盐碱胁迫已成为制约我国农业生产的重要因素之一,探索农作物耐盐分子机理,对作物育种具有重要的理论价值和实际应用价值。旨在克隆玉米中的ZmMPI基因,转化玉米植株。首先通过qRT-PCR对盐碱溶液处理下植株中的ZmMPI表达量变化进行分析,之后利用DNAMAN软件对ZmMPI蛋白序列进行多重比较分析同时利用MEGA 7.0软件构建系统发生树,并利用一系列软件对ZmMPI进行生物信息学分析。最后利用分子克隆技术,成功克隆ZmMPI基因的编码序列,构建植物过表达载体并利用农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米自交系B104,在基因组水平、转录水平以及蛋白质水平对过表达转基因植株鉴定,分析其表达量变化。结果表明,ZmMPI基因的表达量受盐碱胁迫后整体呈现出先上升后下调的趋势;ZmMPI蛋白序列比较结果相似率为64.15%,系统发生树显示,ZmMPI与玉米(小颖大刍草亚种) ABA34115.1同源性最高,该蛋白含有一个蛋白结构域Potato_inhibit,有α螺旋结构、无规则卷曲结构和β转角结构,偏疏水性,预测潜在的磷酸化位点有10个;对获得的49个转化事件鉴定结果显示,其中有13个过表达转基因株系中的ZmMPI基因在基因组水平能正常表达,有10个过表达转基因株系中的ZmMPI基因能正常转录、翻译。最终获得10个能够正常转录翻译的过表达转基因株系,为进一步探究ZmMPI基因响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。

干旱胁迫对玉米生长发育造成严重影响,从而导致玉米产量降低。紫色酸性磷酸酶是一种参与植物多种生理生化功能的磷脂酶蛋白,为进一步深入研究紫色酸性磷酸酶家族基因在玉米抗逆过程中的作用,探究了ZmPAP26b基因在干旱胁迫下响应模式,利用实时荧光定量分析模拟干旱条件下不同玉米自交系中的基因相对表达量;从玉米中克隆ZmPAP26b(GenBank:NC_050104.1),并对玉米、拟南芥、水稻、小麦、高粱和二穗短柄草中的PAP基因进行鉴定和生物信息学分析;同时构建原核过表达菌株进行功能验证。结果表明,干旱胁迫下该基因在耐旱材料中表达量下降,干旱敏感材料中表达量上升。该基因CDS全长1 431 bp,编码476个氨基酸。在6个物种中共发现228个PAP基因,系统发育分析发现,共分成4个亚家族。玉米中的19个PAP基因分布在9条染色体上并且具有相似的保守结构域,启动子顺式作用元件分析显示含有响应干旱和激素等元件。原核表达试验发现,含有重组质粒pET28a-ZmPAP26b的菌株在10%PEG-6000和15%PEG-6000模拟干旱胁迫下的生长与空载菌株都受到了抑制。综上所述,推测ZmPAP26b在干旱胁迫下呈负调控模式。

为探究尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)在不同花色绿绒蒿中的序列特征及其与绿绒蒿花色的关系,以黄色花的全缘叶绿绒蒿和红色花的红花绿绒蒿为研究材料,从2种花色绿绒蒿的全长转录组数据中各筛选1个UGT基因,根据转录组KEGG注释结果,将这2个基因分别命名为MiUGT79B1和MpUGT79B1,并对其进行克隆、生物信息学及RT-qPCR分析。结果表明:MiUGT79B1和MpUGT79B1基因ORF长度为1 314,编码437个氨基酸。MiUGT79B1和MpUGT79B1蛋白的结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,属于亲水性稳定蛋白。系统进化树和多序列比对分析发现,MiUGT79B1和MpUGT79B1与鸦片罂粟、火罂粟、野罂粟和博落回的亲缘关系最近。RT-qPCR分析显示,MiUGT79B1和MpUGT79B1均在花蕾期高表达,MiUGT79B1表达趋势为先降低后升高,MpUGT79B1表达趋势为先降低后保持平缓。2种花色绿绒蒿UGT基因表达水平与总黄酮累积模式均呈显著正相关。结果为进一步深入研究MiUGT79B1和MpUGT79B1基因在绿绒蒿花瓣呈色中的功能及其花色分子育种提供理论基础。

红花玉兰是我国特有的珍稀园林观赏树种,其花色变异类型极为丰富,有深红、粉红和白色等一系列的花色变异品种,然而其花色调控的分子机制目前仍不清楚。为探究红花玉兰花色调控的分子机制,以不同色系的红花玉兰为试验材料,克隆获得了红花玉兰的花色调控关键候选基因MawuCPC,对其开展了系统进化分析、氨基酸序列结构分析、亚细胞定位试验、酵母双杂交试验、荧光素酶试验,并通过实时定量PCR比较分析了不同花色品种间MawuCPC的表达水平。结果表明,红花玉兰的MawuCPC基因编码区长度为258 bp,共编码85个氨基酸;系统进化分析显示,MawuCPC与拟南芥以及其他物种的CPC类成员共聚于同一进化分支,进一步支持了MawuCPC属于红花玉兰的CPC家族成员;序列结构分析进一步显示,MawuCPC蛋白仅具有1个保守的R3结构域和1个bHLH结合基序。亚细胞定位试验结果表明,MawuCPC蛋白特异性地定位于细胞核内。酵母双杂交和荧光素酶试验显示,MawuCPC和MawuPAP1均可以与红花玉兰的bHLH家族蛋白MawubHLH1发生相互作用,且MawuCPC与MawubHLH1的结合能够严重抑制MawuPAP1和MawubHLH1对结构基因MawuDFR启动子的表达增强作用。实时定量PCR结果显示,MawuCPC在红花玉兰白花系品种JB中表达水平最高,在粉花系品种娇艳中表达次之,在红花系品种娇红1号中表达最低。以上结果表明,在红花玉兰中,MawuCPC可能同样是通过与PAP1/2类蛋白竞争结合bHLH蛋白来发挥其花色调控的作用,且可能正是由于该基因的表达水平差异促使红花玉兰产生了极其丰富的花色变异类型。

摘要:四倍体小麦是普通小麦的祖先种,也是重要的粮食作物。发掘四倍体小麦抗病种质并鉴定其携带的抗病基因,旨在为小麦新品种选育提供新抗源。TDI-1是栽培二粒小麦,在多年的田间种植过程中表现出对白粉病免疫的表型。为了确定TDI-1携带的抗病基因,为小麦白粉病抗性遗传提供理论依据,首先将其与表现为感白粉病表型的硬粒小麦TDU-1进行杂交并构建了遗传群体,然后对亲本及其杂交F₁、F₂、F_2:3群体进行了白粉菌小种E09接种试验和抗病性分析,最后利用混合分离群体分析法(BSA)对抗白粉病基因进行了定位。结果表明,TDI-1在苗期对E09表现为感病,在成株期对E09表现为抗病;TDI-1和TDU-1的F₁植株在成株期对E09表现为抗病;F₂群体中,表现为抗病的单株数和感病的单株数的比例符合3:1($χ_{3:1}^{2}$= 0.11,P=0.74);F_2:3家系中,纯合抗病、抗病性分离、纯合感病的家系数目之比符合1:2:1($χ_{1:2:1}^{2}$= 0.47,P=0.79),表明TDI-1成株期白粉病抗性由1个显性基因控制,暂将其命名为PmTDI-1。对TDI-1和TDU-1及其杂交后代F₂群体进行分子标记筛选,发现4个位于2A染色体短臂上的分子标记Xwmc407、NRM-2AS29、NRM-2AS45和NRM-2AS84与PmTDI-1紧密连锁,其中,NRM-2AS45和NRM-2AS84位于两侧,遗传距离分别为1.8,4.6 cM。由此,将成株期抗白粉病基因PmTDI-1初步定位于2A染色体短臂上。研究结果显示,从四倍体小麦TDI-1中鉴定到1个新的显性成株抗白粉病基因PmTDI-1。

未知功能域668(DUF668)家族是植物中一个功能尚不清楚的家族。为了解玉米DUF668基因家族成员及其特征,运用生物信息学方法对ZmDUF668基因家族进行鉴定分析。结果表明,玉米8条染色体上共分布19个ZmDUF668基因,分别命名为ZmDUF668-1~ZmDUF668-19;ZmDUF668蛋白以碱性蛋白为主,且大部分成员定位于细胞核、细胞质和叶绿体中。多物种系统进化树将19个ZmDUF668家族蛋白成员分为2个亚组;19个ZmDUF668中鉴定出10种蛋白保守基序,所有成员都含有Motif 1和Motif 5;通过对蛋白保守域分析发现,19个成员中有14个不仅含有DUF668结构域还含有DUF3475结构域;基因结构分析表明,同一亚群中成员基因结构相似。根据共线性分析可知,13个ZmDUF668基因与10个OsDUF668组合形成21种共线性关系。ZmDUF668顺式作用元件分析发现,家族成员启动子区域分布着光响应、植物激素及非生物胁迫相关作用元件。蛋白质互作网络(PPI)预测结果表明,ZmDUF668家族蛋白中只有ZmDUF668-10与其他蛋白存在互作关系。通过RNA-Seq数据分析发现,ZmDUF668基因家族部分成员在受到冷、热、盐胁迫和紫外处理下基因表达量明显变化,实时荧光定量PCR试验验证了ZmDUF668家族部分成员在冷胁迫和热胁迫下的响应。研究主要是将生物信息学运用于对玉米DUF668基因家族的分析,揭示了ZmDUF668基因家族成员的特征,为后续研究玉米DUF668家族基因的分子生物学功能提供了理论基础。

