OFP是一类植物特有的转录因子,在调控植物器官形态建成和响应非生物胁迫等过程发挥重要作用。为了研究大豆OFP转录因子家族成员特征及其在干旱胁迫和盐胁迫中的作用,运用生物信息学方法对大豆OFP家族成员进行鉴定和分析。结果表明:在大豆中共鉴定到41个GmOFP基因,命名为GmOFP-1~GmOFP-41;这些基因不均匀地分布在大豆19条染色体上,编码152~414个氨基酸;亚细胞定位预测大豆OFP蛋白主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体中;在大豆OFP蛋白中共鉴定到10个保守基序,其中保守基序1和2存在于所有OFP成员中;系统发育分析将大豆和拟南芥OFP蛋白分为5个亚家族Class Ⅰ~Class Ⅴ,其中大豆OFP家族基因主要分布在Class Ⅰ和Class Ⅲ中;共线性分析发现,大豆基因组OFP成员中有75对基因存在共线性关系,4对基因存在串联重复,仅有2个基因GmOFP-2和GmOFP-39没有共线性关系,表明基因片段复制是导致大豆OFP家族成员增多的主要原因。通过qRT-PCR方法分析了GmOFP基因家族成员在干旱胁迫和盐胁迫处理下的表达模式,结果表明:与对照相比,41个GmOFP基因中有16个GmOFP成员在干旱处理后基因表达水平表现出显著差异,其中GmOFP-15、GmOFP-17、GmOFP-32显著上调表达,GmOFP-4、GmOFP-5、GmOFP-6、GmOFP-9、GmOFP-12、GmOFP-21、GmOFP-23、GmOFP-25、GmOFP-26、GmOFP-27、GmOFP-38、GmOFP-39、GmOFP-40显著下调表达;有8个GmOFP成员在盐处理后基因表达水平表现出显著差异,其中GmOFP-7、GmOFP-14、GmOFP-31、GmOFP-32、GmOFP-36、GmOFP-40显著上调表达,GmOFP-1、GmOFP-15显著下调表达。综上所述,大豆OFP基因家族在应对干旱胁迫和盐胁迫中可能具有重要功能。

草甘膦是目前使用最广泛的广谱灭生性除草剂,培育耐草甘膦作物将有助于改善农田杂草化学防控效果、减少用药量和简化防控措施。为充分挖掘小麦耐草甘膦基因位点,利用来自黄淮麦区的484份种质资源进行草甘膦耐药性鉴定,根据小麦15K SNP芯片数据,采用全基因组关联分析的方法,挖掘与小麦草甘膦耐药性相关QTL。结果显示,不同年代培育的小麦品种草甘膦耐药性的变化趋势缓慢,草甘膦耐受性未显著提升;根据表型鉴定结果,筛选出黄淮麦区耐草甘膦小麦种质材料3份,即河农130、冀麦782和泰山23号;利用全基因组关联分析方法,检测到与小麦草甘膦耐药等级显著相关的QTL 7个,包含19个显著性SNPs,分布于小麦1A(0.00~30.48 Mb)、1B(6.57~30.57 Mb)、1D(0.00~22.98 Mb)、4A(656.09~680.09 Mb)、5A(508.19~532.19 Mb)、6A(54.56~85.09 Mb)和6D(12.02~36.02 Mb)染色体上;位于小麦1A和6A染色体上的2个QTL qGlyT-1A和qGlyT-6A是小麦耐草甘膦的主效位点,共包含16个可能与小麦耐草甘膦相关的基因。

为了解谷子中SibHLH19的功能,以抗病谷子材料十里香叶片cDNA和基因组DNA为模板,分别克隆到SibHLH19基因的CDS序列和启动子序列,并利用生物信息学在线工具分析了启动子顺式作用元件及生物学特征;采用Real-time PCR技术检测了SibHLH19转录因子在谷子不同组织部位和抗谷锈病过程中的表达丰度变化;利用SDS-PAGE技术分析了该基因原核表达特征。结果表明,SibHLH19转录因子CDS序列全长843 bp,编码280个氨基酸,预测蛋白质分子质量为29.97 ku,理论等电点pI为5.85,编码蛋白质化学式为C₁₂₉₆H₂₀₇₁N₃₉₇O₄₀₀S₁₁,含有一个bHLH保守结构域,属于不稳定亲水性蛋白质。该蛋白质二级结构的最大元件是无规则卷曲,最小元件为β-转角。进化分析表明,SibHLH19与禾本科植物糜子(RLM85279.1)、哈氏黍(PUZ71581.1)和柳枝稷(XP_039835205.1)氨基酸序列的同源性较高,与小麦(KAF7059972.1)、节节麦(XP_040244423.1)同源性最低。启动子顺式作用元件分析表明,该基因启动子区存在多个激素、胁迫等应答元件。组织表达分析表明,该基因主要在谷子苗期表达,并以苗期地上部分表达量最高,孕穗期几乎无表达。在谷子响应谷锈菌生物胁迫反应的24 h内,SibHLH19基因在抗病反应8,16 h上调表达,而感病反应中仅在16 h略微上调表达,其余时间均下调表达,推测SibHLH19在谷子抗锈病反应中起正调控作用。构建的原核表达载体pET30a-SibHLH19经0.1 mmol/L IPTG诱导能表达出表观分子质量约44 ku的SibHLH19融合蛋白。

利用RT-PCR技术从延谷11号谷子中克隆SiPRR73基因,通过系统分析SiPRR73组织表达特异性,对不同光周期处理、不同光温组合处理以及5种非生物胁迫处理的响应特点,揭示光周期、温度对SiPRR73的调控模式及SiPRR73对非生物胁迫的应答模式。结果表明,从延谷11号克隆得到SiPRR73基因2 928 bp的cDNA序列,包含2 283 bp的CDS区,编码760个氨基酸;SiPRR73蛋白与C4家族作物糜子、哈氏黍、高粱、玉米PRR73蛋白具有较近的进化关系。 SiPRR73在顶端第2片叶中表达水平最高,在根、茎、穗部表达水平较低。短日照、长日照条件下该基因均表现光照期表达水平高于黑暗期的特点,且整个营养生长期短日照条件下表达水平明显低于长日照,SiPRR73受光诱导表达和光周期调控。温度决定SiPRR73表达峰的数目,光周期决定SiPRR73表达峰出现的时间,光周期和温度共同参与了SiPRR73的表达调控。PEG和低温胁迫总体上诱导SiPRR73表达,NaCl在胁迫早期诱导该基因表达,后期总体表现为抑制状态,Fe胁迫则早期抑制该基因表达,后期总体诱导其表达,SiPRR73对ABA胁迫的响应特点接近NaCl。以上研究表明,谷子SiPRR73表达具有光依赖性,光周期和温度以互作模式调控SiPRR73表达,推测SiPRR73参与了谷子对不同光温环境的适应性调节过程,并且在应对干旱、低温、ABA、NaCl、Fe胁迫过程中发挥了一定作用。

泛素化途径是植物响应干旱胁迫的关键信号途径之一。为明确E3泛素连接酶TaSINA101基因响应干旱胁迫的生物学功能,以小麦抗旱优异品种晋麦47为材料,克隆TaSINA61、TaSINA101和TaSINA105基因,利用生物信息学手段分析其序列特征,通过qRT-PCR检测3个基因在PEG-6000、NaCl、低温和ABA处理下小麦根和叶中表达量的变化。通过转基因水稻异源表达TaSINA101,分析TaSINA101响应干旱胁迫过程中的生物学功能。结果表明,TaSINA61、TaSINA101、TaSINA105基因均包含1个内含子和2个外显子,编码的蛋白质均由282个氨基酸组成,启动子区主要包含生长发育调控元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。qRT-PCR表达分析显示,这3个基因在根和叶中均受干旱胁迫等各种非生物胁迫诱导表达。干旱胁迫处理TaSINA101转基因水稻的表型分析发现,转基因水稻株系OE-1、OE-2和OE-3叶片的鲜质量及干质量、最大根长、根系平均直径和叶片相对含水量各项指标均显著低于野生型,而转基因水稻株系OE-1、OE-2叶片相对电导率则显著高于野生型。因此,TaSINA101负调控水稻的干旱胁迫耐受性,为深入解析小麦TaSINA101基因的生物学功能提供了依据。

