而后采用海陆杂交F₂群体,以SSR分子标记对低毒Bt基因进行染色体定位,结果显示,它位于棉花第10号染色体上,共有14对引物与目的基因相连锁,分别是SSR标记NAU5166、NAU3574、NAU456、BNL256、cgr6745、cgr5406、cgr6546、NAU7110、HAU3201、BNL1665、dPL0468、NAU5316、BNL2960、NAU3122。Bt基因位于分子标记NAU7110和HAU3201之间,其遗传距离分别为0.9,4.4 cM。

为了进一步分析粉红单端孢中TrPLD家族基因的生物学特性和在致病过程中的表达特性,通过对粉红单端孢全基因组测序得到的4个TrPLD基因,利用SMART、MEGA 7、ProtScale、SOPMA等软件对TrPLD基因家族进行生物信息学分析;应用RT-qPCR技术分析粉红单端孢在模拟侵染甜瓜果实过程中不同TrPLD基因的表达情况。系统发育树分析表明,TrPLD1与炭疽菌亲缘关系最近,同源性为63.89%;TrPLD2与淡紫拟青霉同源性为74.57%;TrPLD3和TrPLD4分别与禾谷镰刀菌和铜绿假单胞菌亲缘关系最近,同源性分别为65.38%和55.45%。生物信息学分析表明,TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白均具有PLD的2个保守结构域HKD基序,除HKD结构域外,TrPLD3还包含PX和PH结构域,且4种蛋白均属于亲水性不稳定蛋白,不含信号肽和跨膜结构,属于非分泌蛋白,4种蛋白包含不同数量的磷酸化位点,其中TrPLD3包含的数量最多;通过亚细胞定位预测发现,TrPLD1和TrPLD3主要定位于细胞核上,TrPLD2和TrPLD4主要定位于质膜上;RT-qPCR分析表明,在粉红单端孢模拟侵染甜瓜果实过程中,以CK表达量为对照,TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的基因表达量随侵染过程的发生显著上调,其中TrPLD3基因表达量显著高于TrPLD1、TrPLD2和TrPLD4。综上表明,4个TrPLD具有不同的结构和生物学功能,其中,TrPLD3在粉红单端孢侵染甜瓜果实过程中发挥重要的调控作用。

为了探究陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1在棉花黄萎病反应中的生物学功能,为棉花黄萎病抗性基因挖掘及抗病育种奠定基础,通过转录组筛选,克隆获得一个细胞色素P450基因GhP450-94C1,利用生物信息学的方法分析该基因的理化性质,通过荧光定量PCR技术分析GhP450-94C1在黄萎病侵染下的表达模式,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步探究其在棉花抗黄萎病反应中的生物学功能。结果表明,克隆获得一个陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1,其开放阅读框(ORF)为1 503 bp,编码一个含500个氨基酸的酸性、亲水、不稳定的跨膜蛋白,分子式为C₂₅₉₇H₄₀₂₅N₆₉₁O₇₂₅S₂₂,分子质量为57.23 ku,定位于内质网膜,含有一个P450结构域;有86.45%的概率存在信号肽;二级结构预测显示,该蛋白含有24个α-螺旋和8个β-折叠;该基因响应黄萎病菌侵染,抑制其表达后植株对黄萎病菌的敏感性增强。初步证明GhP450-94C1是棉花黄萎病抗性反应的一个正向调控因子。

AtTUF基因编码液泡膜H⁺-ATP 酶的E1亚基,与跨液泡膜的物质运输密切相关。为了探明拟南芥AtTUF基因的组织表达特征及基因表达调控的分子机制,为AtTUF基因启动子的利用及AtTUF基因表达调控特征的深入研究提供理论依据,以哥伦比亚野生型拟南芥为材料,通过PCR扩增AtTUF的启动子(pAtTUF)序列,利用网站PlantCARE和PLACE预测其顺式作用元件,构建由其驱动半乳糖苷酶基因(Glucuronidase,GUS)的植物表达载体pBI121-pAtTUF,转化拟南芥获得转基因株系,通过GUS染色分析AtTUF启动子的组织表达模式及其对激素与逆境胁迫的响应特征,并对AtTUF在不同组织中的表达进行定量分析。结果表明,成功克隆到AtTUF基因开放阅读框上游2 000 bp的启动子序列,其中含有多个响应光信号、脱落酸(ABA)、生长素、茉莉酸甲酯(MeJA)及干旱信号的顺式作用元件;转基因株系的GUS染色结果显示,AtTUF启动子驱动的GUS在拟南芥幼苗的叶与根中,成苗期的莲座叶、主茎、茎生叶、萼片、花瓣、花药、花粉粒、柱头、幼嫩角果及发育期种子中均有表达,而在幼苗期胚轴、成苗期的莲座叶侧枝、成熟期角果及种子中未检测到表达;且其表达受ABA、吲哚乙酸(IAA)、盐、暗处理及PEG的抑制,这与其含有多种光调控元件、激素调控元件及非生物胁迫响应元件相一致。实时荧光定量PCR结果显示,AtTUF在根、茎、叶、花、角果及种子中均有表达,尤以发育期角果中表达量最高,在花与干种子中表达量也较高,根中表达量最低。综上可知,AtTUF基因在植物各器官(尤其是生殖系统)的生长发育及响应ABA、IAA、盐、光及干旱信号的过程中均发挥着重要作用。