克隆东方黏虫C型溶菌酶基因MseLYS,构建MseLYS基因的原核表达载体,检测该基因在东方黏虫不同龄期和组织的表达情况,旨在为探究MseLYS基因的功能和结构提供理论参考,也为进一步研究该基因的抗菌功能和生理机制奠定基础。以东方黏虫为研究对象,通过反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增技术(RACE),获得了溶菌酶基因MseLYS的全长核苷酸序列,之后将去掉信号肽的开放阅读框架(ORF)序列连接到表达载体pET-30a(+)上,并用IPTG进行了诱导表达,最后用荧光定量PCR明确了该基因的时空表达模式。序列分析表明,此基因全长729 bp,ORF全长426 bp,5'和3'非编码区分别为75,228 bp,共编码141个氨基酸残基,其蛋白质的等电点和分子质量分别为7.72,16.13 ku。系统进化树分析结果表明,MseLYS与其他物种的C型溶菌酶聚集在一起,且与其他昆虫的氨基酸序列具有高度一致性,表明MseLYS为C型溶菌酶。SDS-PAGE电泳结果表明,MseLYS在表达菌BL21(DE3)内表达的蛋白质分子质量与预期大小一致,约20 ku,说明MseLYS在大肠杆菌中能够高效表达。龄期表达谱分析表明,MseLYS基因在东方黏虫幼虫、雄虫和雌虫不同发育阶段表达量显著不同,在末龄幼虫、蛹中表达量较高,其他发育时期表达水平较低。组织表达分析结果表明,MseLYS基因在雄虫不同组织表达量存在着显著差异,其中脂肪体和胸内表达量较高;在雌虫不同组织表达量也存在显著差异,其中触角、翅和体壁中表达量较高。综上,成功克隆了东方黏虫C型溶菌酶MseLYS基因的全长序列,构建了该基因的原核表达载体并能够高效表达蛋白质,明确了该基因在不同组织和不同龄期的表达模式。

玉米花丝颜色是玉米特异性和一致性判定的重要农艺性状。为解析玉米花丝花青苷显色性状的遗传机制,以绿色花丝自交系WL134和紫色花丝自交系D7杂交构建的213份DH系群体为研究材料,在2022年和2023年2 a环境下分别进行QTL定位分析。结果表明,花丝花青苷显色性状在不同家系、不同年份之间均存在显著差异,且广义遗传力为0.864。2 a的花丝颜色数据共检测到9个QTLs,分布于玉米的第2,3,5,6,8,9号染色体上,单个QTL的表型贡献率在4.83%~9.26%。在第5染色体上定位到一个稳定的在2 a数据中可重复检测到的位点qSC5,位于19.15~19.80 Mb,2022年检测的LOD值为4.65,贡献率7.22%,2023年检测的LOD值为5.76,贡献率7.17%,为主效QTL位点。与前人的研究比对发现,该位点为调控花丝花青苷显色的新位点。基于qSC5两侧的SNP标记,DH群体中极端紫色花丝家系中90.91%的基因型为CCCC,而绿色花丝家系中该基因型仅占44.00%。该标记与玉米花丝颜色显著相关,可能与调控花丝花青苷显色性状的关键基因连锁。

钙和钾是小麦重要的矿质营养元素,发掘和探索与其含量相关的遗传机制及效应对于人体营养健康具有重要意义。旨在为小麦籽粒矿质元素生物强化育种提供理论基础,以Avocet/Chilero(AC)构建的164份F₆重组自交系(RILs)和以Avocet/Huites(AH)构建的175份F₆ RILs为材料,分析了2个群体在5个环境下籽粒钙(GCa)和钾(GK)含量的表型变异,结合DArT芯片分型结果,共定位到19个与籽粒钙含量相关的QTL,分别位于1A、1D、2A、2B、3A、3D、4A、4B、4D、5A、5B、7A、7B和7D染色体上,解释了3.23%~16.29%的表型变异,同时共定位到23个与籽粒钾含量相关的QTL,分别位于1B、2A、2B、3A、3B、4A、4D、5A、6A、6B和7D染色体上,解释了3.31%~24.66%的表型变异。其中,QGCa.haust-1A、QGCa.haust-AC-5A和QGK.haust-AC-2A.2可在多环境下被定位到,QGCa.haust-1A和QGCa.haust-AC-5A分别解释了表型变异的7.82%~12.72%和9.68%~15.57%,其物理区间为498.67~532.21 Mb和461.52~486.26 Mb,QGK.haust-AC-2A.2解释了表型变异的8.15%~15.20%,其物理区间为354.61~462.37 Mb。通过对3个位点的遗传效应分析可知,分别携带QGCa.haust-1A、QGCa.haust-AC-5A和QGK.haust-AC-2A.2效应位点能有效增加小麦籽粒中的钙和钾含量,聚合效应分析表明,同时携带QGCa.haust-1A效应位点和QGCa.haust-AC-5A效应位点的株系钙含量极显著高于仅携带单一位点的株系。综上,在1A、2A和5A染色体上定位到3个与籽粒钙和钾含量相关的稳定主效位点,其显著提高了小麦籽粒钙和钾含量。

转录因子BnHY5-2与植物抗逆性相关。为揭示甘蓝型油菜转录因子BnHY5-2对盐碱胁迫的响应,主要通过瞬时转化过表达、qRT-PCR分析、亚细胞定位等方法,分析甘蓝型油菜转录因子BnHY5-2对光和盐碱的响应。结果表明,光照处理油菜后,在叶与茎中BnHY5-2基因的表达量均显著高于黑暗条件下,分别为黑暗条件下的29.22,3.15倍,叶片对光的敏感性大于茎,说明叶片是响应光转录因子BnHY5-2的主要部位。在光照条件下应用大连滨海盐碱土种植油菜,处理后BnHY5-2的表达在叶和茎中均显著下调,分别下调53.1%,31.0%;在黑暗条件下应用盐碱处理后BnHY5-2的表达在茎中下调48.2%,而在叶中的表达差异则不显著,表现出器官的差异性,说明叶片对光照条件要求更加严格。在油菜叶片中瞬时过表达BnHY5-2基因时,6个与盐碱相关的候选基因的表达中,有2个(BnNAC32、BnGS)上调表达,分别为原来的1.25,3.28倍;而有4个(Bnamy、BnAsp、BnNHX7、BnTPS)下调表达,分别下降24.8%,25.4%,71.0%,82.0%,同时甜菜碱含量由0.256 mg/g提升至0.573 mg/g,提高了1.24倍,说明过表达BnHY5-2基因会提高油菜的盐碱抗性。亚细胞定位结果显示,转录因子BnHY5-2定位于细胞核中,调控功能基因的表达。因此,BnHY5-2不仅与光信号有关,还参与油菜盐碱抗性。

为促进甘蓝型油菜抗倒伏品种的培育,挖掘甘蓝型油菜茎秆抗倒伏的基因资源,以4份抗倒伏和3份易倒伏种质为材料,取其盛花期下部茎秆测定纤维素、半纤维素、总果胶、原果胶和木质素等5种组分的含量,并对YLS0084(抗倒伏)和YLS1691(易倒伏)的下部茎秆进行转录组测序分析。结果发现,抗倒材料的纤维素和总果胶平均含量极显著高于易倒伏材料;转录组分析共挖掘到7 397个表达量上调和9 438个表达量下调的差异表达基因,这些差异表达基因富集在碳水化合物代谢、翻译、氨基酸代谢和信号转导等通路;通过qRT-PCR验证了9个与油菜抗倒伏相关的基因(BnaA01G0071800ZS、BnaA01G0175700ZS、BnaA01G0205800ZS、BnaA03G0404800ZS、BnaA03G0517200ZS、BnaA05G0431400ZS、BnaA07G0056300ZS、BnaA09G0031300ZS和BnaC05G0128400ZS)在YLS0084中显著上调表达。研究结果证明了甘蓝型油菜茎秆中纤维素和总果胶的含量对抗倒伏起积极作用,并为甘蓝型油菜抗倒伏提供了一定的重要基因资源。