Metacaspase(MC)是一种精氨酸/苏氨酸特异性蛋白酶,研究表明其在细胞程序性死亡中发挥作用。为探究 MC家族基因在甘蓝型油菜基因组中的分布及其是否响应干旱胁迫,对甘蓝型油菜MC家族基因成员的理化性质、系统发育、基因结构、保守结构域、顺式作用元件及干旱(PEG6000)和脱落酸(ABA)胁迫下的表达模式进行系统分析。共鉴定到25个BnMC基因,染色体定位显示,25个BnMC分布于13条染色体上,17个成员定位于细胞核,7个成员定位在细胞质;系统进化树将BnMC分为2个大类(Ⅰ型和Ⅱ型),4个分支(Group A、Group B、Group C和Group D),同一分支的BnMC具有相似的基因结构和保守基序分布。MC家族基因的核心启动子区包含的顺式作用元件有光响应元件、植物激素响应元件、植物生长发育响应元件和胁迫响应元件,非生物胁迫响应相关的所有顺式作用元件中,脱落酸响应元件(ABRE)数目最多,为79个,所有成员都含有该元件。转录组学结果分析发现,干旱胁迫后BnMC10、BnMC22、BnMC1、BnMC12、BnMC8的表达量上调,BnMC4和BnMC5表达下调。qRT-PCR检测显示,BnMC10、BnMC8、BnMC1、BnMC12在根和叶中均有表达,且受PEG6000和ABA诱导上调,其中BnMC1受诱导上调最为显著。综上所述,甘蓝型油菜响应干旱胁迫涉及对MC家族基因的表达水平调控。

IQM基因家族是Ca²⁺不依赖型钙调素结合蛋白中的重要成员,在植物生长发育以及多种胁迫反应中发挥着重要作用。为了研究玉米IQM基因家族的特征及潜在功能,采用生物信息学的方法在玉米全基因组中鉴定IQM基因,并对其蛋白性质、系统进化关系、基因结构、染色体位置、基因复制、顺式作用元件、组织特异性表达和多种胁迫下表达模式进行研究。结果表明,在玉米全基因组中共鉴定出11个ZmIQMs基因,根据其在染色体上的位置,将其命名为ZmIQM1~ZmIQM11。ZmIQMs基因分为3个亚家族,亚家族内部基因结构具有相似性,片段复制在玉米IQM基因家族扩增和进化中发挥主要作用。顺式作用元件分析发现,ZmIQMs基因启动子区含有多个与激素和胁迫响应相关的元件。对ZmIQMs基因的表达模式进行研究,发现ZmIQMs基因在不同组织中的表达模式不同,在不同非生物和生物胁迫下,多个ZmIQMs基因表达量发生变化。qRT-PCR结果显示,在干旱胁迫下,ZmIQM3、ZmIQM4和ZmIQM10上调表达;ZmIQM3、ZmIQM4、ZmIQM5、ZmIQM10和ZmIQM11响应小斑病病原菌的侵染。以上结果表明,ZmIQMs基因在胁迫响应中发挥着重要作用。

干旱胁迫对玉米生长发育造成严重影响,从而导致玉米产量降低。紫色酸性磷酸酶是一种参与植物多种生理生化功能的磷脂酶蛋白,为进一步深入研究紫色酸性磷酸酶家族基因在玉米抗逆过程中的作用,探究了ZmPAP26b基因在干旱胁迫下响应模式,利用实时荧光定量分析模拟干旱条件下不同玉米自交系中的基因相对表达量;从玉米中克隆ZmPAP26b(GenBank:NC_050104.1),并对玉米、拟南芥、水稻、小麦、高粱和二穗短柄草中的PAP基因进行鉴定和生物信息学分析;同时构建原核过表达菌株进行功能验证。结果表明,干旱胁迫下该基因在耐旱材料中表达量下降,干旱敏感材料中表达量上升。该基因CDS全长1 431 bp,编码476个氨基酸。在6个物种中共发现228个PAP基因,系统发育分析发现,共分成4个亚家族。玉米中的19个PAP基因分布在9条染色体上并且具有相似的保守结构域,启动子顺式作用元件分析显示含有响应干旱和激素等元件。原核表达试验发现,含有重组质粒pET28a-ZmPAP26b的菌株在10%PEG-6000和15%PEG-6000模拟干旱胁迫下的生长与空载菌株都受到了抑制。综上所述,推测ZmPAP26b在干旱胁迫下呈负调控模式。

为解析小麦低温胁迫应答机制并挖掘优异抗寒基因资源,通过转录组测序揭示小麦低温响应的关键调控网络,并对候选基因TaGGCT18-6A进行功能验证。结果表明,4 ℃冷处理诱导小麦幼苗分别产生10 893个(6 h处理)和18 784个(24 h处理)差异表达基因,KEGG富集分析显示,差异基因显著富集于MAPK信号转导及谷胱甘肽代谢等通路。基于谷胱甘肽代谢途径关键基因筛选,克隆获得γ-谷氨酰环转移酶基因TaGGCT18-6A。该基因全长1 772 bp,编码218个氨基酸,其编码蛋白具有典型的GGCT-like超家族结构域及核心结构域ChaC。启动子顺式作用元件分析表明,该基因含低温响应元件(LTR)及脱水响应元件(DRE)等胁迫相关元件;表达模式分析发现,TaGGCT18-6A在4 ℃冷处理下呈持续上调趋势。转基因水稻功能验证表明,过表达株系在-4 ℃低温冻害胁迫下相较野生型对照,OE#1、OE#2和OE#3存活率与生物量显著提高,OE#1和OE#2的株高显著提高,OE#1、OE#2和OE#3相对电导率显著降低。经4 ℃冷处理后,过表达株系渗透调节物质(脯氨酸、可溶性糖)积累量较对照显著增加,丙二醛含量降低;SOD、POD和CAT活性显著上升。以上研究表明,TaGGCT18-6A通过调控谷胱甘肽代谢增强抗氧化能力,进而提高植物低温耐受性,为小麦抗寒分子育种提供理论依据和优异基因资源。

盐胁迫对作物的产量和品质造成巨大的威胁,而大麦作为耐盐研究的先锋作物之一,开展其耐盐机理的解析,可为作物耐盐育种提供理论依据。以前期获得的盐敏感裸大麦地方品种B87和耐盐裸大麦地方品种B94为供试材料,在三叶期使用200 mmol/L NaCl处理7 d后,对其地上部组织进行了转录组和代谢组测序,并通过联合分析揭示裸大麦的耐盐性分子机理。结果显示,转录组和代谢组分析中,B87鉴定到了2 240个差异表达基因(DEGs)和198个差异丰度代谢物(DAMs),而B94鉴定到了923个DEGs和232个DAMs。经韦恩分析,耐盐裸大麦品种B94中特异DEGs和特异DAMs分别为480,129个。进而,又对DEGs和DAMs分别进行了GO和KEGG分析,其中B94的DEGs特异显著富集到11个通路,而其DAMs则仅特异显著富集到1个通路。另外,还对转录组和代谢组进行了相关性分析,发现基因与代谢物的变化既存在一致性,也存在不一致性。这些工作不仅丰富了对裸大麦耐盐性分子机理的理解,也为未来裸大麦耐盐育种提供了有价值的线索。

大豆P34蛋白主要存在于种子中,其上游启动子很可能具有调控下游基因在种子中高表达的特性。为进一步研究大豆P34蛋白基因的组织表达模式及其启动子的调控活性,通过qRT-PCR方法检测大豆P34蛋白基因在大豆不同组织中的表达情况;克隆大豆P34蛋白基因5'端上游序列(GmP34P),生物信息学分析其转录起始位点和顺式元件;构建表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,检测转基因烟草中GUS的表达。结果表明,P34蛋白基因在大豆种子中的表达量极显著高于根、茎、叶和花的表达量;克隆获得GmP34P序列长度为1 380 bp,预测分析表明,该序列的转录起始位点为第1 342位上的碱基A,序列中含有多种与种子高表达相关的顺式作用元件,如RY element、Skn-1 motif、2S seed protbanapa等;获得含有GmP34P启动子驱动GUS基因的植物表达载体pCAM-GmP34P;通过潮霉素、PCR及RT-PCR筛选阳性转基因植株;对pCAM-GmP34P阳性转基因烟草植株,进行qRT-PCR检测,结果显示,相对于其他组织,GUS基因在转基因烟草种子中的表达量达到极显著差异;GUS组织化学染色结果显示,GmP34P启动子能够调控下游GUS基因在种子中高表达。

