为挖掘枸杞棉蚜对杀虫剂吡虫啉产生抗药性的候选基因,以枸杞棉蚜对吡虫啉的室内抗药性品系和相对敏感性品系为材料,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术获得2个品系的转录组数据,通过NCBI数据库进行基因注释,在转录水平上对2个品系的差异基因GO功能及KEGG代谢途径等生物信息学进行分析,采用qRT-PCR技术检测其中8个候选差异基因(CYP6a2、CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CYP4c1、AChE2、CarE和ALP3)的相对表达情况,并分析了抗药性相关基因的进化关系。经测序及序列拼接,共获得70 101条Unigene(单基因簇),平均长度为654.37 bp,在NR、GO和KEGG数据库中分别注释到29 131,27 861,2 993条Unigene。通过对两品系的差异基因进行NR注释分析,共发现289个差异基因,其中,22个可能与抗药性相关,包括9个解毒酶系基因(CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CYP4c1和ALP3各1个,CYP6a2和CarE各2个),8个表皮蛋白基因(CP)及其前体(Cuticular protein precursor,CPP),1个靶标酶系基因(Alkaline phosphatase,AChE2),2个转录因子基因(WRKY1、LZTFL1,Leucine zipper transcription factor-like protein 1 gene),1个胰脂肪酶相关蛋白2基因(PLRP2)和1个多抗相关蛋白基因(Multidrug resistance-associated protein,MRP)。定量结果表明,差异基因CYP6a2、CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CarE和ALP3在抗药性品系的表达量均显著高于敏感性品系。对抗药性相关重要基因CYP、GST、ALP和CP构建系统进化树,通过分析基因的遗传关系,发现枸杞棉蚜与大豆蚜、豌豆蚜的亲缘关系相对较近。获得了枸杞棉蚜对吡虫啉的抗药性与敏感性品系转录组的整体表达模式,筛选到抗药性相关差异表达基因,发现2个品系中87.50%的候选差异基因在转录水平和mRNA水平的表达量变化一致。

通过克隆尖孢镰刀菌亚麻专化型FolSid1基因,确定该基因在镰刀菌中的生物学功能以及蛋白定位。通过与尖孢镰刀菌近缘菌同源比对,克隆得到FolSid1的基因序列,基于同源重组原理,使用Split Marker法构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒,通过PEG介导法转入野生型原生质体中,获得基因敲除突变体(ΔFolSid1),对突变菌株做表型鉴定和致病力分析,分析该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。构建含有FolSid1基因的绿色荧光表达载体pZESH1,对FolSid1-EGFP融合蛋白进行亚细胞定位。结果表明,FolSid1基因序列全长5 392 bp,含有3个内含子。与野生型和外插入突变体相比,尽管敲除突变体ΔFolSid1分生孢子形态和大小没有不同,但产量显著下降;形态学观察发现,敲除突变体的生长速度明显减慢;亚麻试验显示,缺失突变体的致病力明显降低;基因的亚细胞定位试验显示,FolSid1蛋白主要定位于菌丝细胞的细胞膜上。FolSid1基因能够调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的菌丝营养生长、分生孢子发生且对亚麻具有致病性。

为了解析绣球WRKY转录因子家族的成员特征及其在绣球叶斑病应答中的作用,利用生物信息学方法,对绣球无尽夏基因组中的WRKY家族成员进行全基因组鉴定,并系统分析了蛋白质理化特征、基因结构、系统进化、共线性和家族成员在多主棒孢菌侵染下的表达模式。结果表明:绣球全基因组中共鉴定到84个非冗余的HmWRKY成员,均属于亲水性蛋白,在绣球18条染色体上呈现不均匀分布,编码氨基酸112~1 046个;所有成员可分为3个亚组,即Group Ⅰ~Group Ⅲ,均含有WRKYGQK和C2H2组成的DNA结合域;HmWRKY成员的序列长度变化较大,从512 bp到40 338 bp,并且检测到8个存在共线性的基因对,Ka/Ks的比值均小于1,说明HmWRKY家族在进化中趋于纯化选择;同时,18个HmWRKY成员在绣球叶斑病菌侵染后表现出显著差异表达的特性,其中9个上调表达、9个下调表达。以上结果表明,HmWRKY基因在绣球响应叶斑病中可能具有重要作用。

为了实现对三七根腐病菌的快速准确诊断、及时阻断病菌传播、开展针对性防治,建立了一种现场快速检测三七根腐病菌尖孢镰刀菌的实时荧光LAMP技术。首先从GenBank中筛选出尖孢镰刀菌类跨膜蛋白(TP)基因,并针对其保守区域设计了一套LAMP特异性引物,通过对尖孢镰刀菌LAMP检测体系的反应温度、内引物、外引物、环引物、Mg²⁺、dNTPs浓度进行优化,并评价体系的特异性及灵敏性,最后应用建立的LAMP检测方法分析三七病株及土壤样品中尖孢镰刀菌的含量。结果表明,LAMP检测方法最佳反应条件为: 反应温度64 ℃,内引物、外引物以及环引物的最佳浓度分别为1.6,0.2,0.1 μmol/L,Mg²⁺浓度6 mmol/L,dNTPs浓度0.4 mmol/L。利用建立的LAMP检测体系能从7种三七根腐病菌中特异性检测出尖孢镰刀菌,且灵敏度高,检测的最低模板浓度为0.2 pg/μL。此外,将DNA简提法和钙黄绿素指示剂与LAMP检测体系结合,建立了一种三七根腐病菌尖孢镰刀菌的现场快速检测方法,可快速准确检测三七植株及种植土壤中的尖孢镰刀菌,为土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗流通过程中的带菌分子检测提供技术支持。

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的尼帕病毒核衣壳蛋白(N蛋白),通过PCR扩增NiV N蛋白开放阅读框基因,克隆pFastBac^TMHTB载体,转化DH10Bac感受态细胞,转染sf9昆虫细胞,蛋白免疫印迹鉴定,生物信息学分析研究N蛋白特性。结果表明,经PCR和双酶切鉴定,获得重组质粒pFastBac^TMHTB-NiV-N;经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定,获得具有免疫活性的重组蛋白Bacmid-NiV-N;经分子生物信息学软件分析预测,重组蛋白含有532个氨基酸,分子大小为58.34 ku,为不稳定、亲水性蛋白,无跨膜区,蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,有5个T细胞抗原表位和18个B细胞抗原表位。上述研究为深入进行NiV N蛋白的功能和建立相应抗原检测方法提供物质基础。

为调查云南大理州一处奶牛养殖小区BEFV的感染情况及其流行毒株G基因的遗传多样性。对该大理州奶牛养殖小区的10份疑似病例,参考GenBank中牛流行热病毒的G基因序列,设计并合成2对特异性扩增G基因,测序并完成序列分析。同时,采60份血清样本进行抗体检测。结果显示,对10份疑似BEF病牛全血样的检测结果,6份呈BEFV核酸阳性。去除重复序列,获得4株牛流行热病毒云南流行株G基因扩增、测序,序列全长均为1 872 bp,编码623 aa。4株毒株之间组内核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,遗传进化分析与亚洲毒株聚为一类,并独自为一个细小分支。与泰国2017年分离TH-NP0065毒株和中国的毒株关系最近。与我国疫苗株JB76H的氨基酸同源性比较,发现7个氨基酸突变位点,为K⁵³→N⁵³、K⁶²→R⁶²、P¹⁸³→S¹⁸³、G²⁶³→E²⁶³、K⁴⁶¹→E⁴⁶¹、K⁴⁵⁷→R⁴⁵⁷、I⁴⁷⁵→M⁴⁷⁵。除中和抗原位点G1外,G2、G3、G4均出现变异位点。抗体检测试剂盒检测结果,抗体浓度≥52.5 ng/L临界值的样品有19份,阳性率为31.67%。综上所述,该奶牛养殖小区存在BEFV的感染,且流行株G基因存在多位点变异。