大豆荚皮的颜色是重要的驯化性状和表型特征,与炸荚习性和躲避捕食关系紧密。大豆荚皮颜色主要由2对等位基因控制,其中棕色荚皮L2基因尚未被鉴定。为了在大豆基因组上对该基因进行鉴定,为大豆棕色荚皮相关基因功能解析和育种应用提供一定的理论基础。以栽培大豆中龙优203(黄色荚皮)和野生大豆FF1235(黑色荚皮)为亲本构建F₂分离群体进行遗传分析。利用F₂群体棕色豆荚和黄色豆荚单株构建混池进行BSA-seq定位分析,并在此基础上进行重组交换单株分析。结果表明,大豆棕色荚皮性状为1对等位基因控制的质量性状。棕色荚皮L2基因关联区域位于3号染色体0~0.75 Mb的区段。进一步开发InDel分子标记进行精细定位,获得具有多态性的InDel引物7对。最终将棕色荚皮位点定位于3号染色体上的Indel-L2-3 ~Indel-L2-6,物理距离为344 kb。定位区间内共有候选基因32个,其中Glyma.03G005700基因注释为异丙基苹果酸聚合酶,与已发现的黑色荚皮基因L1(Glyma.19G120400)高度同源,其功能为将4-羟基丙酮酸转化为红果酸和番石榴酸,可能是调控大豆棕色荚皮形成的关键基因。

在植物中,磷脂酰肌醇 4,5-二磷PIP5K基因家族中的PIP5K2基因在调控植物生长中起到了关键作用,为探明PIP5K2基因在蓖麻中的作用,以蓖麻PIP5K2基因为研究对象,对该基因进行基因克隆、生物信息学及表达分析。结果表明,以蓖麻cDNA为模板,通过PCR获得了长度为2 136 bp 的基因片段;通过对该基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析,确定该PIP5K2基因编码的蛋白氨基酸的个数为 672,pI 值为 6.74,其分子质量为 76.47 ku,平均亲水性系数为-0.636,是一种亲水蛋白质,其二级结构包括α螺旋、β转角、延伸链、无规卷曲;由预测结果可知,PIP5K2蛋白的三级结构与二级结构是一致的且与麻风树同源性很高。PIP5K2 基因在单雌、标雌和两性系3种花序类型的五叶期时的相对表达量都普遍高,在主茎穗开花期相对表达量都普遍偏低;在标雌花序五叶期时有最高相对表达量,在两性花序的主茎穗开花期有最低相对表达量,最高相对表达量是最低相对表达量的 80 倍左右;在3种花序类型之间,PIP5K2基因在四叶期的相对表达量相似,但相较于单个花序类型植株的不同生长时期,PIP5K2基因在四叶期时的表达量要明显高于开花期。根据该结果推测,PIP5K2基因可能调控蓖麻植株中期的生长,与植株的矮化存在一定的相关性。

类钙调素蛋白(CMLs)是植物中的Ca²⁺感受器之一,参与植物的生长发育和适应环境变化的过程。为了解大蒜CML的序列特征及其对渗透胁迫的响应,从大蒜品种苍山四六瓣中克隆得到AsCML15和AsCML42基因,并对其在干旱以及盐胁迫条件下的表达模式进行了分析。结果表明,AsCML15和AsCML42基因开放阅读框长度分别为498,543 bp,编码165,180个氨基酸残基。AsCML15和AsCML42分别含有4,3个EF-hand结构域。AsCML42与拟南芥AtCML42和AtCML43在进化关系上更为接近,而AsCML15与拟南芥AtCML15、AtCML16亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,AsCML15和AsCML42在鳞茎、叶片、根都有表达,且均能被200 mmol/L NaCl和15% PEG6000所诱导。AsCML15和AsCML42基因可能参与了大蒜抵御盐胁迫和干旱胁迫的过程,可进一步鉴定其生物学功能。

香菇单核菌丝的杂交受到A和B等2种交配型因子的影响。基于全基因组测序可以对香菇单核菌丝进行交配型鉴定,但存在技术复杂和成本较高的局限。为实现对香菇单核菌丝未知交配型基因的快捷鉴定,以香菇H31和BJ4菌株为材料,采用对交配型位点区域的特异性扩增和重测序的方法,确定了可用于未知交配型基因鉴定的PCR扩增引物。利用菌丝杂交结果确定能够杂交的2种单核菌丝,将其交配型分别记为A1B1和A2B2。根据NCBI获得的A和B交配型位点基因序列的比对分析,在其保守区设计引物,对A1B1和A2B2单核菌丝进行PCR扩增。通过对扩增产物的重测序信息进行比对,获得A1和A2、B1和B2不同交配型基因序列中的非保守区,然后在此区域设计4种交配型基因特异性扩增引物,实现对H31和BJ4香菇单核菌丝交配型基因的鉴定。根据分子水平的交配型鉴定结果,对H31和BJ4香菇单核菌丝分别进行杂交验证。结果表明,交配型基因的分子鉴定结果与单核菌丝杂交结果一致。以香菇为试验材料确立的交配型基因鉴定方法不再依赖于全基因组测序,该方法同样适用于其他食用菌交配型基因的鉴定,因此,研究结果对食用菌的遗传育种具有广泛的应用价值。

铝激活苹果酸转运蛋白(ALMT)是植物中广泛存在的一个基因家族,其编码的蛋白质在调控植物根部酸分泌和对铝离子的响应方面起着重要作用。为了明晰大花绣球无尽夏HmALMT11的序列特征及其在逆境胁迫后的表达特征,进一步探索大花绣球无尽夏的生物学功能,为后续HmALMT11功能鉴定提供理论依据。以大花绣球无尽夏为材料,克隆得到HmALMT11基因,并对其进行生物信息学、亚细胞定位和铝胁迫响应分析。结果表明,HmALMT11包含1个1 590 bp的开放阅读框,编码529个氨基酸,蛋白分子质量为59.1 ku,理论等电点为9.10。为不稳定的碱性蛋白;HmALMT11蛋白含有6个跨膜结构域,定位于细胞质膜;实时荧光定量PCR分析发现,低浓度100 μmol/L和高浓度800 μmol/L的Al₂(SO₄)₃处理都可诱导HmALMT11在无尽夏根、茎、叶中的上调表达,且在根中相对表达量最高,具有明显的组织表达特异性。研究表明,HmALMT11蛋白可能在绣球花适应铝胁迫过程中发挥重要调控作用。

草甘膦是目前使用最广泛的广谱灭生性除草剂,培育耐草甘膦作物将有助于改善农田杂草化学防控效果、减少用药量和简化防控措施。为充分挖掘小麦耐草甘膦基因位点,利用来自黄淮麦区的484份种质资源进行草甘膦耐药性鉴定,根据小麦15K SNP芯片数据,采用全基因组关联分析的方法,挖掘与小麦草甘膦耐药性相关QTL。结果显示,不同年代培育的小麦品种草甘膦耐药性的变化趋势缓慢,草甘膦耐受性未显著提升;根据表型鉴定结果,筛选出黄淮麦区耐草甘膦小麦种质材料3份,即河农130、冀麦782和泰山23号;利用全基因组关联分析方法,检测到与小麦草甘膦耐药等级显著相关的QTL 7个,包含19个显著性SNPs,分布于小麦1A(0.00~30.48 Mb)、1B(6.57~30.57 Mb)、1D(0.00~22.98 Mb)、4A(656.09~680.09 Mb)、5A(508.19~532.19 Mb)、6A(54.56~85.09 Mb)和6D(12.02~36.02 Mb)染色体上;位于小麦1A和6A染色体上的2个QTL qGlyT-1A和qGlyT-6A是小麦耐草甘膦的主效位点,共包含16个可能与小麦耐草甘膦相关的基因。

为了研究PSY1基因在辣椒不同成熟果色形成过程中的作用机理,以Y15016、Y15016-2、SP01、SP02、Z1为材料,克隆PSY1基因并进行时空表达分析,结合部分生物信息学方法,对PSY蛋白功能性质及辣椒不同果色材料中PSY1基因的表达情况进行研究分析。结果表明:5个品种辣椒中均能克隆到PSY1全长基因,且序列无差异;基因结构分析表明,辣椒PSY1基因包含6个外显子、5个内含子,全长为2 844 bp,其CDS全长为1 260 bp,编码419个氨基酸。序列比对和进化树分析表明,辣椒PSY蛋白与同科的番茄、烟草同源PSY蛋白在亲缘关系上最为接近。qRT-PCR分析结果显示:PSY1基因在试验选用的5个品种辣椒根、茎、叶、花组织中均显示表达,在根组织中表达量最低,叶组织中的表达量最高;在橙色突变体Y15016-2的表达量总体高于其在野生型Y15016中的表达量,而在黄色突变体SP02中,其表达量明显低于野生型SP01;在果实不同发育阶段,PSY1基因除Ⅲ期表达有所降低外,其表达量随果实发育总体呈现上升趋势,且在不同果色材料的成熟期(Ⅳ—Ⅴ期)达到最大值。PSY1基因启动子分析结果显示,供试材料中其序列未见差异。结果表明,在不同果色辣椒的果色形成过程中,PSY1基因的差异表达可能起到了较为重要的作用。