为了研究异源过表达Atvip1基因的高粱对盐碱胁迫的耐受性及相应生长情况，采用NaHCO₃∶Na₂CO₃为5∶1，75 mmol/L，pH值9.63的盐碱胁迫液在高粱三叶一心期处理，在胁迫0，4，12，24，72，120 h对根系的生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及MDA含量进行测定。结果表明：异源过表达Atvip1基因能缓解盐碱胁迫对高粱幼苗生长的伤害，可使幼苗根表面积和根体积增大，根尖数和分叉数增多，高粱主根褐化出现较晚且症状轻，侧根发生早且数量多，在72 h后仍能保证新叶正常伸展，对地上部生长影响较轻。过表达Atvip1基因可提高转基因高粱根系抗O₂^-·活力，降低MDA的含量，抗氧化酶活性增强；胁迫早期（4~12 h），SOD、CAT和GR作用明显；胁迫中期（24~72 h），所有酶均发挥作用；胁迫后期（120 h），CAT和GSH-PX起重要作用。盐碱胁迫差异转录组分析中，差异表达基因COG分析表明，防御机制在不同时间段中占比较大，获得抗氧化酶相关差异表达基因42个。异源过表达Atvip1基因可通过缓解盐碱胁迫对光合作用和生长发育的影响，降低活性氧破坏及膜损伤来提高转基因高粱对盐碱胁迫的抗性。

旨在基于代谢组与转录组联合分析,阐明不同颜色鲜食玉米籽粒花青素的组分差异及其分子调控机制,为彩色鲜食玉米分子育种提供候选基因与理论依据。以白色WN2000、黄色HN、彩色CN1和黑色HTN188为材料,综合采用代谢组学鉴定花青素相关代谢物并筛选差异代谢物,结合转录组测序获得差异表达基因(DEGs),通过GO注释与KEGG通路富集解析代谢—基因关联,并在花青素生物合成通路中挖掘关键结构基因与转录调控因子。结果表明,代谢组共鉴定49种花青素类代谢物,HTN188中矢车菊素、芍药素和天竺葵素等主要花青素显著积累,表现出更强的色素沉积特征。转录组共获得12 557个DEGs,其中F3H、DFR、UFGT等结构基因及MYB、bHLH等转录因子在高花青素品种中显著上调。相关性分析显示,基因Zm00001d011438的表达量与总花色素苷含量呈显著正相关,提示其可能在籽粒花青素积累中发挥关键作用。综上,基于代谢组与转录组联合分析,描述了不同颜色鲜食玉米籽粒花青素组成及相关基因表达差异,筛选出与花青素生物合成通路相关的结构基因、转录因子及候选基因Zm00001d011438,为后续功能验证与遗传改良研究提供参考。

转录因子BnHY5-2与植物抗逆性相关。为揭示甘蓝型油菜转录因子BnHY5-2对盐碱胁迫的响应,主要通过瞬时转化过表达、qRT-PCR分析、亚细胞定位等方法,分析甘蓝型油菜转录因子BnHY5-2对光和盐碱的响应。结果表明,光照处理油菜后,在叶与茎中BnHY5-2基因的表达量均显著高于黑暗条件下,分别为黑暗条件下的29.22,3.15倍,叶片对光的敏感性大于茎,说明叶片是响应光转录因子BnHY5-2的主要部位。在光照条件下应用大连滨海盐碱土种植油菜,处理后BnHY5-2的表达在叶和茎中均显著下调,分别下调53.1%,31.0%;在黑暗条件下应用盐碱处理后BnHY5-2的表达在茎中下调48.2%,而在叶中的表达差异则不显著,表现出器官的差异性,说明叶片对光照条件要求更加严格。在油菜叶片中瞬时过表达BnHY5-2基因时,6个与盐碱相关的候选基因的表达中,有2个(BnNAC32、BnGS)上调表达,分别为原来的1.25,3.28倍;而有4个(Bnamy、BnAsp、BnNHX7、BnTPS)下调表达,分别下降24.8%,25.4%,71.0%,82.0%,同时甜菜碱含量由0.256 mg/g提升至0.573 mg/g,提高了1.24倍,说明过表达BnHY5-2基因会提高油菜的盐碱抗性。亚细胞定位结果显示,转录因子BnHY5-2定位于细胞核中,调控功能基因的表达。因此,BnHY5-2不仅与光信号有关,还参与油菜盐碱抗性。

前期通过矮秆高粱和本地玉米远缘杂交成功选育出矮秆dwarf-12,经过前人研究该矮秆基因可能由br2控制,由于无不良性状,为了利用、发掘优良的矮秆自交系,又将dwarf-12和本地白玉米杂交,选育出优良矮秆自交系d8227,前人将得到的矮秆玉米材料d8227经过与不同高度的玉米组合,鉴定出具有较好的配合力,为增加矮秆玉米种质资源,提高玉米产量,对其进行深入的研究。以d8227和dwarf-12为研究材料,比较矮秆亲本和子代之间的主要农艺性状差异,观察茎秆细胞学差异;用d8227和4个不同背景自交系进行遗传交配设计,分析矮秆基因的遗传模式;构建定位群体,用BSA方法,进行高通量测序,对矮秆基因进行初步定位,并对定位区间已知的矮秆材料进行等位性鉴定,明确目标基因与已知基因的关系。结果表明,d8227株高比亲本株高增加9.35%,穗位增加31.50%,d8227叶片减少,茎节长度增加,d8227的穗质量、行粒数、百粒质量、穗长、粒深比dwarf-12增加52.21%,5.26%,23.76%,6.93%,12.02%;利用石蜡切片方法,用显微镜观察d8227和dwarf-12穗上、穗位、穗下的横切、纵切细胞特征,d8227纵切细胞排列松散,细胞明显伸长;dwarf-12细胞排列有规则、紧凑,经过测量细胞面积,d8227穗位、穗下细胞面积显著高于dwarf-12,这主要是由于d8227细胞伸长导致。通过遗传分析,矮秆基因为隐性单基因,基因初步定位,将矮秆基因定位于1号染色体190~215 Mb,选取区间已经定位的矮秆玉米进行等位性鉴定,2 a种植结果表明,d8227与123d、Na360不是等位基因,可能与125d、123d为等位基因,需要后续精细定位和深入研究。综合来看,d8227是一个性状优良的中等矮秆材料,具有育种潜力,但还需进行精细定位等深入研究来判断其利用价值。

为挖掘胡麻响应干旱胁迫的关键基因并解析其内在分子机理,以期为抗旱品种选育提供理论支持。以胡麻抗旱品种天亚13号根系为材料,采用不同浓度(5%,10%,20%,30%)的聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫。通过分析根长、根粗及干/鲜质量比等生理指标,确定20% PEG为最适胁迫浓度,该浓度处理下上述指标较对照分别显著降低31.63%,30.50%和13.39百分点。在此基础上,利用Illumina转录组测序技术对不同干旱胁迫时间点(8,16,24 h)的根系进行转录组分析,分别鉴定到5 428,5 304和3 603个差异表达基因(DEGs)。KEGG富集分析表明,这些差异表达基因显著富集于碳水化合物代谢途径(12个基因)、甜菜碱生物合成途径(4个基因)及抗氧化防御系统(36个基因)等关键过程。通过qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证,其表达趋势与RNA-seq结果一致,证实了数据的可靠性。系统揭示胡麻在干旱胁迫下通过协同调控渗透调节物质(如甜菜碱)合成、能量代谢重编程(碳水化合物代谢)以及活性氧清除机制以增强抗旱能力,为胡麻分子设计育种提供了重要的理论依据和候选基因资源。

