草甘膦是目前使用最广泛的广谱灭生性除草剂,培育耐草甘膦作物将有助于改善农田杂草化学防控效果、减少用药量和简化防控措施。为充分挖掘小麦耐草甘膦基因位点,利用来自黄淮麦区的484份种质资源进行草甘膦耐药性鉴定,根据小麦15K SNP芯片数据,采用全基因组关联分析的方法,挖掘与小麦草甘膦耐药性相关QTL。结果显示,不同年代培育的小麦品种草甘膦耐药性的变化趋势缓慢,草甘膦耐受性未显著提升;根据表型鉴定结果,筛选出黄淮麦区耐草甘膦小麦种质材料3份,即河农130、冀麦782和泰山23号;利用全基因组关联分析方法,检测到与小麦草甘膦耐药等级显著相关的QTL 7个,包含19个显著性SNPs,分布于小麦1A(0.00~30.48 Mb)、1B(6.57~30.57 Mb)、1D(0.00~22.98 Mb)、4A(656.09~680.09 Mb)、5A(508.19~532.19 Mb)、6A(54.56~85.09 Mb)和6D(12.02~36.02 Mb)染色体上;位于小麦1A和6A染色体上的2个QTL qGlyT-1A和qGlyT-6A是小麦耐草甘膦的主效位点,共包含16个可能与小麦耐草甘膦相关的基因。

利用RT-PCR技术从延谷11号谷子中克隆SiPRR73基因,通过系统分析SiPRR73组织表达特异性,对不同光周期处理、不同光温组合处理以及5种非生物胁迫处理的响应特点,揭示光周期、温度对SiPRR73的调控模式及SiPRR73对非生物胁迫的应答模式。结果表明,从延谷11号克隆得到SiPRR73基因2 928 bp的cDNA序列,包含2 283 bp的CDS区,编码760个氨基酸;SiPRR73蛋白与C4家族作物糜子、哈氏黍、高粱、玉米PRR73蛋白具有较近的进化关系。 SiPRR73在顶端第2片叶中表达水平最高,在根、茎、穗部表达水平较低。短日照、长日照条件下该基因均表现光照期表达水平高于黑暗期的特点,且整个营养生长期短日照条件下表达水平明显低于长日照,SiPRR73受光诱导表达和光周期调控。温度决定SiPRR73表达峰的数目,光周期决定SiPRR73表达峰出现的时间,光周期和温度共同参与了SiPRR73的表达调控。PEG和低温胁迫总体上诱导SiPRR73表达,NaCl在胁迫早期诱导该基因表达,后期总体表现为抑制状态,Fe胁迫则早期抑制该基因表达,后期总体诱导其表达,SiPRR73对ABA胁迫的响应特点接近NaCl。以上研究表明,谷子SiPRR73表达具有光依赖性,光周期和温度以互作模式调控SiPRR73表达,推测SiPRR73参与了谷子对不同光温环境的适应性调节过程,并且在应对干旱、低温、ABA、NaCl、Fe胁迫过程中发挥了一定作用。

为了解谷子中SibHLH19的功能,以抗病谷子材料十里香叶片cDNA和基因组DNA为模板,分别克隆到SibHLH19基因的CDS序列和启动子序列,并利用生物信息学在线工具分析了启动子顺式作用元件及生物学特征;采用Real-time PCR技术检测了SibHLH19转录因子在谷子不同组织部位和抗谷锈病过程中的表达丰度变化;利用SDS-PAGE技术分析了该基因原核表达特征。结果表明,SibHLH19转录因子CDS序列全长843 bp,编码280个氨基酸,预测蛋白质分子质量为29.97 ku,理论等电点pI为5.85,编码蛋白质化学式为C₁₂₉₆H₂₀₇₁N₃₉₇O₄₀₀S₁₁,含有一个bHLH保守结构域,属于不稳定亲水性蛋白质。该蛋白质二级结构的最大元件是无规则卷曲,最小元件为β-转角。进化分析表明,SibHLH19与禾本科植物糜子(RLM85279.1)、哈氏黍(PUZ71581.1)和柳枝稷(XP_039835205.1)氨基酸序列的同源性较高,与小麦(KAF7059972.1)、节节麦(XP_040244423.1)同源性最低。启动子顺式作用元件分析表明,该基因启动子区存在多个激素、胁迫等应答元件。组织表达分析表明,该基因主要在谷子苗期表达,并以苗期地上部分表达量最高,孕穗期几乎无表达。在谷子响应谷锈菌生物胁迫反应的24 h内,SibHLH19基因在抗病反应8,16 h上调表达,而感病反应中仅在16 h略微上调表达,其余时间均下调表达,推测SibHLH19在谷子抗锈病反应中起正调控作用。构建的原核表达载体pET30a-SibHLH19经0.1 mmol/L IPTG诱导能表达出表观分子质量约44 ku的SibHLH19融合蛋白。