为研究TaHis基因对小麦赤霉病的抗性机制,首先克隆了TaHis基因全长编码序列,构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,通过酵母双杂交技术对赤霉病诱导的小麦穗部酵母双杂交文库进行筛选,获得互作蛋白后利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证蛋白质之间的互作,并利用RT-qPCR技术对抗感小麦材料中TaHis互作蛋白的赤霉病诱导表达模式进行分析。结果表明,成功构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,经过酵母双杂交文库筛选后,在四缺选择培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上获得了18个酵母单克隆。测序后Blast分析发现,共获得5个可能与TaHis互作的蛋白质,其中在6个酵母单克隆中均鉴定到富含丝氨酸/精氨酸的mRNA剪接因子SR45a类蛋白(TaSR)编码序列。以百农4299为材料,克隆了TaSR基因全长编码区,并构建了pGADT7-TaSR载体,酵母双杂交试验表明,pGADT7-TaSR和pGBKT7-TaHis共转化的酵母细胞在四缺培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA)上可以生长且显蓝色,表明TaSR和TaHis在酵母细胞中直接互作;构建了YC-TaHis、YN-TaSR载体,双分子荧光互补试验表明,共转化YC-TaHis和YN-TaSR的烟草细胞中产生强烈荧光信号,进一步验证了TaSR与TaHis的互作。RT-qPCR分析显示,TaSR 在抗性材料百农4299中受赤霉病诱导后上调表达,在感病材料百农607中受赤霉病诱导后下调表达,表明TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。综上,小麦TaSR与TaHis存在相互作用,且TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。

研究发现陆地棉ENODL6基因具有抗黄萎病功能。为进一步揭示其在棉花抗黄萎病过程中发挥的作用,通过Nimble Cloning技术将GhENODL6插入酵母表达载体pNC-GBKT7,构建了重组质粒pNC-GBKT7-ENODL6。重组质粒转入酵母菌Y2HGold后可在DDO培养基上正常生长,但不能生长于QDO/X/A培养基,表明GhENODL6蛋白对酵母宿主无毒害作用,没有自激活活性。将携带pNC-GBKT7-ENODL6诱饵载体的Y2HGold酵母菌与cDNA文库进行杂交筛选,结果获得一个能够显示蓝色的菌落。通过PCR扩增,在蓝色酵母菌中获得一段526 bp的非载体插入片段,与陆地棉基因组内基因WRKY47序列高度一致。通过同源扩增,从陆地棉中克隆到WRKY47开放读码框,全长1 587 bp,编码528个氨基酸残基。再次利用酵母双杂交技术确认了WRKY47与GhENODL6之间存在互作关系。综上,构建了重组载体pNC-GBKT7-ENODL6,并鉴定到与GhENODL6互作的蛋白WRKY47。

为了确定张家口及银川番茄产区是否发生番茄褐色皱纹果病毒病(ToBRFV),探究番茄ToBRFV的遗传信息和演化,为番茄褐色皱纹果病毒的诊断和防治及番茄抗病毒病基因工程提供重要的科学依据,采用张家口和银川两地区疑似病果进行分子检测,并利用相关分子生物学软件对该病毒基因进行序列分析及全基因组的系统进化分析。结果表明,张家口及银川果实病毒分离物与GenBank中大部分ToBRFV分离物的基因组结构相似性在99%以上,确定两地区番茄果实病毒为番茄褐色皱纹果病毒。ToBRFV分离物的地域性很强,中国不同地区的ToBRFV病毒,与来自欧洲和亚洲的多个国家地区都有关联,张家口分离物与中国分离物(MT018320.1)亲缘关系最近,银川分离物与秘鲁分离物聚类到一起,说明银川分离物可能来自南美洲。张家口分离物与中国分离物(MT018320.1)的4个ORF氨基酸相似性最高,而银川分离物与张家口分离物相似性较低。另外,研究结果首次发现,银川分离物CP蛋白的第444位碱基由A突变成G,从而导致CP蛋白的氨基酸第131位由V(缬氨酸)突变为A(丙氨酸),CP蛋白发生了有义突变。综上所述,张家口及银川番茄产区发生了番茄褐色皱纹果病毒病,且两地区的病毒来自不同的地方。

为了研究锌指蛋白C₂H₂在大豆胞囊线虫病(SCN)胁迫应答中起到的重要作用,为进一步研究抗大豆胞囊线虫奠定重要基础。利用东农L-10(抗SCN)、黑农37(感SCN)接种SCN3根系转录组数据,筛选出差异表达基因GmC₂H₂-2like。倒置荧光显微镜下观察该GmC₂H₂-2like定位情况,对该基因进行生物信息学分析,克隆并构建其超表达载体转化大豆毛状根,研究其对胞囊线虫病的抗性功能。结果表明,GmC₂H₂-2like编码410个氨基酸残基,分子质量为45.77 ku,等电点为8.73,含47个磷酸化位点,蛋白二级结构含α-螺旋(25.61%)、无规则卷曲(57.32%)、延伸链(13.66%)和β-转角(3.14%)4种结构;亚细胞定位结果发现,其编码蛋白位于细胞核;分析超表达转GmC₂H₂-2like大豆毛状根发现,其根部组织的单位面积胞囊线虫数量显著低于空载体对照,表明GmC₂H₂-2like具有抑制胞囊线虫的功能。

通过筛选甘蓝型油菜绿叶和紫叶突变体叶片中差异表达基因和差异代谢物,为解析花青素合成机理奠定理论基础。对苗期叶片呈紫色的甘蓝型油菜(PL)和叶片呈绿色的甘蓝型油菜ZS11(GL)幼苗表型观察发现,PL在长出2片真叶(3周)时紫色斑驳分布,随着发育紫色逐渐加深,抽薹期后紫色逐渐变浅最终消失(>16周),GL叶片则全时期呈绿色;转录组KEGG分析在第6,13,16周找到2 523个共差异表达基因,上述差异表达基因在花青素合成途径显著富集。与花青素合成相关的24个基因显著差异表达,包括3个MYBL2、1个C4H、1个F3H、2个F3'H、2个TT8、3个DFR、4个ANS、5个UGT、3个TT19,上述基因在第6,13周PL叶片中表达量均高于GL。选取8个差异表达基因进行qRT-PCR验证,结果与转录组分析数据趋势一致。花青素靶向代谢组共检测到50种花青素,其中29种积累差异显著;PL相对于GL有16种花青素积累上调,13种花青素积累下调。PL叶片中多种矢车菊素积累量显著增加,而矮牵牛素积累量显著下降,花青素合成途径中差异表达基因和差异代谢物的表达量均达到显著水平。TT8及其靶基因(DFR、ANS、UGT、TT19)在发育早期(6~13周)的上调促进了PL中以矢车菊素为主的花青素的积累以及矮牵牛素为主的花青素的减少,导致叶片叶色出现差异。而发育后期(13~16周),这些花青素合成基因的下调和花青素的降解可能导致花青素积累的减少,使PL由紫叶转变为绿叶。

为了探究海甘蓝控制超长链脂肪酸合成的关键基因FAE1的表达模式及其对发育种子中芥酸合成的影响,针对已克隆的5个FAE1同源基因(CaFAE1-1~CaFAE1-5),以苗期根、茎、叶及不同发育时期(花后5~25 d)的种子为材料,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析其表达模式;并采用气相质谱技术(GC-MS)检测不同发育时期种子中的脂肪酸相对含量,重点探讨不同CaFAE1基因表达量与种子芥酸含量的相关性。结果表明,相对种子而言,5个CaFAE1基因在根、茎、叶组织中的表达水平极低;而在花后5~25 d种子中,CaFAE1-3的表达量均为最高,且随种子发育进程呈逐渐升高趋势;其他4个CaFAE1基因的表达量均呈先升后降趋势,均于花后20 d达到最高值,随后CaFAE1-5和CaFAE1-4表达量迅速下降。GC-MS分析结果表明,花后5~15 d种子中,长链饱和脂肪酸C16∶0和C18∶0及单不饱和脂肪酸C18∶1相对含量均显著高于超长链脂肪酸含量,随后其含量快速下降,表明CaFAE1以C18∶0和C18∶1为底物的脂肪酸碳链延长主要发生在花后15 d及以后,且终产物主要为C22∶0和C22∶1。CaFAE1基因表达量与脂肪酸组分含量相关性分析结果表明,在花后5~25 d种子中,5个CaFAE1的表达量均与超长链脂肪酸含量呈正相关,且CaFAE1-1、CaFAE1-2和CaFAE1-3与芥酸相对含量呈显著或极显著正相关。由此推测,多拷贝、高活性FAE1的高水平表达可能是海甘蓝种子中芥酸含量高的主要成因。