为探究钙依赖蛋白激酶(CDPK)在小麦生长和逆境应答中的作用,从普通小麦中克隆了TaCDPK17基因,并对其进行了序列结构、表达模式和抗逆功能初步分析。结果表明,TaCDPK17基因编码区长1 701 bp,编码566个氨基酸,具有CDPK家族的典型结构特征,包括1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和4个EF手型结构域。对TaCDPK17与其他12种植物的CDPK17进行进化树分析表明,TaCDPK17与禾本科作物,特别是节节麦、大麦的CDPK17序列有较高同源性。TaCDPK17基因启动子区域富含与激素调控、光照响应,以及非生物应答胁迫相关的顺式调控元件,其中,脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)和茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA)数量较多。基于实时荧光定量PCR的表达分析结果显示,TaCDPK17受100 μmol/L ABA、100 μmol/L茉莉酸甲酯、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl诱导后,表达量有不同程度升高。在2 μmol/L ABA和100 mmol/L NaCl胁迫处理条件下,过表达TaCDPK17的拟南芥种子萌发率显著高于野生型对照。同时,过表达TaCDPK17缓解了ABA或渗透胁迫处理对幼苗根生长的抑制作用。在气孔关闭过程中,过表达TaCDPK17的转基因植物对ABA更敏感,与野生型植物相比,表现出更强的气孔关闭趋势。这些结果表明,TaCDPK17在小麦逆境胁迫和激素信号应答中发挥着重要作用。

为揭示萌发期不同水稻的抗旱性机理,以水稻旱敏感材料(Calrose、京宁10号、山形86)和抗旱性材料(Farry、松粳3号、宁粳36)为研究对象,开展了模拟干旱胁迫(15% PEG-6000)对不同水稻萌发种子生长指标、生理指标及相应基因表达量的影响研究。结果表明:正常条件下,旱敏感和抗旱性材料萌发种子各生长指标、抗逆相关基因表达量之间无显著差异;但生理指标有明显变化,表现为不同材料间超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性、可溶性糖(SS)和过氧化氢(H₂O₂)含量无显著差异,旱敏感性材料山形86的丙二醛(MDA)、超氧阴离子($\mathrm{O}_{2}^{\bar{.}}$)含量显著高于其他材料;抗旱性材料宁粳36的过氧化氢酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)含量显著高于其他材料。干旱胁迫下,相比于旱敏感性材料,抗旱性材料萌发种子的相对发芽势(RGP)、相对芽长(RSL)、萌发期抗旱指数(GDRI)和活力指数(VI)分别增加了0.03~0.07百分点,0.32~0.39百分点,0.12~0.18百分点和92.41%~108.39%;抗旱性材料萌发种子中MDA和活性氧($\mathrm{O}_{2}^{\bar{.}}$、H₂O₂)含量分别降低了2.54%~61.64%,19.60%~46.30%和35.61%~62.02%;渗透调节物质(Pro、SS、SP)含量分别增加了5.93%~18.29%,1.08%~7.97%和3.47%~6.03%;抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性分别提高17.29%~33.12%,15.24%~76.06%和14.68%~18.61%;脯氨酸合成关键基因OsP5CS、抗氧化酶合成基因(OsALM1、OsPOX1、OsCATC)的相对表达量分别上调了2.66%~182.31%,57.14%~513.27%,0.38%~109.06%和63.39%~184.25%。综合分析表明,干旱胁迫抑制了水稻种子的萌发,影响了萌发期种子中的生理特性及其相应基因的表达。干旱胁迫下,无论是抗旱性材料还是旱敏感性材料,活力指数(VI)、过氧化物酶(POD)以及过氧化物酶合成基因(OsPOX1)是影响水稻种子萌发的关键指标。除以上指标外,可溶性蛋白(SP)、脯氨酸合成基因(OsP5CS)、过氧化氢酶基因(OsCATC)是影响抗旱性材料的其他关键指标,相对芽长(RSL)、过氧化氢(H₂O₂)、超氧化物歧化酶基因(OsALM1)是影响旱敏感性材料的其他关键指标。

捕光叶绿素a/b结合蛋白在植物光合进程及非生物胁迫响应中发挥着重要的作用。为了研究陆地棉GhLhcb2A1基因特征、表达特性以及在低温和干旱响应中的功能,以冀棉262叶片cDNA为模板进行PCR扩增,获得了GhLhcb2A1基因的CDS全长,通过生物信息学分析了基因及其编码蛋白的基本特征,利用qRT-PCR技术检测了基因的组织表达特性以及低温和干旱响应表达模式,采用病毒诱导的基因沉默技术验证了GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中的功能。研究结果表明,GhLhcb2A1基因CDS全长为798 bp,编码265个氨基酸。GhLhcb2A1在叶片中高表达,在低温和干旱处理的叶片和根中显著上调表达,并在低温和干旱处理3 h的叶片中达到最大值,分别是对照叶片中的17.42,30.03倍,在低温处理6 h和干旱处理12 h的根中达到最大值,分别是对照根中的11.65,65.04倍。亚细胞定位结果表明,GhLhcb2A1蛋白在细胞叶绿体中表达。GhLhcb2A1基因沉默植株与对照植株相比,低温和干旱处理造成的植株失水干枯等表型更严重,叶片积累的丙二醛含量显著升高,脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性则显著降低,说明GhLhcb2A1基因沉默植株对低温和干旱胁迫的抵抗力降低。以上研究表明,GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中发挥正调控的作用。

为研究OsASL1.1基因的表达特性及在干旱胁迫响应中的作用,分析OsASL1.1蛋白的亚细胞定位和OsASL1.1基因启动子区顺式作用元件,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析OsASL1.1基因在脱落酸(ABA)、甘露醇、聚乙二醇6000(PEG6000)下的表达模式,同时以Kitaake为背景采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Cas9-OsASL1.1突变体,分析突变体的突变类型,并对突变体进行ABA敏感性和抗旱性分析。结果表明,OsASL1.1蛋白主要在质体中表达。OsASL1.1基因启动子区含有低温响应、植物激素(ABA、生长素)响应等顺式作用元件,其中,ABA响应顺式作用元件(ABRE)有5个。OsASL1.1基因受ABA、甘露醇、PEG6000诱导表达。获得了Cas9-6和Cas9-12两个纯合的突变类型,Cas9-6有17 bp的插入,导致翻译提前终止;Cas9-12有12 bp的缺失,导致缺失4个氨基酸。ABA处理下,Cas9-OsASL1.1突变体和野生型的主根伸长都受到了抑制,但Cas9-OsASL1.1突变体受到的抑制程度低于野生型。150 mmol/L甘露醇处理下,Cas9-6和Cas9-12突变体的存活率均显著低于野生型,以Cas9-6的存活率最低。综上,Cas9-OsASL1.1突变体对ABA的敏感性降低,对干旱的抗性降低,即OsASL1.1 基因功能丧失降低了水稻对ABA的敏感性和抗旱性。

为深入解析调控超甜玉米秸秆蛋白质含量的遗传基础,基于玉米56K基因芯片,采用BLINK模型定位控制超甜玉米秸秆蛋白质含量的主要SNP位点及预测候选基因。结果表明:在超甜玉米收获期,其秸秆蛋白质含量为12.63~30.29 g/kg,平均值为20.76 g/kg,呈正态分布;GWAS共关联定位到调控超甜玉米秸秆蛋白质含量6个显著SNP位点,这些位点分布于第1,4和6号染色体上,其贡献率为10.07%~18.17%,其中位于6号染色体的Affx-115330268的贡献率最高。在显著关联位点上下游200 kb的置信区间内,共检测到184个候选基因,其中已注释基因34个,占比为18.48%;通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,候选基因主要参与生物调节、细胞过程、催化活性等生物过程,并富集于类固醇生物合成、色氨酸代谢、光合作用-天线蛋白等通路。基于文献查找比对发现,6个(GRMZM2G141473、GRMZM2G007854、GRMZM2G111319、 GRMZM2G121024、 GRMZM2G010353、 GRMZM2G049547)调控超甜玉米秸秆蛋白质的关键基因,其主要参与蛋白质和酶合成等途径。

NRL(NPH3/RPT2-Like)是植物所特有的一类光响应蛋白,在向光素信号途径中发挥重要作用。利用生物信息学手段结合qRT-PCR技术,在玉米基因组水平对该家族基因进行鉴定并对其编码蛋白的性质、结构、进化、生育期组织表达和逆境表达进行分析。结果鉴定了31个ZmNRL基因,不均匀地分布于玉米9条染色体上,编码的氨基酸序列长度在464~749个,预测具有叶绿体、细胞核和细胞质等亚细胞定位。依据蛋白保守性将ZmNRL家族划分为四大类,基因结构也具有一定的保守性,多数基因含有4个外显子。基因启动子存在大量脱落酸、茉莉酸、光响应和抗氧化等顺式元件分析,其中G-box和Sp1等两类光相关元件数量较多。ZmNRL家族基因在生育期组织部位表达具有一定的时空特异性,总体表达量不高,仅有ZmNRL2、ZmNRL4、ZmNRL24和ZmNRL29相对高表达。通过生育期组织表达数据共表达及其模块GO富集分析发现,6个ZmNRL基因可通过叶绿体等生物发生及组装生物过程,参与对叶片生长发育的调控。qRT-PCR结果表明,高温处理玉米幼苗ZmNRL12上调表达显著,干旱、盐和病原物接种处理ZmNRL5、ZmNRL7和ZmNRL19基因下调表达。综上,在玉米基因组鉴定出31个ZmNRL基因,该家族基因不仅具有明显的组织表达特异性,而且可参与玉米幼苗对生物和非生物逆境应答。