转录因子BnHY5-2与植物抗逆性相关。为揭示甘蓝型油菜转录因子BnHY5-2对盐碱胁迫的响应,主要通过瞬时转化过表达、qRT-PCR分析、亚细胞定位等方法,分析甘蓝型油菜转录因子BnHY5-2对光和盐碱的响应。结果表明,光照处理油菜后,在叶与茎中BnHY5-2基因的表达量均显著高于黑暗条件下,分别为黑暗条件下的29.22,3.15倍,叶片对光的敏感性大于茎,说明叶片是响应光转录因子BnHY5-2的主要部位。在光照条件下应用大连滨海盐碱土种植油菜,处理后BnHY5-2的表达在叶和茎中均显著下调,分别下调53.1%,31.0%;在黑暗条件下应用盐碱处理后BnHY5-2的表达在茎中下调48.2%,而在叶中的表达差异则不显著,表现出器官的差异性,说明叶片对光照条件要求更加严格。在油菜叶片中瞬时过表达BnHY5-2基因时,6个与盐碱相关的候选基因的表达中,有2个(BnNAC32、BnGS)上调表达,分别为原来的1.25,3.28倍;而有4个(Bnamy、BnAsp、BnNHX7、BnTPS)下调表达,分别下降24.8%,25.4%,71.0%,82.0%,同时甜菜碱含量由0.256 mg/g提升至0.573 mg/g,提高了1.24倍,说明过表达BnHY5-2基因会提高油菜的盐碱抗性。亚细胞定位结果显示,转录因子BnHY5-2定位于细胞核中,调控功能基因的表达。因此,BnHY5-2不仅与光信号有关,还参与油菜盐碱抗性。

为探究钙依赖蛋白激酶(CDPK)在小麦生长和逆境应答中的作用,从普通小麦中克隆了TaCDPK17基因,并对其进行了序列结构、表达模式和抗逆功能初步分析。结果表明,TaCDPK17基因编码区长1 701 bp,编码566个氨基酸,具有CDPK家族的典型结构特征,包括1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和4个EF手型结构域。对TaCDPK17与其他12种植物的CDPK17进行进化树分析表明,TaCDPK17与禾本科作物,特别是节节麦、大麦的CDPK17序列有较高同源性。TaCDPK17基因启动子区域富含与激素调控、光照响应,以及非生物应答胁迫相关的顺式调控元件,其中,脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)和茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA)数量较多。基于实时荧光定量PCR的表达分析结果显示,TaCDPK17受100 μmol/L ABA、100 μmol/L茉莉酸甲酯、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl诱导后,表达量有不同程度升高。在2 μmol/L ABA和100 mmol/L NaCl胁迫处理条件下,过表达TaCDPK17的拟南芥种子萌发率显著高于野生型对照。同时,过表达TaCDPK17缓解了ABA或渗透胁迫处理对幼苗根生长的抑制作用。在气孔关闭过程中,过表达TaCDPK17的转基因植物对ABA更敏感,与野生型植物相比,表现出更强的气孔关闭趋势。这些结果表明,TaCDPK17在小麦逆境胁迫和激素信号应答中发挥着重要作用。

通过鉴定红麻全基因组中WRKY基因家族所有成员,并分析其在盐胁迫下的表达特征,从而为研究WRKY基因家族成员在红麻响应盐胁迫过程中的生物学功能奠定坚实基础。利用生物信息学的方法对红麻全基因组中的WRKY基因家族成员进行鉴定,并对WRKY基因家族各成员的理化性质、系统发育和保守功能域进行分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析盐胁迫下WRKY基因家族各成员的表达特征。结果表明,共鉴定出33个WRKY基因家族成员,且该基因家族成员不均匀地分布在12条染色体上,每个基因家族成员的理化性质如氨基酸数目、分子质量、理论等电点都存在一定的差异,且每个基因家族成员的氨基酸保守序列WRKYGQK没有发生变异。红麻和拟南芥的WRKY基因家族系统进化树分析表明,33个WRKY家族成员分成了3个类群,GroupⅠ、GroupⅡ、Group Ⅲ,其中Group Ⅲ包含了5个亚组。实时荧光定量PCR技术分析结果表明,盐胁迫诱导表达的WRKY家族成员有26个,其中23个具有正向调控作用,3个具有负向调控作用。共鉴定出红麻WRKY家族成员33个,其中26个WRKY家族成员参与了红麻盐胁迫响应过程。

植物磺化肽激素受体(PSK receptor,PSKR)在促进植物细胞增殖和非生物胁迫中起着重要作用。为了探讨小麦PSKR的序列特征和生物学功能,采用同源克隆技术,从普通小麦品种晋麦47根组织中克隆出TaPSKR1 3个部分同源基因的cDNA序列,因3个基因分别位于6A、6B和6D染色体上,故分别命名为TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D。并且利用生物信息学手段对其基因结构、蛋白理化性质、顺式作用元件、功能结构域及系统进化树进行分析,通过qRT-PCR分析TaPSKR1基因在不同组织以及不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D均包含一个外显子,其开放阅读框分别为3 153,3 132,3 156 bp,分别编码1 050,1 043,1 051个氨基酸。生物信息学分析结果表明,TaPSKR1定位在细胞膜上,具有信号肽、跨膜结构域和8个LRRs结构域及胞内激酶结构域,属于PSKR家族成员。系统进化显示,TaPSKR1蛋白与小麦近缘物种及水稻亲缘关系较近,处于同一分支上。实时定量PCR分析结果表明,TaPSKR1基因在根、茎、叶片、穗和种子中均有表达,在根中的表达量极高;逆境胁迫分析表明,干旱和盐胁迫处理下,叶片中TaPSKR1的3个部分同源基因的表达急剧上调,推测TaPSKR1可能在小麦抵抗逆境胁迫过程中起重要的调控作用。