对多毛番茄全基因组的Dicer-like(DCL)、Argonaute(AGO)和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)基因家族进行生物信息学和表达模式分析,为深入研究DCL、AGO和RDR基因家族在多毛番茄响应非生物胁迫和病毒感染过程中的功能提供参考。以拟南芥DCL、AGO和RDR基因为参考序列,利用本地Perl语言和Pfam、SMART等软件检索多毛番茄LA1777基因组并确定多毛番茄DCL、AGO和RDR基因家族成员。通过ExPASy、GSDS 2.0、MEGA、Tbtools、SWISS-MODEL等工具对多毛番茄DCL、AGO和RDR家族基因进行生物信息学分析。根据非生物胁迫、番茄褪绿病毒(ToCV)处理和实时荧光定量PCR技术分析该类基因的表达模式。从多毛番茄中鉴定得到7个ShDCL、15个ShAGO和6个ShRDR基因,分别分布在第5,7,6条染色体上,其编码的蛋白与其他植物DCL、AGO和RDR结构相似,均含有该家族特有的保守结构域。系统发育分析表明,这些基因被分为4个亚组,与普通番茄之间具有较高的结构和功能相似性。ShDCL2a、ShDCL2c、ShDCL3、ShDCL4、ShAGO1b、ShAGO3、ShAGO4b、ShAGO5、ShAGO7、ShAGO10a、ShAGO10b、ShRDR1、ShRDR2、ShRDR3a、ShRDR6a和ShRDR6b在多种非生物胁迫和ToCV感染后显著上调表达,推测这些基因在非生物胁迫和病毒侵染过程中发挥着重要作用。

成株期抗叶锈病基因Lr12在生产上具有良好抗性,为Lr12进行精细定位并开发可靠的分子标记,以感病材料Thatcher和含Lr12抗性基因的近等基因系RL6011为亲本杂交产生F₁,进一步自交产生F₂单株和F_2∶3 家系。在田间利用5种强毒力叶锈菌混合小种(PHTT、THKS、THTT、PHTS和PHKS)接种F₂单株和F_2∶3家系进行成株抗叶锈性鉴定和抗性遗传分析。随后利用16K液相芯片对F₂的10个抗病单株和10个感病单株进行基因分型,获得与Lr12紧密连锁的SNP位点,确定抗病基因所在的染色体物理区间,开发SSR分子标记并构建遗传连锁图谱。结果表明,对RL6011(Lr12)/Thatcher的3 494个F₂单株进行抗叶锈性鉴定,抗病单株与感病单株之间的分离比符合3∶1( {\mathrm{\chi }}_{3:1}^2 =0.14;P=0.71)。对685个F_2∶3家系进行抗叶锈性鉴定,抗病单株、抗病杂合单株与感病单株之间的分离比符合1∶2∶1( {\mathrm{\chi }}_{1:2:1}^2= 2.01;P=0.37),表明Lr12为显性基因且群体分离符合单基因遗传规律。通过遗传连锁图谱分析成株期抗叶锈病基因Lr12基因位于SSR分子标记YK12817和YK12928之间,遗传区间为0.38 cM,对应中国春参考基因组(IWGSC.Ref.V1.0)中4BL染色体579.44~581.53 Mb物理范围内共2.09 Mb的物理区间。上述结果为预测候选基因提供了确定的依据。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKK或MKK)在植物的生长发育与胁迫响应等过程中发挥着重要作用。为了鉴定谷子抗锈病相关的MAPKK基因,为谷子抗锈病机理研究和抗病分子育种提供候选基因,运用生物信息学方法在全基因组水平上鉴定与分析谷子MAPKK基因家族成员(SiMKKs);利用Real-time PCR技术,检测谷子SiMKKs基因在不同组织部位、谷锈菌胁迫与外源激素处理下的表达水平;利用Excel、MEGA、DnaSP分析70份重测序谷子品种中抗锈病相关SiMKKs基因的变异位点和单倍型,结合表型鉴定抗锈病优异单倍型。结果表明,共鉴定到10个谷子SiMKKs成员,分布于5条染色体上,外显子数1~11个不等,编码蛋白质含有331~523个氨基酸;谷子MAPKK基因家族成员分为4组,A和B组包含S/T-X₅-S/T基序,C和D组的SiMKKs不具有该基序,保守基序Motif 1~Motif 6 存在于所有SiMKKs蛋白中;每个SiMKK基因的启动子区均含有防御和胁迫响应、茉莉酸甲酯(MeJA)响应、水杨酸(SA)响应、激发子激活等1~3种生物胁迫相关顺式作用元件。除SiMKK10-1和SiMKK10-3未检测到表达信号外,其余8个SiMKKs基因在不同组织部位、谷锈菌侵染、SA和MeJA处理下均有不同程度的表达。SiMKK4、SiMKK5和SiMKK10-2在孕穗期的根中表达量较高,SiMKK6-1和SiMKK6-2在孕穗期茎中表达量较高;SiMKK4在接种后24 h的抗病反应中上调表达、感病反应中下调表达,其表达与抗病相关;SiMKK4在SA和MeJA激素处理后的16 h内上调表达,之后下调表达,且在SA处理过程中表现持续的表达变化,其余7个SiMKKs基因在SA和MeJA处理中的表达模式也基本一致。SiMKK4基因编码区共分为7个单倍型,Hap_1为优势单倍型,未发现抗病关键变异位点。综上所述,谷子SiMKK4的表达与抗锈病相关,其可能通过SA和MeJA信号途径参与谷子的早期抗病反应。

摘要:四倍体小麦是普通小麦的祖先种,也是重要的粮食作物。发掘四倍体小麦抗病种质并鉴定其携带的抗病基因,旨在为小麦新品种选育提供新抗源。TDI-1是栽培二粒小麦,在多年的田间种植过程中表现出对白粉病免疫的表型。为了确定TDI-1携带的抗病基因,为小麦白粉病抗性遗传提供理论依据,首先将其与表现为感白粉病表型的硬粒小麦TDU-1进行杂交并构建了遗传群体,然后对亲本及其杂交F₁、F₂、F_2:3群体进行了白粉菌小种E09接种试验和抗病性分析,最后利用混合分离群体分析法(BSA)对抗白粉病基因进行了定位。结果表明,TDI-1在苗期对E09表现为感病,在成株期对E09表现为抗病;TDI-1和TDU-1的F₁植株在成株期对E09表现为抗病;F₂群体中,表现为抗病的单株数和感病的单株数的比例符合3:1($χ_{3:1}^{2}$= 0.11,P=0.74);F_2:3家系中,纯合抗病、抗病性分离、纯合感病的家系数目之比符合1:2:1($χ_{1:2:1}^{2}$= 0.47,P=0.79),表明TDI-1成株期白粉病抗性由1个显性基因控制,暂将其命名为PmTDI-1。对TDI-1和TDU-1及其杂交后代F₂群体进行分子标记筛选,发现4个位于2A染色体短臂上的分子标记Xwmc407、NRM-2AS29、NRM-2AS45和NRM-2AS84与PmTDI-1紧密连锁,其中,NRM-2AS45和NRM-2AS84位于两侧,遗传距离分别为1.8,4.6 cM。由此,将成株期抗白粉病基因PmTDI-1初步定位于2A染色体短臂上。研究结果显示,从四倍体小麦TDI-1中鉴定到1个新的显性成株抗白粉病基因PmTDI-1。