谷子叶色突变体是探究叶绿体发育机制和C4光能利用率的理想材料之一。为了研究谷子叶色突变的分子机制，从谷子主推品种长农35号的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变库中筛选鉴定到一个苗期条纹叶突变体wsl2，通过表型鉴定、遗传背景检测和遗传分析，同时利用MutMap方法快速精细定位突变基因，并根据突变位点开发共分离分子标记等方面对该突变体进行研究。结果表明， wsl2在苗期表现为条纹叶表型，但从拔节期开始恢复为正常叶片表型； wsl2与野生型遗传背景相同且wsl2受一个隐性核基因控制；MutMap精细定位的关联区间内包含9个非同义突变基因，其中， Seita.9G561800是一个编码与叶绿体相关的PsbP蛋白基因，含有6个外显子和5个内含子，在第1外显子77 bp处发生G/T碱基突变，导致一个精氨酸（R）突变成亮氨酸（L）。根据突变碱基设计了dCAPS标记MRI498-1（Cac8 Ⅰ）和共分离标记MRI501-3，进一步验证了wsl2突变体的候选基因突变位点。研究鉴定了一个新的条纹叶突变体wsl2，对PsbP基因光合作用反应机制的进一步研究奠定了理论基础，丰富了谷子叶色突变体资源，同时验证了MutMap方法克隆谷子突变基因的有效性。

通过鉴定红麻全基因组中WRKY基因家族所有成员,并分析其在盐胁迫下的表达特征,从而为研究WRKY基因家族成员在红麻响应盐胁迫过程中的生物学功能奠定坚实基础。利用生物信息学的方法对红麻全基因组中的WRKY基因家族成员进行鉴定,并对WRKY基因家族各成员的理化性质、系统发育和保守功能域进行分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析盐胁迫下WRKY基因家族各成员的表达特征。结果表明,共鉴定出33个WRKY基因家族成员,且该基因家族成员不均匀地分布在12条染色体上,每个基因家族成员的理化性质如氨基酸数目、分子质量、理论等电点都存在一定的差异,且每个基因家族成员的氨基酸保守序列WRKYGQK没有发生变异。红麻和拟南芥的WRKY基因家族系统进化树分析表明,33个WRKY家族成员分成了3个类群,GroupⅠ、GroupⅡ、Group Ⅲ,其中Group Ⅲ包含了5个亚组。实时荧光定量PCR技术分析结果表明,盐胁迫诱导表达的WRKY家族成员有26个,其中23个具有正向调控作用,3个具有负向调控作用。共鉴定出红麻WRKY家族成员33个,其中26个WRKY家族成员参与了红麻盐胁迫响应过程。

WRKY是植物特有的一类转录因子,在非生物胁迫应答、种子休眠与发芽、生长发育等方面起重要作用。为揭示大豆WRKY转录因子家族中GmWRKY44基因的功能和潜在的分子机制,对大豆Williams 82中GmWRKY44基因进行了生物信息学分析及功能验证。结果表明,GmWRKY44基因CDS全长1 077 bp,编码358个氨基酸;结构预测与进化分析结果显示,其编码的蛋白质二级结构由23.46% α-螺旋、4.75% β-折叠、58.94%无规则卷曲和12.85%延伸链构成,三级结构与二级结构相统一;含一个保守的WRKY结构域,锌指结构为C₂H₂类型,属WRKY IIc亚家族;该基因是拟南芥AtWRKY71的同源基因,相似度为35.56%,两者具有相似的基因结构。RT-qPCR分析表明,GmWRKY44响应盐胁迫,表达量先下降后上升。在盐胁迫下,野生型(Col-0)和GmWRKY44过表达拟南芥株系的萌发率和根长均受到一定程度抑制,但GmWRKY44过表达株系明显优于Col-0。另外,在盐处理后,GmWRKY44过表达株系生长受抑制程度低于Col-0。生理指标分析发现,在盐胁迫下,GmWRKY44过表达株系的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于Col-0,而丙二醛(MDA)含量显著低于Col-0。以上表明,GmWRKY44过表达可以提高转基因拟南芥的耐盐性。

为探究RPM1在高粱抗病过程中的作用,以高粱抗黑穗病品种SX44B为材料,采用同源克隆法获得一个高粱SbRPM1基因。生物信息学分析结果显示:该基因的cDNA全长2 802 bp,预测共编码933个氨基酸。该基因编码蛋白的理论分子质量为106.1 ku,等电点为7.11,为亲水性蛋白质;该蛋白无跨膜结构,亚细胞定位在细胞质中。保守结构域分析显示,SbRPM1蛋白含有RX-CC-like、NB-ARC和LRR结构域,属于NLRs受体蛋白家族中的CNL类蛋白。系统发育关系分析表明,SbRPM1蛋白与南荻RPM1蛋白亲缘关系最近。通过实时荧光定量PCR技术检测SbRPM1基因的表达模式,结果表明,该基因在叶和花序中表达量较高,其次是根,在茎中表达量最低。在接种丝黑穗病原菌后24~72 h抗病品种中SbRPM1基因的表达显著上调,表明该基因受病原菌诱导表达,在高粱抗病反应中扮演着重要角色。首次在高粱中克隆得到SbRPM1基因CDS序列,解析了该基因的结构、性质与表达的特征。

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作为参与基础代谢的一类重要酶,在植物细胞代谢、光呼吸和防御活动中起重要作用。为了解西瓜中SHMT基因家族生物信息学功能,探究其在非生物胁迫下基因表达特性,进而为西瓜SHMT基因家族的功能开发以及选育西瓜抗逆基因提供基础。采用生物信息学方法鉴定西瓜SHMT家族成员,进一步利用RT-qPCR技术分析ClSHMTs在不同组织和非生物胁迫下的表达模式。结果显示,在西瓜全基因组中,共鉴定到8个ClSHMTs基因家族成员,该家族成员随机分布在6条染色体上,依次命名为ClSHMT1~ClSHMT8。每个基因家族成员的理化性质,如氨基酸数目、分子量、等电点等存在一定的差异。其编码的氨基酸个数为471~585,分子量为51.87~65.00 ku,等电点为6.57~8.52,均为亲水性蛋白;亚细胞定位预测主要分布于线粒体上。基因结构和蛋白保守基序分析显示,ClSHMTs结构由4~15个外显子以及3~14个内含子组成,且均含有SHMT保守结构域。进一步与黄瓜、小麦等6个物种进行系统进化分析可知,50个SHMTs分3个亚族,Group Ⅰ~Ⅲ。启动子顺式作用元件分析显示,ClSHMTs启动子上均含有大量光响应、植物激素、逆境胁迫等元件。表达模式分析显示,6个ClSHMTs在西瓜不同组织中均有表达,其中,ClSHMT1、ClSHMT4、ClSHMT5、ClSHMT8在叶中表达量显著高于其他组织;在低温、干旱和盐胁迫下,ClSHMTs表达丰度各异,但集中为上调表达。综上,本研究对西瓜SHMT基因家族进行系统性分析和下一步ClSHMTs的生物功能开发提供了基础。