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能,进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在GenBank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47,并在目的片段的上下游设计増加酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar,并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar;共获得94株除草剂抗性植株,其中47株目的片段PCR呈阳性反应,对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测,结果表明,花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。

干旱胁迫对玉米生长发育造成严重影响,从而导致玉米产量降低。紫色酸性磷酸酶是一种参与植物多种生理生化功能的磷脂酶蛋白,为进一步深入研究紫色酸性磷酸酶家族基因在玉米抗逆过程中的作用,探究了ZmPAP26b基因在干旱胁迫下响应模式,利用实时荧光定量分析模拟干旱条件下不同玉米自交系中的基因相对表达量;从玉米中克隆ZmPAP26b(GenBank:NC_050104.1),并对玉米、拟南芥、水稻、小麦、高粱和二穗短柄草中的PAP基因进行鉴定和生物信息学分析;同时构建原核过表达菌株进行功能验证。结果表明,干旱胁迫下该基因在耐旱材料中表达量下降,干旱敏感材料中表达量上升。该基因CDS全长1 431 bp,编码476个氨基酸。在6个物种中共发现228个PAP基因,系统发育分析发现,共分成4个亚家族。玉米中的19个PAP基因分布在9条染色体上并且具有相似的保守结构域,启动子顺式作用元件分析显示含有响应干旱和激素等元件。原核表达试验发现,含有重组质粒pET28a-ZmPAP26b的菌株在10%PEG-6000和15%PEG-6000模拟干旱胁迫下的生长与空载菌株都受到了抑制。综上所述,推测ZmPAP26b在干旱胁迫下呈负调控模式。

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中，在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探讨棉花MYB转录因子的功能，采用同源克隆技术，在棉花叶片组织中克隆GhMYBPA1基因，并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明，从中棉35中成功克隆得到1个新的MYB转录因子基因GhMYBPA1（基因登录位点为XM_016869420），cDNA全长为825 bp，开放阅读框630 bp，编码210个氨基酸；生物信息学分析结果表明，GhMYBPA1蛋白分子质量为20.183 ku，N端含有2个MYB的DNA保守结合域，属于R2R3-MYB型转录因子；氨基酸同源分析发现，GhMYBPA1蛋白与来自亚洲棉GaMYB12-like同源性较高；qRT-PCR分析结果表明，GhMYBPA1在棉花根、茎、叶、花中均有表达，花中相对表达量最高，其次是叶；逆境胁迫分析表明，在受到高盐、低温和干旱处理诱导时，GhMYBPA1基因的表达量均发生了变化，推测GhMYBPA1可能在棉花非生物胁迫过程中起重要的调控作用。研究结果可为进一步开展GhMYBPA1基因功能研究奠定理论基础。

为研究水稻SAND结构域蛋白的序列和功能,利用Blast在水稻基因组中搜索编码SAND结构域的基因,然后构建增强表达载体并通过遗传转化研究基因功能。结果表明,水稻基因LOC_Os01g57240(命名为OsULT1)编码的氨基酸序列含有SAND结构域和ULT B-box共有序列,与其他植物ULT氨基酸序列相似性为49.3%~92.3%,具有较好的保守性; 35S::OsULT1转基因株系部分颖花发育异常,出现内稃发育滞缓或退化、浆片过度发育或数目变多、雄蕊数目3~7枚、雌蕊2枚的现象;颖花内产生多余的小花,表明OsULT1对水稻花分生组织正常分化具有重要的调控作用。

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作为参与基础代谢的一类重要酶,在植物细胞代谢、光呼吸和防御活动中起重要作用。为了解西瓜中SHMT基因家族生物信息学功能,探究其在非生物胁迫下基因表达特性,进而为西瓜SHMT基因家族的功能开发以及选育西瓜抗逆基因提供基础。采用生物信息学方法鉴定西瓜SHMT家族成员,进一步利用RT-qPCR技术分析ClSHMTs在不同组织和非生物胁迫下的表达模式。结果显示,在西瓜全基因组中,共鉴定到8个ClSHMTs基因家族成员,该家族成员随机分布在6条染色体上,依次命名为ClSHMT1~ClSHMT8。每个基因家族成员的理化性质,如氨基酸数目、分子量、等电点等存在一定的差异。其编码的氨基酸个数为471~585,分子量为51.87~65.00 ku,等电点为6.57~8.52,均为亲水性蛋白;亚细胞定位预测主要分布于线粒体上。基因结构和蛋白保守基序分析显示,ClSHMTs结构由4~15个外显子以及3~14个内含子组成,且均含有SHMT保守结构域。进一步与黄瓜、小麦等6个物种进行系统进化分析可知,50个SHMTs分3个亚族,Group Ⅰ~Ⅲ。启动子顺式作用元件分析显示,ClSHMTs启动子上均含有大量光响应、植物激素、逆境胁迫等元件。表达模式分析显示,6个ClSHMTs在西瓜不同组织中均有表达,其中,ClSHMT1、ClSHMT4、ClSHMT5、ClSHMT8在叶中表达量显著高于其他组织;在低温、干旱和盐胁迫下,ClSHMTs表达丰度各异,但集中为上调表达。综上,本研究对西瓜SHMT基因家族进行系统性分析和下一步ClSHMTs的生物功能开发提供了基础。