克隆东方黏虫C型溶菌酶基因MseLYS,构建MseLYS基因的原核表达载体,检测该基因在东方黏虫不同龄期和组织的表达情况,旨在为探究MseLYS基因的功能和结构提供理论参考,也为进一步研究该基因的抗菌功能和生理机制奠定基础。以东方黏虫为研究对象,通过反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增技术(RACE),获得了溶菌酶基因MseLYS的全长核苷酸序列,之后将去掉信号肽的开放阅读框架(ORF)序列连接到表达载体pET-30a(+)上,并用IPTG进行了诱导表达,最后用荧光定量PCR明确了该基因的时空表达模式。序列分析表明,此基因全长729 bp,ORF全长426 bp,5'和3'非编码区分别为75,228 bp,共编码141个氨基酸残基,其蛋白质的等电点和分子质量分别为7.72,16.13 ku。系统进化树分析结果表明,MseLYS与其他物种的C型溶菌酶聚集在一起,且与其他昆虫的氨基酸序列具有高度一致性,表明MseLYS为C型溶菌酶。SDS-PAGE电泳结果表明,MseLYS在表达菌BL21(DE3)内表达的蛋白质分子质量与预期大小一致,约20 ku,说明MseLYS在大肠杆菌中能够高效表达。龄期表达谱分析表明,MseLYS基因在东方黏虫幼虫、雄虫和雌虫不同发育阶段表达量显著不同,在末龄幼虫、蛹中表达量较高,其他发育时期表达水平较低。组织表达分析结果表明,MseLYS基因在雄虫不同组织表达量存在着显著差异,其中脂肪体和胸内表达量较高;在雌虫不同组织表达量也存在显著差异,其中触角、翅和体壁中表达量较高。综上,成功克隆了东方黏虫C型溶菌酶MseLYS基因的全长序列,构建了该基因的原核表达载体并能够高效表达蛋白质,明确了该基因在不同组织和不同龄期的表达模式。

为研究TaHis基因对小麦赤霉病的抗性机制,首先克隆了TaHis基因全长编码序列,构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,通过酵母双杂交技术对赤霉病诱导的小麦穗部酵母双杂交文库进行筛选,获得互作蛋白后利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证蛋白质之间的互作,并利用RT-qPCR技术对抗感小麦材料中TaHis互作蛋白的赤霉病诱导表达模式进行分析。结果表明,成功构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,经过酵母双杂交文库筛选后,在四缺选择培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上获得了18个酵母单克隆。测序后Blast分析发现,共获得5个可能与TaHis互作的蛋白质,其中在6个酵母单克隆中均鉴定到富含丝氨酸/精氨酸的mRNA剪接因子SR45a类蛋白(TaSR)编码序列。以百农4299为材料,克隆了TaSR基因全长编码区,并构建了pGADT7-TaSR载体,酵母双杂交试验表明,pGADT7-TaSR和pGBKT7-TaHis共转化的酵母细胞在四缺培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA)上可以生长且显蓝色,表明TaSR和TaHis在酵母细胞中直接互作;构建了YC-TaHis、YN-TaSR载体,双分子荧光互补试验表明,共转化YC-TaHis和YN-TaSR的烟草细胞中产生强烈荧光信号,进一步验证了TaSR与TaHis的互作。RT-qPCR分析显示,TaSR 在抗性材料百农4299中受赤霉病诱导后上调表达,在感病材料百农607中受赤霉病诱导后下调表达,表明TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。综上,小麦TaSR与TaHis存在相互作用,且TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。

研究发现陆地棉ENODL6基因具有抗黄萎病功能。为进一步揭示其在棉花抗黄萎病过程中发挥的作用,通过Nimble Cloning技术将GhENODL6插入酵母表达载体pNC-GBKT7,构建了重组质粒pNC-GBKT7-ENODL6。重组质粒转入酵母菌Y2HGold后可在DDO培养基上正常生长,但不能生长于QDO/X/A培养基,表明GhENODL6蛋白对酵母宿主无毒害作用,没有自激活活性。将携带pNC-GBKT7-ENODL6诱饵载体的Y2HGold酵母菌与cDNA文库进行杂交筛选,结果获得一个能够显示蓝色的菌落。通过PCR扩增,在蓝色酵母菌中获得一段526 bp的非载体插入片段,与陆地棉基因组内基因WRKY47序列高度一致。通过同源扩增,从陆地棉中克隆到WRKY47开放读码框,全长1 587 bp,编码528个氨基酸残基。再次利用酵母双杂交技术确认了WRKY47与GhENODL6之间存在互作关系。综上,构建了重组载体pNC-GBKT7-ENODL6,并鉴定到与GhENODL6互作的蛋白WRKY47。

为了确定张家口及银川番茄产区是否发生番茄褐色皱纹果病毒病(ToBRFV),探究番茄ToBRFV的遗传信息和演化,为番茄褐色皱纹果病毒的诊断和防治及番茄抗病毒病基因工程提供重要的科学依据,采用张家口和银川两地区疑似病果进行分子检测,并利用相关分子生物学软件对该病毒基因进行序列分析及全基因组的系统进化分析。结果表明,张家口及银川果实病毒分离物与GenBank中大部分ToBRFV分离物的基因组结构相似性在99%以上,确定两地区番茄果实病毒为番茄褐色皱纹果病毒。ToBRFV分离物的地域性很强,中国不同地区的ToBRFV病毒,与来自欧洲和亚洲的多个国家地区都有关联,张家口分离物与中国分离物(MT018320.1)亲缘关系最近,银川分离物与秘鲁分离物聚类到一起,说明银川分离物可能来自南美洲。张家口分离物与中国分离物(MT018320.1)的4个ORF氨基酸相似性最高,而银川分离物与张家口分离物相似性较低。另外,研究结果首次发现,银川分离物CP蛋白的第444位碱基由A突变成G,从而导致CP蛋白的氨基酸第131位由V(缬氨酸)突变为A(丙氨酸),CP蛋白发生了有义突变。综上所述,张家口及银川番茄产区发生了番茄褐色皱纹果病毒病,且两地区的病毒来自不同的地方。

为了快速获得纯合稳定的抗根肿病大白菜DH系,为大白菜抗根肿病育种提供基础材料,以5个大白菜抗根肿病基因型为试材进行游离小孢子培养,并结合分子标记、形态观察和根肿菌人工接种对获得的小孢子再生植株进行了表型和抗性鉴定。结果表明,5个基因型均诱导出胚,出胚率变异在0.02~1.72个胚/蕾,3个基因型20aCR12、21aCR6、21aCR12获得再生植株,再生植株率分别为27.09%,1.45%,26.07%。抗性标记鉴定表明,与CRa、CRb^kato连锁的分子标记在获得的50个小孢子再生植株均扩增出了抗性条带。表型调查表明,50个小孢子株系生殖期基生叶片形状、颜色、抽薹早晚、育性等差异很大,自交获得的29个DH系营养期株型、叶片性状及结球性状表现出多样性。抗性接种表明,11份DH系对根肿菌4号和1号生理小种侵染病情指数均小于33.33,表现为抗病或耐病,其中2种菌侵染病情指数均小于5.0的高抗DH系有3份,分别为20aCR12-23、20aCR12-29和21aCR12-39。研究表明,单倍体培养结合分子标记辅助鉴定可快速获得纯合的抗根肿病DH系。