为探究花青素糖基转移酶基因(UFGT)在甜荞花色苷生物合成中的作用,以甜荞贵红1号为材料,基于同源比对分析,筛选并克隆得到1条UFGT基因序列,命名为FeUFGT1。对FeUFGT1进行生物信息学分析,并构建过表达载体转入拟南芥花青素3-O-糖基转移酶突变体(atugt78d2)中分析其功能。结果表明,FeUFGT1开放阅读框为1 404 bp,编码467个氨基酸残基,推测其分子质量51.46 ku,理论等电点为4.97。FeUFGT1蛋白不存在信号肽和跨膜区,含有植物糖基转移酶家族典型结构域(GT-B型),并且在C末端具有植物UGT家族成员特有的PSPG-box。进化分析表明,FeUFGT1蛋白与罗汉果的3-O-葡萄糖基转移酶UGT74AC1亲缘关系最近。在白花品种丰甜1号和红花品种贵红1号2个品种盛花时期的花瓣中,红花中FeUFGT1的表达量约为白花中的3.7倍,差异显著。突变体恢复试验表明,FeUFGT1能够恢复拟南芥突变体atugt78d2缺乏花色苷积累的表型,具有催化花色苷生成的功能。

为揭示喷施外源硒对甜菜响应的分子机制,采用糖甜菜品系HD802种子作为供试材料进行水培试验,纳米硒浓度分别设置为0(喷施清水,对照),20,50,80,100,150,200 mg/L,待真叶长至8片叶时均匀地喷施纳米硒溶液,24 h后取样进行超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量测定。经数据分析,选取50,150 mg/L的纳米硒处理叶片送检,进行转录组测定,分析差异表达基因和显著富集通路。结果表明,纳米硒50 mg/L处理对甜菜叶片生长具有促进作用,而150 mg/L处理对甜菜叶片具有破坏效果。鉴定出9 161个DEGs,其中,上调表达3 717个、下调表达5 444个;GO功能富集主要富集在信号转导、细胞通讯、膜的组成部分、膜的固有成分、初级代谢过程、有机物代谢过程和生物过程等;KEGG代谢途径主要包括植物病原互作、植物激素信号转导等途径;转录因子分析共涉及AP2、zf-Dof、HLH、WRKY、HSF_DNA-bind、NAM、zf-BED、Homeobox等11个家族。研究找到了硒处理对甜菜幼苗生长发育有促进作用的适宜浓度,初步筛选出甜菜外源硒响应的相关基因。

WRKY转录因子家族在调控非生物胁迫中具有重要的作用。为系统地分析烟草NtWRKY11基因的序列特征、表达模式,探究该基因在低温和干旱等非生物胁迫下的反应机制,以普通烟草cDNA为模板进行 PCR 扩增,克隆NtWRKY11基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件分析NtWRKY11蛋白的基本性质,构建植物表达载体研究其亚细胞定位,利用qRT-PCR技术检测烟草盛花期不同组织以及不同胁迫下NtWRKY11基因的表达情况。结果表明,烟草NtWRKY11基因cDNA全长999 bp,编码332个氨基酸,与苎麻BnWRKY11的相似性达54.23%。其启动子含有1个MBS、1个MYB和3个ARBE顺式作用元件,这3种元件可能共同发挥作用,使植物的抗旱性增强;还含有3个水杨酸响应的顺式作用元件TCA-element,能够提高植物的耐低温性。亚细胞定位结果表明,NtWRKY11蛋白定位在细胞核上。盛花期不同组织的表达分析表明,NtWRKY11在老叶中高表达,极显著高于根中的表达量,而花中的表达量极显著低于根中,茎和新叶中的表达量均与根中差异不显著。非生物胁迫下的表达分析表明,该基因在低温、干旱胁迫下的相对表达量极显著高于正常(CK),在高盐胁迫处理下的相对表达量与CK无显著差异,而在高温胁迫下的相对表达量极显著低于CK。综上所述,NtWRKY11在老叶中高表达,在干旱胁迫、低温胁迫下表达量增加,表明该基因作为正向转录因子调控了干旱和低温胁迫。

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)基因是胁迫信号转导网络中重要的调节因子,克隆蓖麻NAC基因,研究其分子特征及表达特性,旨在为研究蓖麻NAC基因的潜在功能提供数据支持。采取RT-PCR技术克隆通篦5号的RcNAC100-like基因并分析其分子特征,包括生物信息学、亚细胞定位、表达模式和转录激活域分析。结果表明,RcNAC100-like基因的cDNA全长1 244 bp,包含1 086 bp的CDS,共推导361个氨基酸,该蛋白质的不规则卷曲和α-螺旋结构较多,是1个亲水的、非分泌性蛋白质;系统进化分析结果表明,RcNAC100-like蛋白质与木薯和橡胶树NAC蛋白质的亲缘关系最近,且motif组成及位置高度相似;RcNAC100-like蛋白的亚细胞定位结果与预测结果一致,定位在细胞核;RcNAC100-like启动子的顺式作用元件预测结果显示,该区域有多个环境响应类元件和生长发育类相关元件;基因表达模式分析结果表明,RcNAC100-like基因有组织表达特异性,在根中的相对表达量最高;另外,该基因能够对不利环境(干旱、盐、冷和ABA胁迫)迅速做出反应并积极地表达,说明RcNAC100-like基因可能是蓖麻对逆境响应的关键基因;转录激活试验结果表明,RcNAC100-like转录因子在酵母中具有转录激活活性。综上,RcNAC100-like基因可能在蓖麻的抗逆境过程中发挥重要作用。

为揭示蓖麻收获指数遗传规律及挖掘其候选基因,同时为蓖麻收获指数遗传改良提供参考,通过9048×16-201杂交组合构建了F₂和BC₁(F₁×P₂)群体,利用完备区间作图法(ICIM-ADD)对收获指数及相关性状进行了表型性状研究及QTL定位,并利用S₁群体对主效QTL簇进行验证。综合发现,收获指数与单株产量、单株蒴果数、单株粒数、主穗结实率、一级分枝穗结实率呈极显著正相关,与单株结实率、二级分枝穗结实率、单株百粒质量及单株有效穗数呈正相关,与生物量、根质量呈负相关;单株产量与其他性状间均呈正相关。在F₂/BC₁群体中共检测到收获指数及相关性状31/21个QTL,贡献率在1.64%~19.96%/0.90%~11.51%。共发现了4个增效等位基因来源于16-201的稳定QTL和5个主效QTL,其中的3个主效QTL(FqSRPS3-3、FqSRPBS3-3和BqSRSBS3-1)和2个稳定QTL(FqSRPS3-3/BqSRPS3-1、BqSRPBS3-1)聚拢在第3染色体的QTL-cluster1(RCM915~RCM950,997.10 kb)上,且在S₁群体上再次检测到8个QTL-cluster1的等位QTL。因此,进一步在QTL-cluster1里,甄选了3个候选基因(Rc-US03g04790、Rc-US03g05640和Rc-US03g05810),它们在双亲多个组织中差异表达,每个候选基因在高表达亲本的相对表达量是低表达亲本的2.34~880.06倍,1.85~51.56倍和2.01~236.03倍。

为了进一步挖掘小麦籽粒相关性状的主效QTL位点,探索籽粒性状之间的遗传关系,利用籽粒性状差异较大的小麦品种安农859和武农988构建的124份DH群体为研究材料,分别测定2 a 7个环境下的粒长、粒宽及千粒质量表型值,开展籽粒性状多元回归分析,并基于DH群体的55K芯片数据进行籽粒相关性状QTL检测。结果表明,多元回归分析中,粒宽对千粒质量的贡献最大。通过完备区间作图对籽粒性状进行QTL定位,除6D和7B染色体外,其他19条染色体上共检测到69个有关籽粒性状的QTL,包括24个千粒质量QTL、28个粒长QTL、17个粒宽QTL,单个QTL的表型解释率为6.87%~27.74%。其中,7A染色体上粒长相关的Qgl.ahau-7A.1在7个环境及BLUP下均被检测到,表型解释率为9.48%~22.26%,加性效应为0.11~0.21 mm,物理区间4.91 Mb(AX-110430243~AX-110442528),可能为新的主效QTL。因此,Qgl.ahau-7A.1位点可作为后续精细定位和分子标记辅助育种重点关注的区域。

二氢黄酮4-还原酶(DFR)是花青素合成通路中的关键酶,其表达与花青素积累紧密相关,影响花朵呈色。为了探究DFR基因与绿绒蒿花色形成的关系,以红色的红花绿绒蒿和黄色的全缘叶绿绒蒿为试验材料,使用RT-PCR技术成功从中克隆出DFR基因,并对其进行生物信息学及RT-qPCR分析。结果显示,2种绿绒蒿DFR基因的cDNA全长为1 131,1 125 bp,分别编码376,374个氨基酸,命名为MpDFR、 MiDFR。生物信息学分析发现,2种蛋白均属于亲水性蛋白,且具有DFR特有的NADPH结合结构域和底物特异性结合结构域。系统进化树表明,MpDFR、MiDFR蛋白与鸦片罂粟、沉水樟、三枝九叶草、澳洲坚果、蒂罗花的亲缘关系最近。Motif分析发现,DFR蛋白基序在不同植物中均较为保守。RT-qPCR结果显示,MpDFR、MiDFR在不同组织中均有表达,具有组织特异性。花蕾期中MpDFR、MiDFR基因表达量最高,且显著高于其他2个时期。另外,红花绿绒蒿中DFR表达量均高于全缘叶绿绒蒿。结合西南林业大学屈燕课题组研究发现,这2种绿绒蒿中花青素类化合物的积累模式与DFR基因的表达模式一致,所以,研究花青素生物合成途径中的关键结构基因DFR对于了解该途径以及通过基因工程手段改良植物花色均十分重要。