为探究不同浓度盐胁迫对萝卜幼苗生长及相关基因表达的影响，首先以11个不同类型萝卜品种为试材，通过盐胁迫对发芽率的影响，筛选出耐盐品种Yura Hama Daikon和盐敏感品种五斤红；以Yura Hama Daikon和五斤红为试材，研究了不同浓度盐胁迫对幼苗株高及叶焦指数的影响。结果表明：在100，200 mmol/L盐胁迫下，Yura Hama Daikon和五斤红的株高均显著下降，叶焦指数显著上升。相比盐敏感品种，耐盐品种株高下降幅度小，叶焦指数小。在200 mmol/L盐胁迫下，耐盐品种Yura Hama Daikon的株高下降幅度和叶焦指数分别为46.18%和20.56，而盐敏感品种五斤红为75.25%和56.11。利用qPCR对不同浓度盐处理下RsCAT和RsSOD基因在耐、感盐品种的表达模式进行分析，结果表明：低浓度盐处理后RsCAT的表达量先升后降，峰值出现在7 d左右；高浓度盐处理时，感盐品种该基因的表达量在48 h最高，而耐盐品种中表达量逐渐升高，维持时间较长，在7 d最高。RsSOD基因的表达模式表现为，高盐浓度处理后，耐盐品种的应激响应更迅速，24 h表达量最高，之后维持较高的水平，而在盐敏感品种RsSOD的表达量最大值出现在14 d。相关研究结果将为揭示萝卜响应盐胁迫机制提供参考，为创制耐盐萝卜新品种提供技术支撑。

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制，以拟南芥基因组DNA为模板设计引物，扩增获得AtSTK基因的启动子序列，并构建到报告载体pAbAi，将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用Bst bⅠ进行单酶切线性化，转化酵母菌株Y1H Gold，线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后，将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌，将菌液涂布到含有100 ng/mL AbA的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定，最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明，酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域，为WRKY类转录因子的一员。因此，AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控，从而影响拟南芥植株的耐盐性。

为了进一步了解MADS-box家族基因的功能，利用生物信息学的手段，首次对甜菜MADS-box基因进行了全基因组的鉴定，并对其染色体定位、系统发生关系、基因结构、保守元件、表达模式以及蛋白功能联系进行预测和分析。结果表明，甜菜MADS-box基因共34个成员，其中，type Ⅰ成员7个和type Ⅱ成员27个，type Ⅰ进一步分为Mα（3）、Mβ（1）、Mγ（3）3个组；type Ⅱ进一步分为MIKC^C（22）和MIKC^*（5）2个组，MIKC^C组可进一步分为AG （2）、AGL12（2）、AP3-PI （4）、Bs （2）、SOC1（1）、SVP （1）、SEP （3）、AGL17（5）、AP1-FUL （1）和FLC （1）10个亚组。MADS-box家族基因在染色体上呈不均匀分布，同一染色体上的基因簇状分布，其中，第6号染色体上分布最多，在第7号染色体上没有分布。甜菜MADS-box家族基因虽然基因结构差别较大，但蛋白序列相对保守。基因表达谱显示，大部分MADS-box基因优势表达于分生组织，部分MADS-box基因在种子、直根、幼叶等组织亦有较高表达。部分MADS-box基因响应盐、热胁迫轻微上调，可能参与甜菜逆境生理调控。

外源施加植物甾醇衍生物-油菜素内酯的信号物质可以显著提高植物的耐盐性。为了检测过表达编码植物固醇关键酶的甲基固醇加氧酶基因(SMO)是否能提高目标植物的盐胁迫耐受性,使用子房注射法,首先将植物甾醇生物合成过程中关键酶-甲基甾醇单加氧酶的编码PnSMO1.1基因转移到裂叶牵牛中,构建了该基因的过表达转基因株系。接着以经PCR鉴定验证的转基因植物株系幼苗为试验材料,在0~200 mmol/L 梯度NaCl处理条件下,检测了不同株系植物的根长和下胚轴长度等生长参数,以及叶片细胞中丙二醛(MDA)的含量、相对电导率、油菜素甾酮和6-脱氧油菜素甾酮含量等生理指标。结果显示,在100~250 mmol/L NaCl处理下,与野生型(WT)植株或空质粒转化对照(BL)植株相比,过表达PnSMO1.1显著增加了转化植株的根和下胚轴的相对生长量,增强了转基因株系的耐盐性。另外,与WT和BL幼苗相比,在不同的NaCl浓度处理条件下,转基因株系中6-脱氧油菜素甾酮的积累显著增加,但相对电导率(rEC)值、油菜素甾酮的积累量或MDA含量均显著降低。盐渍化、干旱和低温等事件的发生,严重抑制了植物的营养生长和产量。这些结果揭示,过表达PnSMO1.1基因,可以通过调节细胞内的油菜素内酯化合物积累量的动态,进而保护质膜的结构完整性,显著提高转基因植物的耐盐性。