为了研究锌指蛋白C₂H₂在大豆胞囊线虫病(SCN)胁迫应答中起到的重要作用,为进一步研究抗大豆胞囊线虫奠定重要基础。利用东农L-10(抗SCN)、黑农37(感SCN)接种SCN3根系转录组数据,筛选出差异表达基因GmC₂H₂-2like。倒置荧光显微镜下观察该GmC₂H₂-2like定位情况,对该基因进行生物信息学分析,克隆并构建其超表达载体转化大豆毛状根,研究其对胞囊线虫病的抗性功能。结果表明,GmC₂H₂-2like编码410个氨基酸残基,分子质量为45.77 ku,等电点为8.73,含47个磷酸化位点,蛋白二级结构含α-螺旋(25.61%)、无规则卷曲(57.32%)、延伸链(13.66%)和β-转角(3.14%)4种结构;亚细胞定位结果发现,其编码蛋白位于细胞核;分析超表达转GmC₂H₂-2like大豆毛状根发现,其根部组织的单位面积胞囊线虫数量显著低于空载体对照,表明GmC₂H₂-2like具有抑制胞囊线虫的功能。

为研究芍药PlSPL1(SPL)基因的性质和功能,进一步阐明PlSPL1基因在不同物种中的共性与特征差异,探明PlSPL1在芍药茎秆挺直程度中的作用。以芍药红峰茎秆为材料,采用RACE技术获得了芍药PlSPL1基因全长序列,利用生物信息学软件分析预测PlSPL1的结构、理化性质和亲缘关系,随后利用qRT-PCR技术分析PlSPL1在芍药茎秆不同发育时期的表达量,并通过激光共聚焦扫描显微技术进行了蛋白质亚细胞定位分析。结果表明:PlSPL1基因开放阅读框为3 000 bp,编码999个氨基酸。蛋白分子式为C₄₈₆₉H₇₆₈₂N₁₄₀₆O₁₄₉₇S₄₃,分子量为111.25 ku,理论等电点为6.26,编码亲水性不稳定酸性蛋白,磷酸化修饰以丝氨酸为主,无信号肽,有跨膜结构,二级结构主要由无规则卷曲组成。系统进化树分析发现,PlSPL1蛋白与牡丹的亲缘关系最近,其次和葡萄有较近的亲缘关系;蛋白序列比对分析发现,PlSPL1蛋白具有SPL转录因子家族特有的SBP保守结构域。相对表达量分析发现,PlSPL1随着茎秆发育逐渐呈现下降趋势,表明PlSPL1负向调控芍药茎秆发育,推测其可能在茎秆挺直程度方面起重要作用;亚细胞定位显示,PlSPL1蛋白定位在细胞核中。上述结果表明,PlSPL1参与芍药茎秆发育过程。

为探究RPM1在高粱抗病过程中的作用,以高粱抗黑穗病品种SX44B为材料,采用同源克隆法获得一个高粱SbRPM1基因。生物信息学分析结果显示:该基因的cDNA全长2 802 bp,预测共编码933个氨基酸。该基因编码蛋白的理论分子质量为106.1 ku,等电点为7.11,为亲水性蛋白质;该蛋白无跨膜结构,亚细胞定位在细胞质中。保守结构域分析显示,SbRPM1蛋白含有RX-CC-like、NB-ARC和LRR结构域,属于NLRs受体蛋白家族中的CNL类蛋白。系统发育关系分析表明,SbRPM1蛋白与南荻RPM1蛋白亲缘关系最近。通过实时荧光定量PCR技术检测SbRPM1基因的表达模式,结果表明,该基因在叶和花序中表达量较高,其次是根,在茎中表达量最低。在接种丝黑穗病原菌后24~72 h抗病品种中SbRPM1基因的表达显著上调,表明该基因受病原菌诱导表达,在高粱抗病反应中扮演着重要角色。首次在高粱中克隆得到SbRPM1基因CDS序列,解析了该基因的结构、性质与表达的特征。

为了探究铁离子对向日葵大丽轮枝菌生物学特性及致病力的影响,在培养基中外源添加铁离子后,对大丽轮枝菌的生长速度、产孢量、微菌核数量、粗毒素分泌量、细胞壁降解酶活性以及致病力进行了测定。结果表明,外源添加不同浓度的铁离子后,菌丝的生长速度和产孢量均呈现出递增趋势,相比对照,添加80 μmol/L的铁离子后大丽轮枝菌的生长速度最快,菌落直径为68.81 mm,增长率为21.40%;产孢量为2.58×10⁷个/mL,增长率为21.13%;微菌核数量也随着外源添加铁离子浓度的增加而增多,在培养5 d后,相比对照,其涨幅为51.53%;粗毒素分泌量在添加80 μmol/L的铁离子后,增幅近1倍;细胞壁裂解酶活性随着外源铁离子浓度的增加而增强,并在80 μmol/L时达到最强。此外,随着培养基中铁离子浓度的增加,大丽轮枝菌的致病力也相应增强,表现在当外源添加的铁离子浓度由0 μmol/L增加至80 μmol/L时,病情指数由35.00提高至62.20,增长率为77.71%。综上所述,外源添加铁离子不仅能够加速大丽轮枝菌的生长,促进产孢和微菌核的形成,还能够增强大丽轮枝菌的致病力。

为了探索安农1687对于条锈病抗性的遗传机理,加快安农1687小麦品种的推广,为小麦新品种的遗传改良提供参考,减少小麦条锈病对于我国小麦生产安全的危害。以安农1687(安农1687是由安农1106和西农822杂交选育的,对生理小种CYR32具有抗性的半冬性小麦品种)及其姊妹系和亲本为材料,利用小麦55K SNP芯片对安农1687及其双亲和姊妹系进行全基因组扫描,同时利用生理小种CYR32对安农1687及其姊妹系进行接种和鉴定,并在成株期统计其抗条锈病等级,综合接种及田间表型对小麦品系抗条锈病进行评价。鉴定结果显示,安农1687和5个姊妹系(系24、系26、系28、系30、系140)为中抗条锈病,2个姊妹系(系89和系105)为中感条锈病。利用安农1687及其姊妹系间的基因组差异信息,发现差异SNP位点富集在2A染色体短臂的31~37 Mb区间上,说明2A染色体可能存在某个或某些基因导致了这样的结果。为了排除其他抗条锈病基因的干扰,对亲本及2A染色体上携带的已知抗条锈病基因进行验证,结果表明,安农1687的2A染色体短臂的31~37 Mb区间可能存在一个新抗条锈病基因。通过试验和生物信息学分析发现,该区段内的TraesCS2A01G070700基因在抗感品系的NBS结构域上存在差异,感病品系中NBS结构域有3个错义突变,推测TraesCS2A01G070700为安农1687抗条锈病候选基因。