EβF合成酶基因在植物体内合成[反]-β-法尼烯,用于抵御蚜虫侵害。为探明薄荷中该基因的表达模式和功能,从薄荷叶片中克隆得到1个新的EβF合成酶基因McβFS1,并对其进行生物信息学分析和表达模式分析。构建过表达载体,利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,并进行蚜虫生物测定。结果表明,McβFS1基因CDS序列全长1 650 bp,编码549个氨基酸。编码蛋白分子质量为63.85 ku,等电点为5.23,无跨膜结构域。二级结构预测其α-螺旋、β-转角、延伸链结构和无规则卷曲所占比例分别为69.58%,3.10%,4.01%和23.32%。系统进化分析结果显示,该基因编码的氨基酸序列与胡椒薄荷的Q5W283.1序列相似度达91.47%,亲缘关系较近,但序列差异较大,是一个新的EβF合成酶基因。荧光定量PCR结果显示,McβFS1在根、茎、叶、花中均有表达,且在叶中的表达量显著高于根、茎中的表达。蚜虫的选择性分析表明,转基因拟南芥对蚜虫具有较强的趋避性。

生长素响应因子(ARF)是一类具有B3结构域的转录因子,是调节生长素应答反应、控制基因表达的直接分子。前期通过分析转录组数据,在玉米中筛选到1个编码ARF蛋白并积极参与干旱-复水胁迫响应的基因ZmARF10。为进一步研究该基因调控玉米抗旱性的分子机制及抗旱分子育种提供新的思路,首先通过系列生物信息学分析软件对该基因进行生物信息学分析,之后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ZmARF10在玉米不同组织中的表达模式,分析在高温、干旱、高盐、ABA胁迫和解除胁迫处理下的表达情况,以及在不同玉米自交系间的表达差异,最后利用CRISPR/Cas9技术分析ZmARF10的功能。结果表明,ZmARF10位于玉米的第3号染色体,编码区全长2 127 bp,编码708个氨基酸,具有典型的B3结构域;该基因ATG上游2 kb区域内含有茉莉酸甲酯、生长素、脱落酸、低温响应等应答元件;系统发育树显示,ZmARF10基因编码的蛋白质与高粱同源蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,ZmARF10是组成型表达基因,在玉米成熟根中的表达量最高;在高温、干旱、高盐以及ABA 等4种胁迫处理下,ZmARF10基因的表达量均显著上调,干旱胁迫后上调倍数最高达8.2倍;干旱胁迫后,ZmARF10基因在抗旱自交系郑36中的表达量上升幅度显著高于干旱敏感自交系B73。观察拟南芥野生型与ARF10缺失型突变体发现,与野生型相比,干旱条件下突变体植株出现叶片萎蔫甚至干死的现象,根系发生卷曲,根系分支数减少,侧根生长发育受阻;测定生理生化指标发现,干旱胁迫后缺失型突变体的相对含水量、叶绿素含量、净光合速率显著低于野生型植株,说明敲除ARF10基因后拟南芥抗旱能力下降。

光周期是影响植物抽薹开花最重要的环境因子之一,光周期信号通过植物的光敏色素蛋白调控植物的抽薹开花,其中PHYB介导的信号网络对植物抽薹开花有重要的抑制作用。前期研究发现,大白菜耐抽薹材料06-247与易抽薹材料He102的PHYB基因启动子存在大片段插入/缺失差异,为了进一步研究启动子突变对PHYB及其下游途径关键基因的影响,以耐抽臺材料06-247与极易抽臺材料He102为试验材料,采用生物信息法分析了大白菜基因组中光敏色素基因的冗余特点,发现大白菜基因组包含6个光敏色素基因,其中PHYA有2个拷贝,PHYB、PHYC、PHYD和PHYE都仅有1个拷贝。进一步通过氨基酸序列比对筛选出了PHYB的特异序列、设计了抗原决定簇并制备了抗大白菜PHYB的特异抗体,采用荧光定量RT-PCR技术和Western Blot技术研究了06-247与He102中PHYB的相对含量,同时比较了PHYB下游光周期通路关键调控基因CCA1、FLC、CO和FT的动态变化。结果表明:启动子突变造成PHYB在06-247中表达水平显著升高并进而造成PHYB蛋白水平显著升高,同时下游调控基因CCA1、FLC、CO和FT均在06-247中高水平表达,这对06-247的耐抽薹特性有重要影响。

为了研究谷子基因组中SSR的分布偏好,采用生物信息学方法搜索和分析了谷子基因组中SSR在基因座5'侧翼区、3'侧翼区、外显子区和内含子区的分布规律。结果发现,随着5'侧翼区与起始密码子间距离的增加,SSR在5'侧翼区的频率与其基因组频率的比值(相对频率)逐渐下降,在1~700 bp区域内相对频率远大于1.50,而在3'侧翼区、外显子区和内含子区中SSR的相对频率均接近1.00。进一步分析发现,随着5'侧翼区与起始密码子间距离的增加,不同单一SSR类型的相对频率的变化趋势各不相同,总体上,包括CCG、AG、AGG、AGGG、ACC和AGC在内的这6个SSR类型在5'侧翼区的频率和相对频率均较高,其中,AG在5'侧翼区相对频率大于1.5的区域最大(1~1 800 bp),而在CCG的区域最小(1~200 bp)。在外显子区,CCG、AGG、AGC、ACG和ACC这5个高C/G含量的三碱基SSR类型具有较高的频率和相对频率。综上,SSR在基因座5'侧翼区1~700 bp内特异性出现,其中,包括CCG、AG、AGG、AGGG、ACC和AGC在内的6个SSR类型为主要的特异性分布类型;而在基因座3'侧翼区、外显子区和内含子区中,SSR的分布与整个基因组无明显差别,但在外显子区,CCG、AGG、AGC、ACG和ACC这5个SSR类型具有明显的分布特异性。

叶色突变体是研究C4光合途径及叶绿素代谢机制的理想材料。为了研究谷子黄绿叶突变的分子机制,为黄绿叶基因的功能研究及叶绿素代谢的分子机制解析奠定基础,在长农35号甲基磺酸乙酯(EMS)突变体库中鉴定到1份可稳定遗传的谷子黄绿叶突变体ygl7,并对突变体及野生型进行农艺性状调查、光合色素含量及光合参数测定、叶绿体超微结构观察;同时对突变体叶色进行遗传分析,采用BSA法进行基因初定位,利用F₂群体进行精细定位,并根据功能注释结合RNA-Seq预测候选基因。采用qRT-PCR进行表达模式分析,采用酵母双杂交试验进行蛋白互作验证。结果表明,与野生型相比,ygl7苗期、拔节期叶片呈明显黄绿色,抽穗期逐步转为浅绿色,ygl7整个生育期叶绿素含量及光合速率都显著低于野生型,且叶绿体结构出现异常。遗传分析表明,ygl7黄绿叶表型由1对隐性单基因控制,基因精细定位将黄绿叶基因定位于第Ⅶ染色体434.9 kb区间内,候选基因分析预测编码原卟啉Ⅸ镁鳌合酶Ⅰ亚基的Seita.7G290300为调控黄绿叶的候选基因。qRT-PCR结果显示,Seita.7G290300在叶片中高表达,且在突变体中的表达量低于野生型;叶绿素合成途径(CHLD、CHLI)和光系统(LHCB1、LHCB6)相关基因在突变体中均下调表达。酵母双杂交试验表明,SiYGL7与MORF2存在互作。

为了改良桃农1B和桃农1A的苗瘟抗性,以携带广谱持久抗稻瘟病基因Pigm的中国地方水稻品种谷梅4号为供体亲本,先后以三系保持系桃农1B及其不育系桃农1A为受体亲本,利用与Pigm紧密连锁共显性DNA标记T9E3开展辅助选择育种。T9E3在桃农1B或桃农1A基因组中的PCR扩增条带约为2 000 bp,而对谷梅4号基因组的扩增产物大小为926 bp,多态性稳定;采用来自国内外不同稻区的32份稻瘟菌菌株室内接种苗瘟,桃农1B和桃农1A抗性频率均为9.38%,谷梅4号与改良系抗性频率均为90.63%;田间天然病圃鉴定桃农1B和桃农1A苗瘟8级,而改良系和供体亲本谷梅4号苗瘟均为0级。通过T9E3辅助选择、田间病圃筛选和室内接种鉴定,初步获得了3份高抗稻瘟病的改良不育系(桃农1A-Pigm-1─桃农1A-Pigm-3)及其保持系(桃农1B-Pigm-1─桃农1B-Pigm-3),进一步通过不育特性、农艺性状与产量结构调查分析,从中遴选出1个高抗稻瘟病、不育性稳定、包颈率低、农艺产量性状优良的优异不育系桃农1A-Pigm-2及其配套保持系桃农1B-Pigm-2。桃农1A-Pigm-2不育度和不育株率均为100%,典败花粉约占60%、圆败花粉约占40%,柱头外露率高达71.1%,包颈粒率仅为33.6%;桃农1B-Pigm-2播始历期为69 d,株高76.2 cm,主穗穗长28.1 cm,单株有效穗数15.8穗,单穗总颖花数115.3个,千粒质量27.7 g。实现了桃农1A和桃农1B苗瘟抗性及其他性状的综合改良,为三系杂交水稻育种应用创制了新的亲本材料。