为了探明玉米重要自交系花粒期高温胁迫下转录组基因的表达差异，发掘玉米响应高温胁迫的关键基因和蛋白质，明确高温胁迫引起玉米减产的机理，从而利用分子生物学技术手段提高玉米耐高温胁迫性。首先，利用Ampha^TM Z30花粉活性分析仪检测高温胁迫和正常生长条件下玉米自交系昌7-2、郑58的花粉活性。然后收集花粉提取总RNA，利用Illumina Hiseq2000^TM高通量测序技术分别对昌7-2、郑58花粒期高温胁迫材料和正常生长条件下的对照材料进行全转录组测序，序列结果分析后获得差异显著表达基因。通过差异基因维恩图（VENN图）重叠区域分析、GO功能分类和富集统计、KEGG pathway通路分类和富集分析以及转录因子分析，获得玉米花粒期高温胁迫相关的重要差异表达基因和蛋白质。花粉活性检测结果显示，高温胁迫后和正常生长条件下，昌7-2花粉活性分别为24.37%，42.89%，郑58花粉活性分别为35.57%，64.83%。高温胁迫后在昌7-2花粉转录组中共检测到4 176个显著差异表达基因，郑58花粉转录组中共检测到5 487个显著差异表达基因。KEGG pathway通路分类和富集分析结果显示，高温胁迫后郑58的花粉转录组中有2 062个差异表达基因富集到399个相关通路上，昌7-2的花粉转录组中有1 943个差异表达基因富集到352个相关通路上。转录因子分析结果表明，共获得55个转录因子家族，其中，有45个转录因子包含10个以上差异表达基因。研究表明，通过对玉米自交系花粒期高温胁迫后花粉转录组测序获得了大量的差异显著表达基因信息，昌7-2、郑58对高温胁迫响应机制存在明显差异，热激蛋白（Hsps）、热激转录因子（Hsfs）、生长素（IAA）基因和磷脂酰基醇-4，5-二磷酸基因家族（PIP₂）在响应玉米花粒期高温胁迫过程中起着重要作用。

为探究大豆GmPP2C89基因在植物非生物胁迫响应和适应过程中的功能,利用转录组数据和荧光定量PCR方法检测GmPP2C89基因在NaCl、PEG和甘露醇处理下的表达模式;接着分析GmPP2C89基因启动子上响应非生物胁迫的顺式作用元件,并根据元件的分布克隆不同长度的启动子构建融合GUS载体,获得对应的转基因拟南芥,通过GUS染色分析启动子对NaCl、PEG和甘露醇处理的响应。构建GmPP2C89基因过表达的转基因拟南芥,在正常条件和NaCl处理条件下测定根长、叶片MDA含量和电解质渗透率以及盐胁迫相关基因(SOD、POD、CAT、RD26、RD29A和RD29B)的表达水平。结果显示,NaCl、PEG和甘露醇处理均导致大豆GmPP2C89基因表达水平显著上调;在其启动子区含有较多ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等参与非生物胁迫响应的顺式作用元件,并且该启动子对NaCl处理具有更强的响应。此外,在盐处理条件下,转基因拟南芥GmPP2C89-OX根长显著大于WT,而MDA含量和电解质渗透率显著低于WT,耐盐性明显增强;抗氧化酶基因(SOD和POD)和ABA途径关键基因RD29B在GmPP2C89-OX中的表达水平显著高于WT。结果表明,大豆GmPP2C89基因受NaCl、PEG和甘露醇诱导表达上调,GmPP2C89过表达可通过激活抗氧化途径和ABA途径增强转基因拟南芥的耐盐性。

为了探讨柑橘MYB96基因在柑橘抗逆过程中的作用,以甜橙、柠檬、金柑、芦柑为试验材料,克隆得到4个柑橘MYB转录因子家族基因,分别命名为CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96,并对其生物信息学以及不同非生物胁迫处理下的表达模式进行分析。结果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96的开放阅读框长度分别为1 032,1 035,1 035和1 032 bp,其编码的蛋白分别由343,344,344,343个氨基酸组成,分子量分别约为38.16,38.27,38.22,38.13 ku,等电点分别为6.31,6.35,6.35,6.31,均为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果均定位于细胞核。这4个基因编码的蛋白二级结构相似,主要由α螺旋和无规卷曲构成;具有高度保守的R2和R3结构域;在进化关系上,与克莱门氏小柑橘CcMYB96亲缘关系最近。CsMYB96基因的启动子中含有脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTR)、厌氧响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等非生物胁迫响应相关顺式作用元件。qRT-PCR结果分析表明,甜橙CsMYB96能被低温和干旱胁迫诱导表达;柠檬ClMYB96和金柑FmMYB96在高盐胁迫下被诱导表达;而芦柑CrMYB96的表达量在低温、干旱和高盐胁迫下都有不同程度的下调表达。