为了探索植物响应黄萎病病原菌侵染的作用机制,以黄萎病高感野茄材料大理野茄(M239)为研究对象,通过人工接种黄萎病病原菌大丽轮枝菌的方法,首先测定M239在接种大丽轮枝菌后0,6,12,24,48 h的根部4个关键生理指标,即过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性和可溶性蛋白(SP)含量的变化。结果确定接种大丽轮枝菌后12,24 h为蛋白组分析取样的关键时间点;在此基础上,利用iTRAQ技术分析M239在接种大丽轮枝菌后根部蛋白的变化。结果发现,与清水接种(CK)相比,M239接种大丽轮枝菌后12 h有463个差异表达蛋白(DEPs),其中305个下调,158个上调;接种后24 h,有456个DEPs被病原菌诱导表达,包括296个下调,160个上调。这些蛋白主要富集在碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、次生代谢物的生物合成、丙酮酸代谢、新陈代谢等途径。通过与已报道的黄萎病抗性材料的研究结果进行对比分析发现,M239在响应大丽轮枝菌的侵染过程中,参与防御响应的蛋白数量和代谢通路较少,未能形成有效的防御网络,最终表现为感病。

旨为揭示不同品种以及不同器官中内生菌的多样性特征,初步明确内生菌群落结构与宿主品种、器官类型及病害抗感特性的相关性。选取抗赤霉病的冀谷22、红谷、陇谷11号和感赤霉病的小青谷、石榴子、嫩选16号共6个谷子品种,取其根、茎、叶片、叶鞘、成熟谷穗,提取DNA,针对16S rDNA V3—V4区域,进行PCR扩增,基于Miseq高通量测序平台,对样本进行微生物多样性分析。感病品种与抗病品种内生菌物种组成具有明显差异。供试样本在门水平上的优势种群为变形菌门和放线菌门,其次是拟杆菌门和厚壁菌门,粘菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门和梭杆菌门相对丰度较低。Alpha多样性分析表明,抗病品种的叶片、成熟谷穗群落丰富度较高,叶片、根、成熟谷穗多样性较高;而感病品种则是根和茎群落丰富度较高,茎和叶鞘多样性相对较高;PCoA分析则表明,器官类型比品种对内生菌群落结构影响更大。物种组成分析表明,谷子内生菌群的多样性受到不同品种及不同器官的影响,不同器官所含内生菌种类相差较大。感病品种小青谷、石榴子和嫩选16与抗病品种冀谷22、红谷和陇谷11的内生菌群多样性差异较大,抗病品种在叶鞘时期都具有NB1-j菌门,成熟谷穗都具有酸杆菌门。明确了不同品种、不同器官对谷子内生菌的多样性及群落结构的影响,器官类型比品种对内生菌群落结构的影响更大。

为明确多雨烟区适宜的烤烟种植密度,探讨种植密度对多雨烟区烟叶品质的影响及土壤微生物的响应特征。以云烟87为材料,研究不同种植密度(CK 16 650株/hm²;T1 18 525株/hm²)对烟叶产质量及土壤微生物群落结构的影响。结果表明:与CK处理相比,T1处理的烟株株高增加了6.02%,产量增加了8.65%。成熟期T1处理的烟草黑胫病、根黑腐病、炭疽病的发病率分别比CK处理降低了15.38%,11.76%,18.18%。T1处理根际土壤细菌群落物种多样性比CK处理增加了1.62%,丰富度降低了0.99%;真菌群落物种丰富度增加了3.76%,多样性降低了4.71%。T1处理与CK处理的细菌和真菌群落结构相似,但土壤样品中微生物优势类群不一致。T1处理的土壤变形菌门、酸杆菌门和放线菌门的细菌相对丰度以及子囊菌门的真菌相对丰度较高;T1处理土壤的鞘氨醇单胞杆菌属细菌相对丰度和青霉属真菌相对丰度显著提高。冗余分析(RDA)显示,环境因子(日照时长、降雨量、温度)显著影响了细菌和真菌群落结构,对土壤细菌群落变化的影响强度为降雨量>温度>日照时长;对土壤真菌群落变化的影响强度为日照时长>降雨量>温度。多雨烟区适当增加烤烟的种植密度可改善土壤微环境,减少病害发生,进而提高烤后烟叶品质及提高烟农收入。

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠,将其脾细胞与 SP2/0细胞进行免疫融合,以获得抗AKV的单克隆抗体;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原,山羊抗鼠 HRP-IgG为二抗,建立并优化AKV抗体检测的竞争 ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚型鉴定为:重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应,与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应;建立的检测AKV抗体ELISA检测方法,诊断抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,1∶1 000抗体稀释比,1∶50血清稀释比,1∶2 000二抗稀释比,封闭条件为 5% BSA,37 ℃封闭 2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性,小于44%为阴性;所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition 检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系,建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体,为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。

鉴定陆地棉 SKS 基因家族成员,解析其演化规律,为棉花抗性育种提供新的候选基因。基于已公布的陆地棉遗传标准系TM-1基因组数据,以陆地棉品种中棉-14为试验材料。通过生物信息学对陆地棉SKS家族成员进行全基因组鉴定,并对其家族成员的染色体分布、进化关系、基因结构、共线性关系等进行预测分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析GhSKS13的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默技术初步探究陆地棉SKS13在棉花抵御大丽轮枝菌过程中的功能。共鉴定到48个陆地棉SKS基因,不均匀分布于陆地棉19条染色体上,聚类分析分为5个亚组,基因序列具有较高保守性,共线性关系分析显示,陆地棉SKS基因家族受到纯化选择。组织模式表达分析显示,GhSKS13在陆地棉根组织中优势表达,并且受大丽轮枝菌诱导显著上调表达。 GhSKS13沉默植株对大丽轮枝菌抗性减弱,同时抑制病程相关基因GhPR1、GhPR2、GhPR3和GhPR5表达。大丽轮枝菌入侵GhSKS13沉默植株,其过氧化氢(H₂O₂)沉积明显低于对照,暗示GhSKS13促进活性氧(ROS)的形成。总之,明确了陆地棉SKS家族成员的系统进化关系、染色体分布特征和基因结构特征;并阐明了GhSKS13参与棉花对大丽轮枝菌抗性反应。

为了挖掘稻曲病菌中的真菌病毒资源,深入解析新型真菌病毒基因组结构与功能的关系,以分离自海南省的一株表型异常的稻曲病菌菌株Uv321为研究对象,在前期宏转录组数据的基础上,鉴定该菌株中存在的新型真菌病毒的种类,并围绕着该新型真菌病毒开展了一系列的研究。结果表明,在菌株Uv321中鉴定到一种新型真菌病毒,命名为Ustilaginoidea virens botourmiavirus 7(UvBV7)。UvBV7基因组为正单链RNA(+ssRNA),全长2 406 nt,GC含量为53.78%,包含一个编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的开放阅读框(ORF),该ORF编码643个氨基酸,分子量约为72.727 ku。病毒末端二级结构预测表明,UvBV7的5'和3'末端的碱基均互补配对,形成发夹结构。BlastP比对表明,UvBV7与隶属于葡萄孢欧尔密病毒科、Botoulivirus病毒属的病毒Erysiphe necator associated ourmia-like virus 72有着最高的相似度,但仅为44.52%。基于UvBV7及其他相似病毒的RdRP序列的多重比对结果表明,UvBV7与葡萄孢欧尔密病毒科成员的RdRP氨基酸序列存在8个保守结构域,并在第Ⅵ保守结构域中发现GDD基序,这是病毒RdRP蛋白典型的高度保守核心基序;基于病毒RdRP氨基酸序列构建的系统发育树的结果也表明,UvBV7与隶属于Botoulivirus属的成员聚集成一簇。因此,UvBV7是隶属于葡萄孢欧尔密病毒科、Botoulivirus属的一种新型真菌病毒。稻曲病菌不同菌株的对峙培养结果表明,UvBV7可在营养体亲和的菌丝间进行水平传播,但菌丝尖端-利巴韦林法、高温-利巴韦林法和原生质体再生-利巴韦林法处理均不能将菌株Uv321中的真菌病毒UvBV7脱除。综上所述,本研究不仅丰富了稻曲病菌中真菌病毒的多样性,也为稻曲病的生物防治提供了潜在的低毒力生防因子。