鉴定抗病基因并培育抗病棉花品种是目前根治棉花黄萎病的最好方法。利用MEGA 5.2等相关软件,构建棉花抗病相关基因WRKY7与拟南芥和水稻中抗病相关WRKY基因编码蛋白系统进化树。通过亚细胞定位技术、病毒诱导基因沉默技术、qPCR及GUS报告系统分析等技术,阐明GhWRKY7基因对大丽轮枝菌的诱导响应及其机制。结果表明:GhWRKY7和AtWKRY7高度同源,同属于Ⅱ类;GhWRKY7定位于植物细胞核内,其在棉花叶和根器官中的相对表达量显著高于茎;GhWRKY7基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导,在浸染24 h后呈显著上调。沉默GhWRKY7基因棉花对大丽轮枝菌抗性下降;和对照植株(表达TRV空载体植株)相比,接菌后沉默植株中GhPR1、GhPR3、GhPR4、GhPR5、GhPDF1.2、GhPAL1和GhCYP71B36等抗病相关基因的表达水平也显著下调,暗示GhWRKY7通过调控抗病相关基因的表达来提高植株的抗病性。构建GUS报告载体在烟草细胞中瞬时表达分析,揭示GhWRKY7基因能特异地结合GhCYP71B36启动子顺式元件,转录激活下游GhCYP71B36表达,从而提高棉花的抗病性。综上所述,GhWRKY7作为一个正调控棉花抗黄萎病的转录因子,参与如植保素Camalexin合成等下游抗病相关基因的表达,从而提高植株的抗病性。因此,GhWRKY7可以作为棉花抗病育种的候选基因,为棉花生产提供安全保障。

旨在制备禽白血病病毒p27蛋白多克隆抗体和建立一种简便准确的禽白血病病毒的检测方法,通过扩增禽白血病病毒p27目的基因,构建pGEX-6p-1-p27、pET-32a-p27蛋白原核表达载体。将蛋白分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,制备鼠源多克隆抗体和兔源多克隆抗体,制备鼠源多克隆抗体偶联荧光微球,利用三维喷点平台将鼠源多克隆抗体IgG喷涂到样品垫;用划膜仪将纯化后的兔源多克隆抗体IgG和山羊抗兔抗体稀释液划到NC膜上,作为T线和C线,进行试纸条的组装,初步建立了即时检验荧光微球免疫层析检测ALV试纸法,并用POCT试纸条检测临床阳性样本。结果表明:成功构建pGEX-6p-1-p27、pET-32a-p27蛋白原核载体并诱导p27重组蛋白表达。将纯化后的p27融合蛋白与佐剂等容量混合后作为免疫原免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,成功制备出p27蛋白的鼠源和兔源多克隆抗体,通过血清效价以及Western Blot鉴定显示多抗的免疫原反应良好。荧光微球偶联鼠源多克隆抗体的最适pH值为6.2。POCT试纸条检测结果显示,ALV的阳性样品与荧光微球包被的鼠源多克隆抗体结合良好,T/C数据比其他样本高,且仅有阳性样本和荧光微球包被的鼠源多克隆抗体结合后,在紫外灯的照射下,C线(质控线)和T线(检测线)才均会有荧光条带,与临床诊断结果相符。试验建立的POCT荧光微球免疫层析检测ALV的方法,可为禽白血病病毒的检测提供一种更为简便的方法,为基层兽医临床检测提供便利。