植物NADPH氧化酶Rbohs是活性氧(ROS)的主要来源,参与植物的生长、发育、抗逆和植物-微生物的互作等多种生理过程。为探索Rbohs在共生固氮中的功能和作用机制,克隆了1个大豆Rbohs基因家族成员GmRbohL,利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法,分别对基因的表达模式、蛋白质的亚细胞定位及基因的功能进行了研究。结果显示:GmRbohL基因受根瘤菌诱导,在大豆根和根瘤中特异性高表达。亚细胞定位分析发现,该基因编码蛋白GmRbohL是一种膜蛋白。构建了GmRbohL的植物基因沉默(RNAi)载体,利用发根农杆菌K599介导的大豆毛根转化法,得到转基因毛状根。GmRbohL的基因沉默导致转基因毛状根的根瘤数量明显减少,ROS的产生也受到了抑制。根瘤器官发生阶段根瘤菌的侵染事件明显减少,结瘤标志基因的表达水平也随GmRbohL表达量的降低而降低。根瘤组织切片显示,GmRbohL的基因沉默显著减少了根瘤侵染区共生体的数量,根瘤的固氮酶活性也相应降低。以上数据表明,GmRbohL的基因沉默降低了ROS的产生水平,显著抑制了大豆的共生结瘤过程。推测GmRbohL可能在大豆根瘤的器官发生以及固氮功能调控方面发挥重要的正调控作用。

为了揭示水稻中肽链释放因子eRF1在蛋白质生物合成中的作用，对水稻eRF1基因的全长cDNA和启动子进行了克隆与表达模式分析。通过RT-PCR技术克隆获得1个水稻eRF1基因，命名为OseRF1-3，序列分析表明，该基因CDS序列全长1 308 bp，编码436个氨基酸，包含N、M、C共3个保守结构域。qRT-PCR结果表明，OseRF1-3是组成型表达，在水稻穗中表达最高。以水稻叶片基因组DNA为模板，通过PCR技术克隆了该基因起始密码子上游2 120 bp启动子序列，构建该基因启动子融合GUS植物表达载体，并通过农杆菌介导法导入水稻愈伤组织。GUS组织化学染色分析表明，OseRF1-3基因启动子驱动GUS基因在水稻各组织部位都表达即组成型表达，在根中表达较弱，在水稻花、硬壳中检测到GUS基因较强表达。GUS检测OseRF1-3基因启动子驱动GUS表达的结果与qRT-PCR得出的结果相一致。因此，该研究将为进一步探索OseRF1-3基因的功能奠定理论基础。

类受体激酶基因OsSIK1具有通过激活抗氧化系统，增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因，获得具有较高抗旱水平的玉米新种质，通过超声波辅助花粉介导法，将水稻类受体激酶基因OsSIK1导入玉米自交系郑58中，并对转化株进行卡那霉素筛选及T₁、T₂、T₃的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测，获得转化植株并在T₃获得转基因纯合株系。对T₃转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明，与对照相比，在水分胁迫处理下，转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%，叶绿素含量提高了11.3%~106.9%，SOD活性上升45.8%~93.4%，而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%，MDA含量下降了25.7%~50.4%，说明转OsSIK1基因玉米植株抗旱性得到提高，其中，5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异，且生长状况明显优于对照。综上所述，研究最终获得5个转OsSIK1基因玉米株系，并证明导入水稻OsSIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。

为探明滁菊类黄酮3'-羟化酶（F3'H）基因在类黄酮物质合成过程中的作用，基于本实验室已经获得滁菊f3'h编码基因的基础上，采用Genome Walking技术，克隆了1 348 bp的启动子，序列分析表明，该启动子片段除含有真核生物启动子核心元件TATA-Box等外，还含有参与脱落酸响应（ABRE）元件以及G-Box等参与光响应单元、植物激素响应单元件植物防御和逆境胁迫应答元件、以及环境因素等多个顺式调控元件。该基因启动子的克隆及其初步分析将为深入研究f3'h基因在滁菊类黄酮合成中的分子机制提供参考、为开发滁菊分子育种提供有效基因原件，以及为今后利用生物技术手段提高滁菊黄酮含量奠定基础。

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能，构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥，获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比，过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明，在低镁生长条件下，转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外，在低镁生长条件下，转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明，过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。