为了探索花生高油育种新途径,建立一种直接育成高油花生种质的新方法,采用离体诱变育种技术进行花生高油新种质创制。以吉花9号胚小叶为诱变试材,吉花9号和吉花54为对照试材,以博来霉素作为诱变剂。胚小叶消毒后放置在梯度诱变培养基中,筛选博来霉素诱变半致死浓度,体胚萌发成苗后以无菌花生苗作为砧木采用插接法进行无菌嫁接,嫁接成苗后移栽至田间。对2个已知调控花生脂肪合成基因WRI1进行生物信息学分析,并通过籽粒中WRI1基因表达和诱变植株粗脂肪含量相关性进行试验可行性验证。当博来霉素质量浓度在3 mg/L时,诱变效果最佳。吉花9号突变体IM13-3的粗脂肪含量高于吉花9号(CK₁,试材品种对照)和吉花54(CK₂,高油品种对照)。2个WRI1基因WRI1X2和WRI1X1分别编码366,357个氨基酸,都是不稳定亲水性蛋白。在籽粒中WRI1基因表达量与粗脂肪含量呈显著正相关。率先采用博来霉素作为花生离体诱变诱变剂,通过此离体诱变方法获得吉花9号高油突变体IM13-3,粗脂肪含量为56.64%。测定了高油突变体WRI1基因表达量,与对照品种存在显著差异。证明花生离体诱变方法育种方法可行性。

植物磺化肽激素受体(PSK receptor,PSKR)在促进植物细胞增殖和非生物胁迫中起着重要作用。为了探讨小麦PSKR的序列特征和生物学功能,采用同源克隆技术,从普通小麦品种晋麦47根组织中克隆出TaPSKR1 3个部分同源基因的cDNA序列,因3个基因分别位于6A、6B和6D染色体上,故分别命名为TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D。并且利用生物信息学手段对其基因结构、蛋白理化性质、顺式作用元件、功能结构域及系统进化树进行分析,通过qRT-PCR分析TaPSKR1基因在不同组织以及不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D均包含一个外显子,其开放阅读框分别为3 153,3 132,3 156 bp,分别编码1 050,1 043,1 051个氨基酸。生物信息学分析结果表明,TaPSKR1定位在细胞膜上,具有信号肽、跨膜结构域和8个LRRs结构域及胞内激酶结构域,属于PSKR家族成员。系统进化显示,TaPSKR1蛋白与小麦近缘物种及水稻亲缘关系较近,处于同一分支上。实时定量PCR分析结果表明,TaPSKR1基因在根、茎、叶片、穗和种子中均有表达,在根中的表达量极高;逆境胁迫分析表明,干旱和盐胁迫处理下,叶片中TaPSKR1的3个部分同源基因的表达急剧上调,推测TaPSKR1可能在小麦抵抗逆境胁迫过程中起重要的调控作用。

小麦优质亚基7^OE在优质小麦培育方面具有重要作用,虽然针对该优质亚基已开发了高通量的KASP标记,但与由SNP开发的KASP标记不同,仍存在无法有效区分纯合与杂合的问题。为明确7^OE亚基是否纯合的问题,以含有7^OE亚基的津强6号(含7^OE+8^*亚基)和不含7^OE亚基的科农199(含7+9亚基)及其杂交后代为材料,把小麦的Waxy-D1基因作为内参基因,利用KASP标记中使用的通用双色荧光,通过定量PCR检测7^OE基因相对内参基因的相对拷贝数来确定7^OE基因是否存在以及是否纯合,并用相关分子标记对检测结果进行验证。结果表明,含7^OE基因的亲本津强6号相对拷贝数最高,不含7^OE基因的亲本科农199相对拷贝数为0,其杂交F₁相对拷贝数居中,3种类型很容易分开。在其F₂分离群体,7^OE基因的相对拷贝数也很容易分为高、中和0 3种类型,对其中检测为7^OE基因纯合与杂合的基因型进一步用9亚基的PCR标记(能同时检测分别与7亚基和7^OE亚基紧密连锁的9亚基和8^*亚基)进行检测,检测结果完全一致。建立的高通量7^OE通用双色荧光定量PCR标记能准确区分7^OE亚基是否存在以及是否纯合,对促进优质亚基7^OE的分子标记辅助选择具有积极作用。

植物NADPH氧化酶Rbohs是活性氧(ROS)的主要来源,参与植物的生长、发育、抗逆和植物-微生物的互作等多种生理过程。为探索Rbohs在共生固氮中的功能和作用机制,克隆了1个大豆Rbohs基因家族成员GmRbohL,利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法,分别对基因的表达模式、蛋白质的亚细胞定位及基因的功能进行了研究。结果显示:GmRbohL基因受根瘤菌诱导,在大豆根和根瘤中特异性高表达。亚细胞定位分析发现,该基因编码蛋白GmRbohL是一种膜蛋白。构建了GmRbohL的植物基因沉默(RNAi)载体,利用发根农杆菌K599介导的大豆毛根转化法,得到转基因毛状根。GmRbohL的基因沉默导致转基因毛状根的根瘤数量明显减少,ROS的产生也受到了抑制。根瘤器官发生阶段根瘤菌的侵染事件明显减少,结瘤标志基因的表达水平也随GmRbohL表达量的降低而降低。根瘤组织切片显示,GmRbohL的基因沉默显著减少了根瘤侵染区共生体的数量,根瘤的固氮酶活性也相应降低。以上数据表明,GmRbohL的基因沉默降低了ROS的产生水平,显著抑制了大豆的共生结瘤过程。推测GmRbohL可能在大豆根瘤的器官发生以及固氮功能调控方面发挥重要的正调控作用。

选育抗性品种是小麦叶锈病防治举措中最经济、可行的方法。为进一步挖掘抗病基因,选取河南、河北、山东等8个省小麦产区50个小麦品种。首先在苗期将16个叶锈菌生理小种(THFS、TGTS、THJS、FHKT、FGJN、KHKS、FCJQ、RFKS、THFM、MHGT、KHGS、KBGT、FHGT、PHHT、FHJT、FCJT)接种在36份小麦抗叶锈病近等基因系材料以及50个供试小麦品种上。因各菌种带有不同毒力,可根据表现型的差异,再将已知抗病基因紧密连锁的特异性分子标记与之结合分析,进而推测50份小麦材料中可能含有的抗叶锈病基因。通过基因推导、分子标记以及系谱分析综合鉴定抗锈性基因,结果表明,在50个品种中共检测出9个(Lr1、Lr2c、Lr10、Lr16、Lr26、Lr34、Lr37、Lr45和Lr46)已知抗叶锈性基因和少量未知基因。含有Lr1基因的有淄麦12等22个品种;含有Lr2c基因的有鲁麦14等10个品种;含有Lr10基因的只有莱州9361一个品种;含有Lr16基因的有科农199等25个品种;含有Lr26基因的有徐州24等15个品种;含有Lr34基因的有宝麦3号和京冬8号;含有Lr37基因的有淄麦12、鹤0927和荷9946;含有Lr45基因的有连麦2号等11个品种;含有Lr46基因的有山农19等38个品种。

前期转录组学分析发现,ZmRAV1为玉米响应干旱胁迫的候选基因,为了深入研究该基因的功能,克隆了ZmRAV1基因,应用生物信息学分析了ZmRAV1的编码序列,并在拟南芥中过表达该基因,通过干旱条件下过表达拟南芥株系表型、生理生化指标的测定验证其功能。结果表明:ZmRAV1基因全长1 176 bp,共编码389个氨基酸,二级结构中无规则卷曲占比最多,是一种不含信号肽、非跨膜的亲水性蛋白。亚细胞定位显示,该基因编码蛋白位于细胞核。ZmRAV1基因在不同物种间具有较高的保守性。从系统发育树上看,ZmRAV1与五节芒同源基因亲缘关系最强,同源性较高。干旱胁迫处理后,萌发期过表达拟南芥株系的根长显著高于野生型(WT)拟南芥,幼苗期野生型经过干旱胁迫后出现枯萎甚至死亡,存活率低于过表达株系,且干旱处理后ZmRAV1过表达株系过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性均高于野生型,表明过表达ZmRAV1基因可提高拟南芥对干旱胁迫的抗性。综上所述,通过ZmRAV1基因编码序列的生物信息学分析以及转基因拟南芥株系的生理生化指标测定明确了ZmRAV1在响应干旱胁迫的过程中发挥正向调控的作用。