利用反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)技术从三龄黏虫体内获得新型抗菌肽Diapausin基因的全长序列,利用生物信息学软件对该序列进行分析,并用原核表达体系对其进行诱导表达,为探究该基因的结构和功能提供理论参考。结果表明,成功克隆到了黏虫新型抗菌肽Diapausin基因,命名为Mysdiap (GenBank登录号:AZJ51075)。该基因全长537 bp,其中5'端和3'端非编码区分别为63,279 bp,开放阅读框全长195 bp,编码64个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为7.13 ku,等电点为5.59。Mysdiap的N端前24个氨基酸残基为信号肽序列。多重联配结果表明,Mysdiap氨基酸序列中具有高度保守区域ECCRAHG。成功构建了pET-Mysdiap重组表达质粒,并在大肠杆菌中用IPTG诱导其表达,表达的重组蛋白分子质量在20 ku左右,以包涵体和可溶性蛋白形式存在。综上,从黏虫中克隆获得了新型抗菌肽基因Mysdiap的全长序列,并在大肠杆菌中成功诱导其表达。

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子蛋白是一类在动植物及微生物中结构和功能均具有保守性的转录调控因子,为明确bZIP类转录因子在植物病原真菌中的功能及作用机制,进一步确定其与病菌生长发育及致病性的关系,以玉米大斑病菌01-23为材料克隆得到了StbZIP9基因(GenBank No.XM_008032179.1),StbZIP9是bZIP转录因子家族成员之一,对该基因结构及蛋白质特征分析结果显示,该基因全长788 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸,其编码蛋白包含一个在真菌中高度保守的同源结构域BRLZ;对该基因在病菌生长发育及侵染宿主过程的RNA-seq数据进行分析,发现与菌丝时期相比StbZIP9在附着胞和芽管时期表达量升高2~4倍,在侵染玉米叶片24,72 h后基因表达从无到有且持续升高,表明StbZIP9与附着胞发育和芽管形成相关联并在病菌侵染宿主细胞过程中发挥重要作用;进一步利用生物信息学技术预测其结合保守基序及调控的靶基因,结合基序为NNTWACGTNN,包含bZIP 类转录因子识别核心序列ACGT,并根据该序列预测StbZIP9下游靶基因,结合RNA-seq数据进行表达模式分析得到4个下游靶基因(JGI数据库中蛋白ID分别为:132893、163024、162798、40466),功能注释表明,其参与细胞壁组分聚合和运输、侵染宿主、孢子休眠等多种生物过程。为进一步阐明其在参与调控病菌侵染寄主的分子机制提供依据。

为了研究GRAS转录因子在大豆胞囊线虫(SCN)胁迫应答中起到重要的作用,将抗病品种东农L-10和感病品种黑农37分别接种SCN 3号生理小种。品红染色确定接虫成功后,提取植株根部进行转录组测序分析。整理共得到20个与SCN相关的候选基因。对编码蛋白的二、三级结构、磷酸化位点、亲水性和疏水性、启动子信息、基因进化关系等进行生物信息学分析研究。取植株的不同组织部位,根、茎、叶提取mRNA并反转录cDNA,对重点的候选基因进行RT-PCR。结果显示:该家族基因与MYB和MYC转录因子存在密切的关系。基因编码蛋白主要以α-螺旋、无规则卷曲为主,二级结构和三级结构高度一致;蛋白为可溶性蛋白,磷酸化位点以丝氨酸为主,RT-PCR表明在植物的不同组织部位均存在一定的表达量,主要以根部为主,在相同的大豆胞囊线虫胁迫下,抗病品种中GRAS表达量显著高于感病品种。上述结果表明,GRAS转录因子为SCN相关的抗性基因,为抗病胁迫响应应答反应提供了重要的基因来源。

了解谷瘟病菌的变异和群体结构,为今后谷瘟病的防控及抗病品种培育提供理论基础。利用20对SRAP引物对采自9个地区的90株谷瘟病菌菌株进行了PCR扩增,利用NTSYSpc-2.11F软件进行数据分析,通过UPGMA方法进行聚类分析,使用Popgene 32软件计算各群体间的遗传多样性指数。结果表明,筛选出了8对引物用于谷瘟病菌的遗传多态性分析,这8对引物共扩增出条带1 728条,其中多态性条带1 492条,多态性比率为86.34%。对90株病原菌进行聚类分析,其相似性系数为0.77~0.85,遗传相似系数为0.802时,所有菌株被分为27个遗传宗谱(L1~L27),其中L1为绝对优势组群,共包含来自山东、河北、山西、河南和辽宁5个省份的29株谷瘟病菌,占总菌株的32.22%。经Popgene 32软件计算分析,9个地区谷瘟病菌的Nei's遗传多样性指数(H)为0.141 4~0.288 1,Shannon's信息指数(I)为0.196 0~0.441 6,河北夏谷区Nei's遗传多样性指数和Shannon's信息指数最高,遗传多样性最丰富,而海南群体遗传多样性最低。对不同地区谷瘟病菌群体比较,吉林群体与海南群体的遗传亲缘关系最远,而河北夏谷区群体与河北春谷区群体的亲缘关系最近。可见,不同地区谷瘟病菌的遗传多样性丰富,各菌株间存在遗传分化,但菌株间的遗传分化与地理来源无明显相关性。

为了进一步明确结球甘蓝抗黑腐病性状的遗传基础,选育优质抗病品种,以结球甘蓝高抗黑腐病1号生理小种材料4674为父本,高感材料4673为母本,杂交获得F₁,F₁自交获得152个单株的F₂群体。采用苗期喷雾法对F₂群体进行接病,12~14 d后,按照甘蓝苗期鉴定方法对F₂群体进行表型鉴定。从404个分子标记中筛选得到175个多态性好且条带清晰的标记。随后,使用这175个分子标记对F₂群体进行基因型检测和遗传连锁图谱的构建。最后,结合抗病性表型鉴定数据和遗传图谱对甘蓝抗黑腐病性状的QTL进行标记定位。结果表明:有154对分子标记连锁到9条染色体上,其中包括110对InDel标记和44对SSR标记,覆盖长度714.29 cM,标记间平均图距4.64 cM。共定位到7个QTL位点,其中有3个为主效位点,分别是qBR-7-2、qBR-7-3和qBR-4-3,位于7号染色体的CG842110~CG842482及M29~M39标记间和4号染色体上的CD838151~BOE417,LOD值分别为5.75,3.20,3.47,可解释的表型贡献率分别为16.0%,9.2%,10.0%。