为了研究异源过表达Atvip1基因的高粱对盐碱胁迫的耐受性及相应生长情况，采用NaHCO₃∶Na₂CO₃为5∶1，75 mmol/L，pH值9.63的盐碱胁迫液在高粱三叶一心期处理，在胁迫0，4，12，24，72，120 h对根系的生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及MDA含量进行测定。结果表明：异源过表达Atvip1基因能缓解盐碱胁迫对高粱幼苗生长的伤害，可使幼苗根表面积和根体积增大，根尖数和分叉数增多，高粱主根褐化出现较晚且症状轻，侧根发生早且数量多，在72 h后仍能保证新叶正常伸展，对地上部生长影响较轻。过表达Atvip1基因可提高转基因高粱根系抗O₂^-·活力，降低MDA的含量，抗氧化酶活性增强；胁迫早期（4~12 h），SOD、CAT和GR作用明显；胁迫中期（24~72 h），所有酶均发挥作用；胁迫后期（120 h），CAT和GSH-PX起重要作用。盐碱胁迫差异转录组分析中，差异表达基因COG分析表明，防御机制在不同时间段中占比较大，获得抗氧化酶相关差异表达基因42个。异源过表达Atvip1基因可通过缓解盐碱胁迫对光合作用和生长发育的影响，降低活性氧破坏及膜损伤来提高转基因高粱对盐碱胁迫的抗性。

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制，以ABA处理的冀花4号花生叶片cDNA为模板，用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段，采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体pBar-F3上，冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101，利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明，CaMV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒pBar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证，表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达，获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明，转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见，AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程，是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。

为了挖掘和鉴定更多的水稻白化转绿突变体用于基因功能的研究。从粳稻品种秀水09的EMS突变体库中发现了一个阶段性温敏白化转绿突变体stgra254，该突变体在28℃恒温条件下，第6片完全展开叶出现白斑，至分蘖盛期融合成片，最终叶片枯萎死亡；在32℃条件下，第6片叶白斑数目及白化程度明显弱于28℃，且3 d后逐渐转绿；而24℃下的叶片表现正常。组织化学分析结果表明，白斑的形成和发展是一个程序性细胞死亡的过程，伴随着H₂O₂的积累。荧光仪分析显示，光系统Ⅱ的最大光能转化效率显著下降。遗传分析表明，该突变体叶色性状受1对隐性核基因控制。利用stgra254与珍汕97杂交得到F₂群体，借助集团分离分析法和SSR分子标记连锁分析，将其定位在4号染色体上的RM17206与RM17277标记之间，遗传距离分别为0.48，5.22 cM。

钙调蛋白是植物体内一种重要的Ca²⁺受体蛋白,在钙信号途径及抗逆反应中发挥着重要作用。为研究番茄CaM蛋白在低温胁迫下的作用机制,以番茄品种Heinz1706、LA3969、冀粉2号、冀粉3号和农博粉霸15为材料,克隆得到了番茄钙调蛋白基因SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5,并进行序列分析和启动子区顺式作用元件分析;利用qRT-PCR技术分析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品种中15,5 ℃低温胁迫下的表达模式,并结合RNA-seq数据分析组织特异性表达情况。结果显示,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列均为450 bp,三者相似度为93.63%;所编码的氨基酸序列完全相同,属酸性稳定亲水蛋白,具有典型的CaM蛋白保守结构域。启动子顺式作用元件分析表明,3个基因的启动子区除含有必需的核心元件外,还含有多种生物及非生物胁迫响应元件,并呈现互补模式分布。不同程度低温胁迫表达模式分析表明,15 ℃胁迫下,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5种番茄材料中的表达模式均呈现出先降低后升高的趋势,其中SlCaM5基因的表达量升高更为显著;5 ℃胁迫下,SlCaM3、SlCaM4基因的表达水平变化不明显,而SlCaM5基因在处理后期表达量显著升高;表明SlCaM5在低温下维持着CaM蛋白的翻译水平。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同组织中的特异性表达情况显示,SlCaM3和SlCaM4在分生组织中具有较高的表达,而SlCaM5基因在不同组织中表达水平差异不明显。

利用酵母双杂交技术，鉴定拟南芥抗病相关基因T1N6_22的互作蛋白，为进一步明确T1N6_22基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。利用Gateway技术，构建T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体AD-T1N6_22、AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480、BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480。将空载的AD载体分别与BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合共同转化酵母感受态细胞，检测各基因的自激活活性，发现T1N6_22、AT1G21400、AT2G19480基因无自激活活性，AT1G06050基因有自激活活性。将AD-T1N6_22载体分别与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合，BD-T1N6_22载体分别与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480载体组合，进行酵母双杂交试验。结果发现，AD-T1N6_22与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480，BD-T1N6_22与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480共转化的酵母细胞在二缺（-Leu/-Trp）、三缺（-Leu/-Trp/-His）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基上均可以生长，表明T1N6_22与AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480在酵母细胞中直接互作。