为了研究棉花中AOP2-like(GhAOP2-like)与抗旱耐盐的相关性,根据河北省农林科学院棉花研究所遗传育种研究室前期获得的蛋白质组数据,利用同源克隆法得到了GhAOP2-like的基因序列,用生物信息学方法对GhAOP2-like蛋白的理化性质、结构、亚细胞定位等进行了分析,利用qRT-PCR技术检测了GhAOP2-like的组织特异性表达以及在干旱、盐和激素处理下的表达量变化。结果显示,GhAOP2-like位于D13染色体上,CDS序列长972 bp,编码323个氨基酸。生物信息学分析发现,GhAOP2-like蛋白的分子式为C₁₆₅₄H₂₅₂₅N₄₂₉O₄₇₈S₁₉,理论等电点为5.20,不含信号肽和跨膜结构域,定位于细胞质中。聚类分析结果显示,棉花与其他物种中的AOP序列被明显分成2组,但与木槿中AOP序列关系最近。根据qRT-PCR的结果,发现GhAOP2-like在根、茎、叶和发育中的种子中都表达,但在根中表达量最高,并且在干旱、盐、GA₃、MeJA和ABA处理下上调表达,但在MeJA处理下表达变化最强烈,说明GhAOP2-like可能通过参与茉莉酸信号通路调节根系的生长从而提高陆地棉的抗逆性。

小麦赤霉病是严重威胁小麦安全生产的真菌性病害,利用分子标记辅助选择聚合抗病基因已成为当前抗赤霉病育种的快速有效策略。为建立小麦抗赤霉病基因的高通量筛选体系、创制抗赤霉病新种质并提升四川小麦赤霉病抗性,利用100K SNP芯片对14个四川小麦品种(系)和3个抗赤霉病种质进行全基因组基因型分析。基于已报道的主效抗赤霉病基因Fhb2、Fhb4、Fhb5的遗传连锁区间,筛选获得与目标基因连锁(Fhb2、Fhb4)或共分离(Fhb5)的SNP位点,并据此开发特异性KASP标记。结果显示,基于100K SNP芯片,17份小麦品种(系)按遗传相似性可以划分为两大类:含有北方小麦遗传背景的抗病种质NMAS070和NMAS069独立成簇,与四川小麦品种(系)间亲缘关系较远;其余15份品种(系)聚为一类并进一步分为2个亚类。功能基因检测揭示抗病亲本携带赤霉病抗性位点,而农艺亲本则富集产量与品质相关优异等位变异。通过SNP位点筛选,在Fhb2、Fhb4连锁区间及Fhb5共分离区间内共鉴定出8个关键SNP位点,据此成功开发4对Fhb2、2对Fhb4和2对Fhb5的特异性KASP标记。验证试验表明,所有KASP标记均能实现精准分型,并已有效应用于赤霉病抗病分子育种实践。开发的小麦抗赤霉病基因Fhb2、Fhb4、Fhb5高效KASP标记体系为小麦赤霉病抗性改良提供了重要技术支撑,对提升西南麦区小麦品种赤霉病抗性具有重要应用价值。

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

为系统解析WRKY转录因子家族成员在小麦生长发育调控及非生物胁迫应答中的作用,研究了TaWRKY基因在干旱、高盐、低温等逆境条件下的表达模式特征。以普通小麦品种中国春为材料,通过分子克隆技术获得TaWRKY70基因,其编码区全长885 bp,编码294个氨基酸的不稳定亲水性蛋白。生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的WRKYGQK保守结构域及C₂HC型锌指结构,符合第Ⅲ类WRKY转录因子的分类特征。通过启动子顺式作用元件分析发现,TaWRKY70启动子区域存在参与茉莉酸甲酯响应、脱落酸响应、乙烯响应等调控元件。基因共表达分析表明,TaWRKY70与小麦对激素响应、对微生物的防御反应、对寒冷等非生物胁迫的应答等多个抗逆过程相关。系统进化树分析表明,TaWRKY70蛋白与大麦、玉米、高粱和谷子等禾本科作物的WRKY70亲缘关系较近。亚细胞定位结果证明,TaWRKY70定位于细胞核,符合转录因子特征。通过表达模式分析发现,TaWRKY70在小麦根、茎、叶、幼穗和籽粒中均有表达,并且在根和叶中表达较高。在非生物胁迫下,TaWRKY70在脱落酸和低温处理下表达下调,在水杨酸、NaCl、PEG6000和高温处理下表达上调。综上,通过克隆小麦TaWRKY70基因并分析其表达模式,为下一步解析TaWRKY70参与小麦抗逆的分子机制提供了基础。

为探究大豆GmPP2C89基因在植物非生物胁迫响应和适应过程中的功能,利用转录组数据和荧光定量PCR方法检测GmPP2C89基因在NaCl、PEG和甘露醇处理下的表达模式;接着分析GmPP2C89基因启动子上响应非生物胁迫的顺式作用元件,并根据元件的分布克隆不同长度的启动子构建融合GUS载体,获得对应的转基因拟南芥,通过GUS染色分析启动子对NaCl、PEG和甘露醇处理的响应。构建GmPP2C89基因过表达的转基因拟南芥,在正常条件和NaCl处理条件下测定根长、叶片MDA含量和电解质渗透率以及盐胁迫相关基因(SOD、POD、CAT、RD26、RD29A和RD29B)的表达水平。结果显示,NaCl、PEG和甘露醇处理均导致大豆GmPP2C89基因表达水平显著上调;在其启动子区含有较多ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等参与非生物胁迫响应的顺式作用元件,并且该启动子对NaCl处理具有更强的响应。此外,在盐处理条件下,转基因拟南芥GmPP2C89-OX根长显著大于WT,而MDA含量和电解质渗透率显著低于WT,耐盐性明显增强;抗氧化酶基因(SOD和POD)和ABA途径关键基因RD29B在GmPP2C89-OX中的表达水平显著高于WT。结果表明,大豆GmPP2C89基因受NaCl、PEG和甘露醇诱导表达上调,GmPP2C89过表达可通过激活抗氧化途径和ABA途径增强转基因拟南芥的耐盐性。

植物钠氢反转运蛋白(NHX,Na⁺/H⁺ antiporter)在植物钠钾离子平衡、细胞pH值调节中起重要的作用。为探究黑麦耐盐性与NHX的关系,通过生物信息学流程对黑麦的NHX基因进行鉴定与分析,结合RT-qPCR技术对ScNHXs在盐胁迫下的表达模式进行检测,为探究NHX基因在黑麦中的潜在功能以及黑麦耐盐基因挖掘等研究提供参考信息。共鉴定获得10个黑麦NHX基因家族成员(ScNHX1~ScNHX10),系统进化树分析表明,其可分为Vac和Endo 2个亚家族,分别包含4,6个基因。其编码蛋白理化性质分析表明,分子质量为27.92~59.72 ku,氨基酸数目为253~546 aa,等电点为5.17~8.81,大多数蛋白属于酸性蛋白,均未预测到信号肽存在但均具有跨膜结构,亚细胞定位预测ScNHXs定位于质膜和液泡中。空间结构预测显示,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。基因结构和motif分析发现,ScNHXs的外显子数为13~24,且均具有保守的Na⁺/H⁺交换结构域。此外,顺式作用元件分析表明,ScNHXs启动子区域中均发现众多与激素响应以及非生物胁迫响应等生物过程相关的元件。黑麦转录组数据分析发现,在黑麦的不同组织中ScNHXs表达模式存在明显差异。RT-qPCR分析表明,ScNHXs对不同浓度NaCl胁迫有不同程度的响应,并且在较长时间内能够持续响应盐胁迫。综上所述,ScNHXs可能参与黑麦对盐胁迫的生物调节相关过程。

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能,进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在GenBank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47,并在目的片段的上下游设计増加酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar,并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar;共获得94株除草剂抗性植株,其中47株目的片段PCR呈阳性反应,对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测,结果表明,花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。

为探究不同浓度盐胁迫对萝卜幼苗生长及相关基因表达的影响，首先以11个不同类型萝卜品种为试材，通过盐胁迫对发芽率的影响，筛选出耐盐品种Yura Hama Daikon和盐敏感品种五斤红；以Yura Hama Daikon和五斤红为试材，研究了不同浓度盐胁迫对幼苗株高及叶焦指数的影响。结果表明：在100，200 mmol/L盐胁迫下，Yura Hama Daikon和五斤红的株高均显著下降，叶焦指数显著上升。相比盐敏感品种，耐盐品种株高下降幅度小，叶焦指数小。在200 mmol/L盐胁迫下，耐盐品种Yura Hama Daikon的株高下降幅度和叶焦指数分别为46.18%和20.56，而盐敏感品种五斤红为75.25%和56.11。利用qPCR对不同浓度盐处理下RsCAT和RsSOD基因在耐、感盐品种的表达模式进行分析，结果表明：低浓度盐处理后RsCAT的表达量先升后降，峰值出现在7 d左右；高浓度盐处理时，感盐品种该基因的表达量在48 h最高，而耐盐品种中表达量逐渐升高，维持时间较长，在7 d最高。RsSOD基因的表达模式表现为，高盐浓度处理后，耐盐品种的应激响应更迅速，24 h表达量最高，之后维持较高的水平，而在盐敏感品种RsSOD的表达量最大值出现在14 d。相关研究结果将为揭示萝卜响应盐胁迫机制提供参考，为创制耐盐萝卜新品种提供技术支撑。