为通过电子克隆得到灵芝LaeA基因序列,分析其基因序列信息,并初步探究其调控功能。采用电子克隆的方法,以已知桔青霉的LaeA蛋白序列为模板,在灵芝的EST数据库中进行序列相似性搜索比对(Blast),经序列拼接、序列验证和序列延伸等电子克隆方法获得灵芝LaeA基因的cDNA序列;采用生物信息学软件对LaeA基因编码蛋白质的基本理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构及进化关系等方面进行了预测和分析。结果表明,LaeA基因全长1 134 bp,编码378个氨基酸,蛋白分子质量为42.895 3 ku,存在于细胞质中,是亲水性蛋白;LaeA蛋白结构主要由47.88%无规则卷曲、33.33%α-螺旋和18.78%延伸链组成,有S-腺苷甲硫氨酸结合位点,属于AdoMet_MTases超家族蛋白;系统进化分析结果显示,LaeA蛋白与云芝、污叉丝孔菌等白腐担子菌类的亲缘关系较为亲近;qRT-PCR结果表明,LaeA基因在灵芝细胞液体静置培养过程中的表达量显著高于振荡培养方式。推测LaeA蛋白作为1种甲基转移酶蛋白,通过参与组蛋白的甲基化修饰,进而影响基因簇的表达水平。

为研究芍药PlSPL1(SPL)基因的性质和功能,进一步阐明PlSPL1基因在不同物种中的共性与特征差异,探明PlSPL1在芍药茎秆挺直程度中的作用。以芍药红峰茎秆为材料,采用RACE技术获得了芍药PlSPL1基因全长序列,利用生物信息学软件分析预测PlSPL1的结构、理化性质和亲缘关系,随后利用qRT-PCR技术分析PlSPL1在芍药茎秆不同发育时期的表达量,并通过激光共聚焦扫描显微技术进行了蛋白质亚细胞定位分析。结果表明:PlSPL1基因开放阅读框为3 000 bp,编码999个氨基酸。蛋白分子式为C₄₈₆₉H₇₆₈₂N₁₄₀₆O₁₄₉₇S₄₃,分子量为111.25 ku,理论等电点为6.26,编码亲水性不稳定酸性蛋白,磷酸化修饰以丝氨酸为主,无信号肽,有跨膜结构,二级结构主要由无规则卷曲组成。系统进化树分析发现,PlSPL1蛋白与牡丹的亲缘关系最近,其次和葡萄有较近的亲缘关系;蛋白序列比对分析发现,PlSPL1蛋白具有SPL转录因子家族特有的SBP保守结构域。相对表达量分析发现,PlSPL1随着茎秆发育逐渐呈现下降趋势,表明PlSPL1负向调控芍药茎秆发育,推测其可能在茎秆挺直程度方面起重要作用;亚细胞定位显示,PlSPL1蛋白定位在细胞核中。上述结果表明,PlSPL1参与芍药茎秆发育过程。

为了明晰球茎甘蓝MYB62转录因子的序列特征及其在逆境胁迫后的表达特征,进一步探索球茎甘蓝MYB62转录因子的生物学功能,为后续MYB62转录因子功能鉴定提供理论依据,以球茎甘蓝为研究对象,采用同源克隆的方法获得球茎甘蓝MYB62转录因子基因,并对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR的方法分析MYB62在球茎甘蓝不同组织间以及逆境胁迫后的表达特征。基因克隆结果表明,BocMYB62基因gDNA全长1 353 bp,CDS为837 bp,包括4个外显子和3个内含子,编码278个氨基酸。序列结构分析结果显示,BocMYB62为亲水性蛋白,具有2个SANT-MYB结构域,属于R2R3-MYB型MYB转录因子;空间结构预测显示其具有典型的α-螺旋结构;系统发育分析表明,BocMYB62与甘蓝型油菜MYB62亲缘关系最近。时空表达结果显示,BocMYB62在绿色球茎甘蓝中的表达量始终高于在紫色球茎甘蓝中,且存在明显的组织特异性,在干旱胁迫后BocMYB62表达量显著升高,胁迫12 h表达量最高,低温胁迫后BocMYB62表达量显著低于对照,在4 ℃低温胁迫时表达量最低,推断BocMYB62可能参与花青素生物合成调控,并可能参与逆境胁迫的调控作用。

SAUR基因的生物信息学分析旨在揭示其结构、功能和进化关系,同时通过亚细胞定位,了解其在细胞中的位置,从而推断其生物学功能。这样分析有助于深入理解该基因在生物体内的作用机制和潜在应用,为调控防风种子萌发,缩短种子休眠时间和防风绿色栽培种植及育种提供重要理论和实践意义。研究进行了生物信息学分析,从防风克隆到2个基因SdSAUR32和SdSAUR23,分析这2个基因在防风种子不同休眠阶段的表现和亚细胞定位,以探究其生物学特征和功能。结果表明,SdSAUR32蛋白分子质量约为14.48 ku(pI为6.45),SdSAUR23蛋白分子质量约为10.29 ku(pI为8.00),均为亲水性蛋白;分析保守结构域的SdSAURs基因编码蛋白发现,SdSAUR32 和 SdSAUR23 的保守结构域相同,都属于由生长素诱导的超家族成员;进化分析表明,SdSAUR32和SdSAUR23基因编码蛋白均与胡萝卜的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明,防风SdSAUR32和SdSAUR23均定位于细胞核;防风种子的不同时期都有SdSAUR32和SdSAUR23的表达,但芽期的表达量显著高于休眠期和解除眠期,因此,推测SdSAUR32和SdSAUR23 可能在萌发和生长过程中起着重要作用。

为探究RPM1在高粱抗病过程中的作用,以高粱抗黑穗病品种SX44B为材料,采用同源克隆法获得一个高粱SbRPM1基因。生物信息学分析结果显示:该基因的cDNA全长2 802 bp,预测共编码933个氨基酸。该基因编码蛋白的理论分子质量为106.1 ku,等电点为7.11,为亲水性蛋白质;该蛋白无跨膜结构,亚细胞定位在细胞质中。保守结构域分析显示,SbRPM1蛋白含有RX-CC-like、NB-ARC和LRR结构域,属于NLRs受体蛋白家族中的CNL类蛋白。系统发育关系分析表明,SbRPM1蛋白与南荻RPM1蛋白亲缘关系最近。通过实时荧光定量PCR技术检测SbRPM1基因的表达模式,结果表明,该基因在叶和花序中表达量较高,其次是根,在茎中表达量最低。在接种丝黑穗病原菌后24~72 h抗病品种中SbRPM1基因的表达显著上调,表明该基因受病原菌诱导表达,在高粱抗病反应中扮演着重要角色。首次在高粱中克隆得到SbRPM1基因CDS序列,解析了该基因的结构、性质与表达的特征。

绿豆叶形突变体和叶形调控基因的鉴定,可为品种叶形的遗传改良提供种质资源,也有利于解析叶片发育的遗传调控机理。从皖科绿3号EMS诱变突变体库中筛选到窄叶突变体vrnl11,利用vrnl11/皖科绿3号和vrnl11/中绿1号的杂交后代进行遗传分析,用χ²检验确定F₂群体中不同表型植株的分离模式。以vrnl11和中绿1号及中绿5号构建的2个F₂群体为定位群体,利用BSA测序技术和图位克隆的方法完成vrnl11的精细定位。表型鉴定结果表明,vrnl11叶片宽和叶面积较野生型皖科绿3号分别减少25.7%和21.7%。遗传分析表明,vrnl11的窄叶表型受单隐性核基因调控。BSA测序分析将突变位点定位在第11染色体上15.0 Mb至末端4.7 Mb的区间内。利用新开发的多态性分子标记将vrnl11定位在标记nl-61和nl-46之间186.5 kb的区间内,包含9个预测基因。这些研究结果为克隆vrnl11和解析绿豆叶片生长发育的分子调控机理提供理论依据。