为探究蚜虫体内携带的病毒种类,采集江苏地区豆蚜田间种群,鉴定种类后,提取豆蚜总RNA,以片段化的mRNA为模板构建测序文库,利用宏病毒组测序技术检测分析豆蚜体内的病毒种类,并对获得的2个新病毒进行检测鉴定。结果显示,测序数据经拼接、比对和分类注释,最终共得到病毒序列177条,与24种病毒序列一致或同源性较高,包括5种植物病毒(属于5个病毒科)和19种昆虫病毒(涉及9个科和6种暂未分类病毒);对植物病毒中测序丰度最高的种类进行基因检测,获得序列经Blast比对,与其同源性较高的病毒均来自细胞质弹状病毒属,并且它们具有相同的保守区,确定该病毒为一种新的细胞质弹状病毒,暂命名为Aphis craccivora associated rhabdovirus(AcARV);基于病毒L蛋白系统进化分析显示,AcARV与水稻条纹花叶病毒(RSMV)构成最小分支,说明这2种病毒在进化上最为近缘;鉴定的多数昆虫病毒种类在蚜虫中鲜有报道;通过RT-PCR和蛋白免疫印迹在豆蚜体内均检测出昆虫病毒(HiPV)衣壳蛋白VP1,证实了HiPV对豆蚜的感染,这是首次在蚜虫体内发现HiPV,HiPV豆蚜分离物VP1基因与日本、江苏灰飞虱分离物核苷酸同源性分别为95.5%,99.0%。研究结果表明,豆蚜体内携带多种植物病毒,并含有一种新的弹状病毒AcARV,同时,豆蚜体内昆虫病毒种类非常丰富,HiPV可感染蚜虫。

元江普通野生稻(YP)是一份被称为植物活化石的种质材料,同时其也拥有大量的抗性(R)基因。为了鉴定元江普通野生稻中含有目前已知白叶枯病抗性基因的情况。以元江普通野生稻(YP)、渗入系后代(L214和G252)及其渗入系的感病亲本栽培稻合系35(HX35)作为供试材料,通过接菌鉴定、功能标记检测、同源克隆和实时荧光定量(qRT-PCR)技术来评价这些材料对白叶枯病的抗性。接菌鉴定结果显示,YP、L214、G252对供试的白叶枯病菌C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C9和PXO99^A均表现出抗性且病斑长度均小于2 cm;而HX35对供试的9个菌株均表现出感病且病斑长度远超6 cm。白叶枯病抗性基因检测结果显示,YP中含有Xa10的同源基因,HX35、L214、G252中含有xa23的感病同源基因。序列比对结果显示,抗病基因Xa10与YP中的Xa10启动子的效应因子结合元件(EBE_AvrXa10)区域序列差异较大。同样地,隐性感病基因xa23与HX35、L214和G252中的xa23启动子的效应因子结合元件(EBE_AvrXa23)区域序列一致。qRT-PCR结果显示,在接了PXO99^A菌株24 h后,YP、HX35、L214和G252中的免疫反应被激活,而YP中的Xa10和HX35、L214、G252中的xa23在所有处理时间段内均未被诱导表达。由此推测,YP、L214和G252中可能含有新的抗白叶枯病基因。

为选育优质抗稻瘟病保持系软华B,以携带稻瘟病抗性基因Pi46和Pi2的优质籼稻H281作为供体亲本、以软华B为轮回亲本,利用分子标记辅助选择(MAS)技术结合系谱选育法,聚合2个外源基因以改良保持系软华B。对性状稳定的改良株系进行稻瘟病抗性鉴定、稻米品质分析等。通过回交及多代自交,并结合分子标记检测,获得以软华B为遗传背景且含有2个纯合目标基因的BC₁F₆群体2个、BC₂F₅群体2个、BC₃F₄群体2个。田间自然诱发鉴定结果表明,不同回交世代改良材料在自然病圃均抗稻瘟病;育性鉴定结果显示,回交世代对不育系的不育度为52.7%~100.0%;农艺性状考查及米质分析表明,改良株系基本保留了软华B的主要农艺性状和稻米品质特性。SNP基因芯片分析结果显示,BC₁F₆的背景回复率为74.42%~77.77%,BC₂F₅的背景回复率为86.42%~87.75%,BC₃F₄的背景回复率为92.27%~92.59%。利用连续回交、自交和分子标记辅助选择等技术可有效聚合多个抗性基因,获得抗稻瘟病的新保持系,快速实现保持系软华B的分子改良,为选育抗病、优质的杂交稻组合提供良好的亲本材料。

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一,旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先,根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物;然后,针对该引物组筛选了其最佳反应温度,检测了LAMP反应的特异性和灵敏度,并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明,本研究设计的引物组在61~68 ℃条件下均能实现对靶标基因的扩增,其中以66 ℃为最佳反应温度;在特异性检测中,引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢;在灵敏度检测中,对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下,25 min左右即可实现扩增;在对玉米根腐病样本检测中,在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。

为了揭示南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄PTI免疫的分子机理,以番茄品种新金丰1号 MiPDCD6超表达苗为试验材料,以番茄品种新金丰1号组培苗为对照,通过转录组测序技术分别对番茄MiPDCD6超表达苗和对照苗进行转录组测序。 以番茄栽培品种Heinz 1706基因组作为参考基因组进行对比,利用FPKM法计算基因表达量,设定参数(|log₂ FC|>1且P<0.05)筛选差异表达基因。利用Gene Ontology(GO)数据库进行差异表达基因GO功能富集分析,统计每个GO term中的差异表达基因数目,计算出基因富集的显著性,找出富集显著的功能条目。利用KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway富集分析,超几何分布检验方法计算每个Pathway中差异表达基因富集的显著性。以FDR和基因数量来衡量KEGG的富集程度。结合基因差异表达分析和功能富集分析,研究MiPDCD6蛋白对番茄PTI免疫相关通路基因的影响。结果发现:在超表达MiPDCD6番茄植株中,与野生型番茄相比,MiPDCD6过表达番茄植株中有2 366个差异表达基因(DEGs),其中1 354个上调基因,1 012个下调基因。 这些DEGs中,通过GO和KEGG注释,植物激素信号转导(sly04075)、植物-病原互作(sly04626)、植物MAPK信号通路(sly04016)和丙环素生物合成(sly00940)等KEGG通路中富集到大量的差异表达基因。SA生物合成途径包括ICS和PAL,MiPDCD6过表达番茄植株中SA合成通路PAL1和PAL-like基因以及SA信号转导途径TGA9、TGA10-like和PR1a2基因均显著下调,表明MiPDCD6基因可能抑制SA合成,从而抑制植物PTI免疫。

为了探究陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1在棉花黄萎病反应中的生物学功能,为棉花黄萎病抗性基因挖掘及抗病育种奠定基础,通过转录组筛选,克隆获得一个细胞色素P450基因GhP450-94C1,利用生物信息学的方法分析该基因的理化性质,通过荧光定量PCR技术分析GhP450-94C1在黄萎病侵染下的表达模式,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步探究其在棉花抗黄萎病反应中的生物学功能。结果表明,克隆获得一个陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1,其开放阅读框(ORF)为1 503 bp,编码一个含500个氨基酸的酸性、亲水、不稳定的跨膜蛋白,分子式为C₂₅₉₇H₄₀₂₅N₆₉₁O₇₂₅S₂₂,分子质量为57.23 ku,定位于内质网膜,含有一个P450结构域;有86.45%的概率存在信号肽;二级结构预测显示,该蛋白含有24个α-螺旋和8个β-折叠;该基因响应黄萎病菌侵染,抑制其表达后植株对黄萎病菌的敏感性增强。初步证明GhP450-94C1是棉花黄萎病抗性反应的一个正向调控因子。