分蘖高于主茎是困扰高粱品种整齐度和机械化生产的重要原因之一,为了阐明高粱调控分蘖高度基因的作用机制,提高高粱品种整齐度、选育适宜机械化生产高粱品种,依据前期的定位结果,利用15份分蘖与主茎整齐一致和17份分蘖高于主茎的高粱品种组成自然群体对候选基因进行验证,发现SNP3位点影响分蘖高度,所属基因为Sobic.009G213300.1.v3.2,命名为SbTH,位于水解酶_4保守区域。以分蘖高度与主茎一致的K35-Y5和分蘖高于主茎的1383为材料,通过实时荧光定量PCR分析SbTH基因在高粱不同组织中的表达模式。结果表明,2个材料SbTH基因在根和叶中均有表达,虽然表达量有差异,但趋势基本一致;1383主茎和分蘖茎基因表达量和趋势也基本一致,而K35-Y5在主茎开花期时呈反向表达,主茎表达量达到最高,同期的分蘖茎表达量降到最低。分析认为,SbTH在K35-Y5分蘖中表达量低,控制了分蘖节间的过度生长,形成主茎与分蘖高度一致的株型,而在1383分蘖中表达量高,促进分蘖节间的生长,使得分蘖比主茎高,SbTH基因在主茎开花期的差异表达是影响分蘖株高的关键。

RNA聚合酶Ⅱ相关因子Paf1(RNA polymerase Ⅱ associated factor 1)复合物是由6个亚基组成的真核生物重要的转录调控因子,其对特定基因的表达调控作用与植物的生长、发育和环境信号响应等生命活动密切相关。为探究小麦Paf1对逆境胁迫的响应特征,采用同源序列比对方法鉴定小麦的各Paf1亚基基因,通过mCherry融合蛋白的过表达和荧光显微观察鉴定各亚基蛋白的亚细胞定位,使用qRT-PCR方法分析各亚基基因对不同逆境胁迫的表达响应。结果表明,小麦Paf1的亚基TaVIP3、TaVIP4、TaVIP5、TaVIP6和TaPHP均由1套部分同源基因编码,其余1个亚基TaVIP2则由2套部分同源基因编码。植物VIP2的N端含有1个长度可变的富含脯氨酸残基区段,小麦的TaVIP2 还特有1个富含谷氨酰胺残基区段。TaVIP2、TaVIP4、TaVIP5和TaVIP6均为细胞核蛋白,而TaVIP3和TaPHP蛋白则可同时分布于细胞质和细胞核。各亚基基因在不同组织中的组成型表达差异模式相似,在叶片中的表达统一受高温胁迫的上调和高盐、干旱胁迫的下调。综上所述,小麦响应逆境胁迫的反应涉及对转录调控因子Paf1亚基基因表达水平的调节。

分析谷子成花素基因（Hd3a）在不同光周期条件下的表达规律，旨在揭示成花素基因在光周期调控谷子开花过程中扮演的角色。首先利用生物信息学方法获得位于谷子4号染色体的成花素基因序列（Seita.4G067600），命名为SiHd3a，然后根据基因序列设计1对特异引物，提取谷子农家种黄毛谷总RNA，利用RT-PCR技术克隆得到黄毛谷SiHd3a基因cDNA序列，其长度为792 bp，包含一个537 bp的CDS区，编码178个氨基酸；预测SiHd3a蛋白的分子质量为19.74 ku，等电点为6.82，初步判断其为亲水蛋白；蛋白质的二级结构中无规则卷曲所占比例最高（43.26%），其次为延伸链（β-折叠，29.21%）、α螺旋（16.29%）、β转角（11.24%）；亚细胞定位分析发现，SiHd3a蛋白定位在细胞质和细胞间质；基于Hd3a蛋白序列进化分析发现，谷子与野生黍、玉米、高粱之间的亲缘关系比较近，聚在一组，而与水稻亲缘关系较远。半定量PCR发现， SiHd3a基因在短日照条件下表现为昼夜节律性表达，在早晨6：00、中午12：00各有1个表达峰，而在长日照条件下基因24 h内表现稳定表达水平。推测谷子SiHd3a基因长、短日照条件下昼夜表达模式的差异是导致其光周期敏感性的可能原因。

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中，在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探讨棉花MYB转录因子的功能，采用同源克隆技术，在棉花叶片组织中克隆GhMYBPA1基因，并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明，从中棉35中成功克隆得到1个新的MYB转录因子基因GhMYBPA1（基因登录位点为XM_016869420），cDNA全长为825 bp，开放阅读框630 bp，编码210个氨基酸；生物信息学分析结果表明，GhMYBPA1蛋白分子质量为20.183 ku，N端含有2个MYB的DNA保守结合域，属于R2R3-MYB型转录因子；氨基酸同源分析发现，GhMYBPA1蛋白与来自亚洲棉GaMYB12-like同源性较高；qRT-PCR分析结果表明，GhMYBPA1在棉花根、茎、叶、花中均有表达，花中相对表达量最高，其次是叶；逆境胁迫分析表明，在受到高盐、低温和干旱处理诱导时，GhMYBPA1基因的表达量均发生了变化，推测GhMYBPA1可能在棉花非生物胁迫过程中起重要的调控作用。研究结果可为进一步开展GhMYBPA1基因功能研究奠定理论基础。

为探索1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)是否参与香鳞毛蕨对环境的抗逆功能,用PCR克隆并鉴定了香鳞毛蕨DfDXR基因,并通过在线预测网站对其蛋白序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了DfDXR基因在不同化学物质和逆境胁迫处理下相对表达量的变化。结果表明,成功克隆出DfDXR基因的CDS序列全长1 434 bp,编码477个氨基酸,DXR蛋白二级结构为alpha-beta型。蛋白质多序列比对以及进化树分析表明,DfDXR与铁线蕨AcDXR亲缘关系较近,与苹果和桃等植物的DXR蛋白亲缘关系较远,Motif分析表明,该蛋白含有PLN02696结构域,该结构域为DXR蛋白的保守结构域,亚细胞定位预测DXR蛋白定位于叶绿体上,与其他物种一致。对qRT-PCR数据进行分析显示,DfDXR的相对表达量在茉莉酸甲酯(MeJA)和聚乙二醇(PEG)处理后总体都呈现上调的趋势,并分别在1,12 h达到最高;NaCl处理下呈“降—升—降”的趋势,但各处理时间下的表达量均低于对照组;水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(ETH)、高温(HT)以及低温(LT)处理下,DfDXR的相对表达量也发生明显变化。在香鳞毛蕨响应不同非生物胁迫过程中,DfDXR均发挥调控作用,且DfDXR对不同化学物质和逆境胁迫的响应时间不同。

为明确玉米总叶片数与穗上叶片数的遗传特性,揭示其对玉米产量潜力、生物量积累及抗倒伏性的调控作用,开展控制玉米叶片数的 QTL 定位及基因挖掘的试验。利用SLAF-seq 技术对昌7-2和PHB1M及其138份F_2∶3家系进行高通量测序,结合60 000(E1),120 000(E2)株/hm² 2个种植密度处理下的叶片数表型数据进行QTL定位,并对定位结果进行基因挖掘。结果表明,分布在8号染色体上的2个总叶片数QTL为主效QTL,贡献率分别为 16.96%和23.08%,加性效应值为负值;3个穗上叶片数的QTL分布在2号和4号染色体,加性效应值为正值,分布在4号染色体的2个QTL为主效QTL,贡献率分别为10.18%和14.75%;总叶片数和穗上叶片数的QTL分布在不同染色体区域,可能受到相对独立的遗传调控。基因功能分析发现,筛选到的基因参与碳水化合物代谢和植物激素信号转导途径等,同时筛选到部分转录因子。本研究结果为进一步揭示玉米叶片数的遗传基础提供更丰富的理论支持,为分子标记辅助育种提供靶点。