为了深入研究重瓣百合花形成的分子机制，以重瓣百合比罗尼卡为试验材料，从中分离得到1个AGL6基因，其开放阅读框为744 bp，共编码247个氨基酸，蛋白质分子量为28.3 ku。亲水性平均系数为-0.748，等电点为8.23。蛋白结构分析显示，百合AGL6蛋白具有典型的MADS-box结构域、K-box区及2个AGL6基序。系统进化树分析结果显示，百合AGL6编码的蛋白属于AP1/AGL9亚家族AGL6分枝的单子叶植物类群，与同为单子叶植物的风信子亲缘关系最近，相似度达到78%，说明克隆得到的基因即为AGL6的同源基因，将其命名为LiAGL6。亚细胞定位表明，LiAGL6在洋葱表皮细胞的细胞核中表达，具备转录因子的基本特征。实时荧光定量PCR结果分析表明，LiAGL6基因在花中表达量最高，在茎、叶中几乎不表达；在整朵花中，LiAGL6在第7轮花瓣中的相对表达量最高，其次依次是第6轮和第3轮，第2轮花瓣中几乎检测不到表达。研究表明，LiAGL6基因可能在百合重瓣花形成方面发挥了调控作用。

温度胁迫是影响菠菜品质和产量的主要非生物胁迫之一,研究菠菜对温度胁迫响应的分子机制对菠菜抗逆育种具有重要意义。为给菠菜抗冷胁迫、热胁迫机制研究提供理论基础,以菠菜耐冷胁迫自交系D3和耐热自交系M10为试验材料,对其在冷胁迫和热胁迫下的转录组和代谢组进行了分析,以期探讨菠菜抗逆的转录和代谢机制。转录组学分析表明,在冷胁迫和热胁迫下,耐冷自交系D3和耐热自交系M10的差异基因富集最多的途径基本相同。代谢组学分析表明,冷胁迫下在基因与基因组数据库(KEGG)富集通路中共同富集在嘧啶代谢、赖氨酸降解通路中;热胁迫下在KEGG富集通路中共同富集在色氨酸代谢,甲苯降解,各种其他次生代谢物的生物合成,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸的代谢通路中;转录组学和代谢组学联合分析结合基因注释,确定了SpADH(sov2g036390)、SpSHMT(sov1g001130)、SpALDH-1(sov4g007150)为菠菜耐冷胁迫的候选基因,SpALDH-1(sov4g007150)、SpALDH-2(sov1g043320)、SpNPC(sov1g040610)为菠菜耐热胁迫的候选基因,其中,SpALDH-1(sov4g007150)在冷胁迫和热胁迫下都显著表达,可能是菠菜抗逆的相关调控基因。

旨在快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。采用定向回交育种策略,运用分子标记辅助选择技术和花药培养技术,快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。以籼稻品种谷梅4号为稻瘟病抗性基因Pigm(t)的供体,以高产易感稻瘟病的品系武运粳29196为受体,在连续回交和自交过程中,利用与Pigm(t)紧密连锁的InDels标记S95477和S29742进行分子标记辅助选择。在BC₂F₁世代,进行花药培养,获得185个双单倍体群体(DH群体),从中筛选出82个含有Pigm(t)基因的改良株系。在经过对农艺性状、稻瘟病抗性的系统鉴定与稻米品质性状测定后,发现改良株系DH036和DH158的综合性状与武运粳29196已十分相近,且稻米品质有所提升,保持了武运粳29196丰产性的同时,稻瘟病抗性有了明显的提高。利用定向回交、花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术体系,可明显提高稻瘟病抗性改良的预见性和准确性,缩短育种年限、加快育种进程。新育成的武运粳29196抗性改良系,为稻瘟病抗性育种提供了重要的遗传资源。

NRL(NPH3/RPT2-Like)是植物所特有的一类光响应蛋白,在向光素信号途径中发挥重要作用。利用生物信息学手段结合qRT-PCR技术,在玉米基因组水平对该家族基因进行鉴定并对其编码蛋白的性质、结构、进化、生育期组织表达和逆境表达进行分析。结果鉴定了31个ZmNRL基因,不均匀地分布于玉米9条染色体上,编码的氨基酸序列长度在464~749个,预测具有叶绿体、细胞核和细胞质等亚细胞定位。依据蛋白保守性将ZmNRL家族划分为四大类,基因结构也具有一定的保守性,多数基因含有4个外显子。基因启动子存在大量脱落酸、茉莉酸、光响应和抗氧化等顺式元件分析,其中G-box和Sp1等两类光相关元件数量较多。ZmNRL家族基因在生育期组织部位表达具有一定的时空特异性,总体表达量不高,仅有ZmNRL2、ZmNRL4、ZmNRL24和ZmNRL29相对高表达。通过生育期组织表达数据共表达及其模块GO富集分析发现,6个ZmNRL基因可通过叶绿体等生物发生及组装生物过程,参与对叶片生长发育的调控。qRT-PCR结果表明,高温处理玉米幼苗ZmNRL12上调表达显著,干旱、盐和病原物接种处理ZmNRL5、ZmNRL7和ZmNRL19基因下调表达。综上,在玉米基因组鉴定出31个ZmNRL基因,该家族基因不仅具有明显的组织表达特异性,而且可参与玉米幼苗对生物和非生物逆境应答。