旨在克隆牦牛驱动蛋白家族成员2A基因 (KIF2A),探究其在牦牛不同组织中的表达模式,以及在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达规律,以3~4岁健康、未妊娠母牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、子宫和卵巢组织(n=5)为研究材料,使用RT-PCR技术获得KIF2A基因的编码区序列(CDS),运用MEGA 7.0、SWISS-MODEL等软件分析其生物学特性。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测KIF2A在牦牛各组织中的表达水平;采用免疫组织化学技术分析KIF2A在牦牛不同直径卵泡中的表达模式及定位。将卵泡按照直径的大小分为3组:小(1.0~2.9 mm)、中(3.0~5.9 mm)、大(6.0~9.0 mm)卵泡;RT-qPCR检测KIF2A基因在不同发育时期卵泡中颗粒细胞、卵母细胞减数分裂3个关键时期的表达特性。结果显示,KIF2A基因序列长为1 964 bp,其中CDS为1 530 bp,编码509个氨基酸,KIF2A蛋白总体带负电,属于疏水性蛋白。KIF2A基因在牦牛各组织中广泛表达,牦牛KIF2A蛋白主要定位于颗粒细胞,且伴随着卵泡的生长发育其在不同直径大小卵泡颗粒细胞中mRNA表达量呈上升趋势。在牦牛卵母细胞成熟过程中,KIF2A基因的表达具有时序特征,其mRNA的表达量呈下降趋势,GⅤ期显著高于MⅠ期和MⅡ期。综上所述,KIF2A可能参与调控牦牛卵泡发育和卵母细胞的成熟过程。

旨在分析不同比例花椒籽替代部分玉米饲喂三元杂交育肥猪不同组织FABP2的差异表达,寻找肌内脂肪沉积的关键基因;同时克隆三元杂交育肥猪FABP2编码区序列,并用生物信息学方法对其进行分析。选取288头90日龄杜×长×大三元杂交育肥猪(33 kg),随机分为4组,每组4个重复,每个重复18头猪;对照组饲喂基础日粮,试验组分别用花椒籽代替饲粮中2.5%(试验Ⅰ组),5.0%(试验Ⅱ组),7.5%(试验Ⅲ组)的玉米,预试验7 d,正试期100 d。采用qRT-PCR检测试验组不同组织中FABP2的相对表达量,同时克隆三元杂交育肥猪FABP2编码区,利用生物信息学分析软件,预测FABP2蛋白理化性质、结构域和磷酸化激酶位点等。结果表明:FABP2在各组织中均有不同程度表达,其中空肠和肝脏中FABP2显著高表达。与对照组相比,各试验组心脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠和盲肠组织中FABP2显著下调表达;试验Ⅱ组和试验Ⅲ组脾脏和回肠组织中FABP2显著上调表达;试验Ⅰ组肝脏、结肠、直肠和背肌组织中FABP2显著上调表达,说明饲粮中添加花椒籽对三元杂交育肥猪FABP2基因的表达谱具有显著影响。成功克隆并鉴定出三元杂交育肥猪FABP2编码区全长(399 bp),编码132个氨基酸,存在2处错义突变;FABP2蛋白是一种酸性稳定的非分泌蛋白,二级结构主要由延伸链和无规则卷曲构成,含有一个Lipocalin-FABP2超家族保守结构域和3个无序化区域。

为了进行苗期转ScALDH21基因棉花的耐盐性鉴定。以新农棉1号的T₄转ScALDH21基因棉花株系为研究材料,分别在大田条盆及温室盆栽条件下进行试验。大田条盆试验中,分别统计0.4%,0.5%,0.6%盐土栽种下转ScALDH21基因与受体棉花的叶绿素含量和存活率,并测定其净光合速率、气孔导度、蒸腾速率及瞬时水分利用效率;室内盆栽试验中,分别统计NaCl(150 mmol/L)和清水处理下不同棉花株系MDA、POD、木质素、Na⁺、K⁺及Na⁺/K⁺值。结果表明,在盐胁迫条件下,与受体棉植株相比,转ScALDH21基因棉株的存活率上升,叶绿体含量增加,净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及瞬时水分利用效率均提高;MDA含量降低,POD活性上升,木质素含量增加。从形态及生理指标层面验证了转ScALDH21基因棉花在苗期提高了植株的耐盐性。