为了探索安农1687对于条锈病抗性的遗传机理,加快安农1687小麦品种的推广,为小麦新品种的遗传改良提供参考,减少小麦条锈病对于我国小麦生产安全的危害。以安农1687(安农1687是由安农1106和西农822杂交选育的,对生理小种CYR32具有抗性的半冬性小麦品种)及其姊妹系和亲本为材料,利用小麦55K SNP芯片对安农1687及其双亲和姊妹系进行全基因组扫描,同时利用生理小种CYR32对安农1687及其姊妹系进行接种和鉴定,并在成株期统计其抗条锈病等级,综合接种及田间表型对小麦品系抗条锈病进行评价。鉴定结果显示,安农1687和5个姊妹系(系24、系26、系28、系30、系140)为中抗条锈病,2个姊妹系(系89和系105)为中感条锈病。利用安农1687及其姊妹系间的基因组差异信息,发现差异SNP位点富集在2A染色体短臂的31~37 Mb区间上,说明2A染色体可能存在某个或某些基因导致了这样的结果。为了排除其他抗条锈病基因的干扰,对亲本及2A染色体上携带的已知抗条锈病基因进行验证,结果表明,安农1687的2A染色体短臂的31~37 Mb区间可能存在一个新抗条锈病基因。通过试验和生物信息学分析发现,该区段内的TraesCS2A01G070700基因在抗感品系的NBS结构域上存在差异,感病品系中NBS结构域有3个错义突变,推测TraesCS2A01G070700为安农1687抗条锈病候选基因。

选育抗性品种是小麦叶锈病防治举措中最经济、可行的方法。为进一步挖掘抗病基因,选取河南、河北、山东等8个省小麦产区50个小麦品种。首先在苗期将16个叶锈菌生理小种(THFS、TGTS、THJS、FHKT、FGJN、KHKS、FCJQ、RFKS、THFM、MHGT、KHGS、KBGT、FHGT、PHHT、FHJT、FCJT)接种在36份小麦抗叶锈病近等基因系材料以及50个供试小麦品种上。因各菌种带有不同毒力,可根据表现型的差异,再将已知抗病基因紧密连锁的特异性分子标记与之结合分析,进而推测50份小麦材料中可能含有的抗叶锈病基因。通过基因推导、分子标记以及系谱分析综合鉴定抗锈性基因,结果表明,在50个品种中共检测出9个(Lr1、Lr2c、Lr10、Lr16、Lr26、Lr34、Lr37、Lr45和Lr46)已知抗叶锈性基因和少量未知基因。含有Lr1基因的有淄麦12等22个品种;含有Lr2c基因的有鲁麦14等10个品种;含有Lr10基因的只有莱州9361一个品种;含有Lr16基因的有科农199等25个品种;含有Lr26基因的有徐州24等15个品种;含有Lr34基因的有宝麦3号和京冬8号;含有Lr37基因的有淄麦12、鹤0927和荷9946;含有Lr45基因的有连麦2号等11个品种;含有Lr46基因的有山农19等38个品种。

为了探究SSSL-B50和华粳籼74(HJX74)株高差异的原因,利用SSSL-B50与HJX74回交构建F₂群体进行株高性状遗传分析与基因定位。结果显示,F₁植株表现为高秆;260个单株组成的F₂群体株高出现分离,高秆植株与半矮秆植株分离比例符合3:1(χ²=0.18<3.84),说明SSSL-B50高秆性状为显性性状,受1对显性等位基因控制。利用IciMapping软件对F₂进行连锁分析,将SSSL-B50携带的高秆基因定位在1号染色体代换片段上的标记S18和X161之间38.38~39.07 Mb。候选基因筛选分析发现,定位区间内存在着“绿色革命”基因座位SD1。对展颖野生稻、SSSL-B50及HJX74进行SD1基因测序及序列比对,发现HJX74的CDS序列与展颖野生稻、SSSL-B50相比有280 bp的缺失,导致氨基酸编码提前终止。qRT-PCR结果表明,SD1表达量在SSSL-B50茎秆的第2,3,4节均显著高于HJX74。此外,与前人报道结果相比,展颖野生稻SD1基因编码的氨基酸序列发生了2处改变(E100G、Q339R)。研究结果弄清楚了展颖野生稻单片段代换系SSSL-B50高秆性状受SD1调控,同时从展颖野生稻鉴定到了SD1的新等位型SD1^Glu。

JAZ蛋白在植物生长发育和胁迫信号通路中具有关键作用。为探究JAZ蛋白在小麦倒春寒中的调控机制,从小麦幼穗中克隆了 TaJAZ6基因,并对其分子特征、表达特性与亚细胞定位进行分析。结果表明,该基因CDS 序列全长为549 bp,编码178个氨基酸,预测编码蛋白质的分子质量为 18.376 ku,理论等电点为 9.37,不稳定系数为62.44,属于不稳定蛋白。该基因编码蛋白质具有1个 TIFY 结构域和1个CCT_2结构域。系统进化树分析发现,该蛋白质与野生二粒小麦和乌拉尔图小麦TIFY 11b蛋白亲缘关系最近。TaJAZ6基因启动子区除含有CAAT-box、TATA-box等基础作用元件外,还含有激素类响应元件、光响应元件、低温响应元件、防御和应激反应元件等。实时荧光定量PCR分析发现,TaJAZ6 基因在根、茎、叶和幼穗中均有表达,根系中表达量最高。TaJAZ6 基因还受低温和茉莉酸甲酯( MeJA) 的诱导表达,低温胁迫下,TaJAZ6在矮抗58(耐倒春寒)和郑麦366(倒春寒敏感)根、茎和叶中表达趋势相同,均显著升高;喷施300,350 μmol/L的MeJA之后再低温处理TaJAZ6在2个小麦品种中表达量均显著下降。TaJAZ6在低温胁迫后的幼穗中表达量出现相反的趋势,在矮抗58幼穗中表达量显著下降,在郑麦366幼穗中则显著上升,推测该基因可能负调控了小麦倒春寒胁迫防御反应。通过喷施MeJA显著降低了低温胁迫下2个小麦品种幼穗中TaJAZ6基因的相对表达量,同时提高了小麦的结实粒数。亚细胞定位试验显示,TaJAZ6 蛋白定位于细胞核中。以上研究结果表明,TaJAZ6 可能在小麦响应倒春寒胁迫过程中发挥重要作用。

为探究花丝对干旱胁迫的分子响应,以安农591和先玉335为材料,设置土壤含水量为80%田间持水量(CK)和60%田间持水量(DS)的2个处理,在玉米花丝伸长速增期取样,进行转录组测序。通过对比2个品种干旱组和对照组的基因表达差异,明确玉米花丝响应干旱的关键通路和相关候选基因。结果表明:苯丙烷类生物合成途径(ko00940)和淀粉和蔗糖代谢途径(ko00500)为玉米花丝响应干旱的关键通路。在苯丙烷类生物合成途径通路中编码4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、肉桂醇脱氢酶(CAD)和过氧化物酶(POD)的基因在干旱的玉米花丝中低表达。相关分析表明,编码4CL、CCR、CAD和POD的基因下调与木质素含量降低有关。在淀粉和蔗糖代谢途径中转化酶和蔗糖合酶基因在干旱的玉米花丝中低表达;相关分析表明,转化酶和蔗糖合酶基因下调与蔗糖代谢有关。综上所述,本研究确定了参与蔗糖和木质素代谢的关键基因和代谢物,木质素合成可能与玉米花丝耐旱相关,4CL、CCR、CAD和POD是木质素合成通路中玉米花丝耐旱的候选基因;此外,淀粉和蔗糖代谢途径可能与花丝伸长和花丝耐旱有关,转化酶和蔗糖合酶可能是调控花丝耐旱的关键酶。

MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用,而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值,因此,从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列,并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析,通过Gataway BP和LR反应,将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件,最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示,GhMYB42(XP_016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸,预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现,MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域,是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示,陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP_012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显,因此,选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37 ℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37 ℃诱导3 h。Western Blot结果表明,重组蛋白的大小正确,最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白,后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。

HD-Zip在植物抗逆过程中起着重要的调节作用,为了解大麻基因组中HD-Zip基因家族的特征和潜在功能,并为进一步研究CsHDZ基因对干旱胁迫下的调控提供重要线索,根据大麻全基因组数据库中的参考序列,利用生物信息学的方法对大麻HD-Zip基因家族进行全基因组鉴定,并系统分析其理化特性、进化发育、基因结构、启动子顺式结合元件并测定干旱胁迫下的表达模式。结果表明,大麻HD-Zip基因家族共筛选出20个CsHDZs基因,分别定位在7条染色体上,属于4个亚家族,编码氨基酸204 ~ 837 个,理论等电点4.54~9.04,属不稳定蛋白,亚细胞定位预测全部定位于细胞核;蛋白保守基序分析显示,CsHDZs共有10个保守基序,其中motif 1和motif 9为各成员共有;启动子调控元件分析发现,CsHDZs富含多种逆境胁迫应答相关元件。实时荧光定量分析结果显示,CsHDZ1/8/10基因转录水平在干旱前期无显著差异,而后期显著上调。研究表明CsHDZs基因参与了胁迫应答过程并能够积极响应干旱。