为了探究影响花生种皮颜色的关键代谢物及花青素合成酶(ANS)基因,以5种不同种皮颜色的花生品种(系)为材料,对其种皮中花青素代谢物组成、ANS家族基因的表达及其相关性进行分析。结果显示,在5个花生品种(系)种皮中检测到3大类,共19种花青素糖苷类物质,其中黑种皮中最多为17种,白种皮最少仅为4种,表明随着种皮颜色的加深,花青素糖苷类物质种类也逐渐增多。对5个ANS基因表达分析,结果显示,仅有Ahy_Scaffold1g106620的表达量较高,其他4个基因基本不表达或表达量较低。且Ahy_Scaffold1g106620随着种皮颜色加深,表达量显著升高,推测Ahy_Scaffold1g106620是调控花青素合成的关键基因。进一步相关分析结果显示,Ahy_Scaffold1g106620与19种糖苷物质中的12种呈现显著正相关,相关系数为0.54~0.82;而Ahy_A02g006729仅与3种花青素类糖苷物质呈现显著相关性,其他3个基因与种皮中花青素类物质含量无关,结果表明,Ahy_Scaffold1g106620是ANS家族中影响花青素物质积累的关键调控基因。以上研究结果初步发现了影响多彩花生种皮颜色的主要代谢物及ANS家族中关键的调控基因。

为了明确大豆中4个参与豆科植物由根瘤菌侵染到根瘤形成和固氮的所有生物过程,并整合结瘤和结瘤自调控信号动态控制根瘤数目的核心转录因子(NIN)基因异同及其在植物生长过程中的作用,利用生物信息学的方法,对大豆4个GmNINs基因进行了系统进化、蛋白序列分析及基因序列和启动子分析,并利用Real-time PCR进行了组织表达模式验证。结果表明,大豆中4个GmNINs蛋白均属于豆类植物中特异的NIN蛋白家族,定位在细胞核,序列相似,且均具有多个磷酸化位点,蛋白核心三级结构类似而在转角处有较大区别。以上结果说明,大豆4个GmNINs蛋白可能在核心功能上是冗余的,而又在具体的表达模式上具有差异性。对GmNINs基因ATG上游-3 kb启动子序列分析表明,GmNINs启动子序列中除NBS、CYC元件外,还含有如ABRE、DRE1等多种与逆境和激素响应相关的元件。转录组分析及Real-time PCR结果显示,4个GmNINs基因均在根瘤中高表达,并受到高氮环境抑制;均可不同程度的响应高盐与干旱胁迫,其中GmNIN2a与GmNIN2b在响应非生物胁迫上较GmNIN1a与GmNIN1b更加敏感与显著,可能在植物响应非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。综上所述,结果揭示了GmNINs除了调控大豆结瘤及根瘤数目外,还参与了大豆根系响应非生物胁迫的过程,这一调节机制的发现为选育优质高产大豆新品种提供关键线索。

传统的分子标记辅助育种技术只对含有大效应基因的性状有效,很难对受微效多基因控制的数量性状进行遗传改良。后来于2001年出现的全基因组选择技术利用高密度分子标记对个体的育种值进行估算,能获得很高的预测准确性,有效解决了微效多基因控制下的复杂性状改良的难题。该技术现已被美国、加拿大、澳大利亚、德国和法国等成功应用于奶牛、猪、羊、玉米、小麦等动植物数量性状的遗传改良,是对传统育种技术的重大革新,也是目前研究与应用的热点。综述了影响全基因组选择准确性的因素和该技术在国内外玉米、小麦、水稻和油菜育种研究中的进展,最后讨论了该技术在应用中存在的问题,以期为未来的作物全基因组选择育种提供参考。

硝态氮是植物吸收氮素的2种主要形式之一,硝酸盐转运蛋白2(NRT2)在土壤中硝酸盐缺乏时发挥主导作用。为探究藜麦NRT2基因家族的特征和表达模式,利用生物信息学方法,对藜麦NRT2基因进行全基因组鉴定,并分析了其编码蛋白、染色体定位、基因结构、系统进化、顺式作用元件、组织表达特异性以及不同氮素水平处理后基因的表达模式。结果表明,藜麦中有15个NRT2基因,分布在7条染色体上,每个成员分别含有1~9个内含子及2~10个外显子,蛋白亚细胞定位预测其均定位在质膜上,为疏水性蛋白。同时,系统进化分析显示,藜麦NRT2蛋白家族属于2个亚家族,与拟南芥的亲缘关系更近。顺式作用元件分析显示,藜麦NRT2家族成员启动子区存在大量与生长发育及逆境胁迫等相关的顺式作用元件。藜麦NRT2基因家族成员在不同组织器官中的表达存在差异,在根、茎、叶中表达量较高。在低氮条件下,藜麦NRT2.4、NRT2.7、NRT2.15表达上调;0,25%N处理后藜麦NRT2.7、NRT2.15的表达量急剧增加。研究结果可为后续藜麦NRT2s基因克隆和功能以及氮素胁迫分析提供参考依据。