为了研究东北春麦区不同轮作模式下土壤中小麦赤霉菌的含量和真菌群落组成特点,以小麦-小麦-马铃薯轮作(T)、小麦-小麦-水飞蓟轮作(MT)、小麦-小麦-油菜轮作(R)、小麦-小麦-甜菜轮作(S)和小麦-小麦-小麦连作(W)为对象,利用MiSeq 高通量测序平台ITS2扩增子测序技术,测定土壤真菌群落组成、多样性及小麦赤霉菌相对丰度。数据显示,土壤中真菌OTUs数目在小麦连作,小麦与马铃薯、水飞蓟、油菜和甜菜轮作中分别为:389,362,390,471,438个。油菜和甜菜与小麦轮作模式中,Chao1指数较小麦连作分别增加了11.08%和8.59%。结果表明,水飞蓟、油菜和甜菜与小麦轮作增加了土壤真菌的丰富度。水飞蓟和小麦轮作模式的Shannon指数和Simpson指数在5种种植模式中最高,表明该处理的土壤真菌群落多样性更好。5种不同种植模式中土壤真菌群落结构相似性聚类分析显示,4种轮作模式聚为一支。4种轮作模式与连作相比,担子菌门丰度增加,接合菌门丰度降低。与小麦连作相比,油菜、甜菜和水飞蓟与小麦轮作模式中,玉蜀黍赤霉的相对丰度分别下降了16.67%,50.00%,83.33%,并且有益菌群明显富集。然而,马铃薯与小麦轮作模式中玉蜀黍赤霉丰度显著增加。综上所述,在东北春麦区建议选择水飞蓟、甜菜和油菜与小麦轮作以减轻小麦赤霉病的危害。

鉴定抗病基因并培育抗病棉花品种是目前根治棉花黄萎病的最好方法。利用MEGA 5.2等相关软件,构建棉花抗病相关基因WRKY7与拟南芥和水稻中抗病相关WRKY基因编码蛋白系统进化树。通过亚细胞定位技术、病毒诱导基因沉默技术、qPCR及GUS报告系统分析等技术,阐明GhWRKY7基因对大丽轮枝菌的诱导响应及其机制。结果表明:GhWRKY7和AtWKRY7高度同源,同属于Ⅱ类;GhWRKY7定位于植物细胞核内,其在棉花叶和根器官中的相对表达量显著高于茎;GhWRKY7基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导,在浸染24 h后呈显著上调。沉默GhWRKY7基因棉花对大丽轮枝菌抗性下降;和对照植株(表达TRV空载体植株)相比,接菌后沉默植株中GhPR1、GhPR3、GhPR4、GhPR5、GhPDF1.2、GhPAL1和GhCYP71B36等抗病相关基因的表达水平也显著下调,暗示GhWRKY7通过调控抗病相关基因的表达来提高植株的抗病性。构建GUS报告载体在烟草细胞中瞬时表达分析,揭示GhWRKY7基因能特异地结合GhCYP71B36启动子顺式元件,转录激活下游GhCYP71B36表达,从而提高棉花的抗病性。综上所述,GhWRKY7作为一个正调控棉花抗黄萎病的转录因子,参与如植保素Camalexin合成等下游抗病相关基因的表达,从而提高植株的抗病性。因此,GhWRKY7可以作为棉花抗病育种的候选基因,为棉花生产提供安全保障。

由羽衣草单囊壳菌引起的草莓白粉病是保护地草莓发病面积较大、发病频率较高的草莓病害之一,从苗期到结果期都能发生危害。建立快速、简便、高效的草莓白粉病病原菌检测技术对于该病的有效诊断和防控尤为重要。以羽衣草单囊壳菌ITS基因保守序列为靶基因,设计了1组包括F3/B3、FIP/BIP和LF/LB的环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,通过实时荧光曲线和荧光显色双重判定方法,对体系中影响检测效率的主要因素dNTPs、MgSO₄、BstDNA聚合酶、甜菜碱及温度进行优化,并对优化后的方法进行特异性、灵敏性检测及田间样本检测效果评估。结果表明,建立了草莓白粉病菌LAMP检测体系后,其优化的dNTPs终浓度为1.6 mmol/L,MgSO₄终浓度为8 mmol/L,BstDNA聚合酶终浓度为320 U/moL,甜菜碱终浓度为1.2 mmol/L,反应最佳温度为65 ℃。该方法能够特异性地检测出草莓白粉病病原菌,检测灵敏度达到3.2×10^-4 ng/μL,最低检测浓度可在1 h内完成,效率是普通PCR的100倍。通过LAMP荧光显色法进行草莓白粉病田间样品检测,可有效地检测草莓白粉病发病症状不明显的初侵染样本。该方法具有检测时间短、肉眼直接观察结果、对操作人员要求低、检测成本低等优点,对于草莓白粉病早期诊断、监测,提早预防、确定最佳防治时间具有重要的指导意义。

为探究苹果各器官不同部位的RNA提取和病毒检测效果,以携带3种病毒的苹果植株为试验材料,采用吸附柱法提取苹果的花(雌蕊、花药、花丝、花瓣、花萼、花托和花柄)、叶片(叶柄、叶肉和叶脉)、果实(果柄、果皮、果肉、果核、种皮和胚乳)和枝条(韧皮部)4个器官共17个组织部位的总RNA,利用常规RT-PCR对不同部位进行病毒检测,并采用实时荧光定量PCR分析病毒在不同部位的相对含量。结果表明,苹果不同器官的RNA提取效果存在差异,叶片的浓度最高,其次是花和枝条,果实的浓度最低。花药、花丝、花柄在花中提取效果较好、胚乳和叶柄分别在果实和叶片中提取效果最好。除胚乳外,其余16个组织部位均能检测出3种苹果病毒。定量分析表明,苹果病毒在花中的相对含量最高,在雌蕊、种皮和叶柄中的相对含量分别高于花、果实和叶片的其他组织部位。此外,3种病毒在果实和叶片的不同组织部位的含量变化趋势相似,在花的不同组织部位的分布存在一定的差异。

明确不同品种谷子内生细菌群落组成特征,揭示与白发病抗性相关的关键物种,为利用内生细菌防治谷子白发病提供理论依据。对3种抗白发病和3种感白发病谷子植株的第一节茎与最高节茎组织进行DNA提取和样品中细菌16S rDNA高通量测序,并对内生细菌的群落组成进行分析。结果发现,在各分类水平下,从第一节茎到最高节茎内生细菌种类在抗病、感病谷子样品中分别表现为基本稳定与明显下降的2种不同趋势,且抗病谷子内生细菌群落的物种组成均较感病谷子丰富。得到重要内生细菌门19种:对普遍存在于抗病、感病谷子样品第一节茎中的内生细菌进行比较得到抗病谷子特有内生细菌门2种;对抗病、感病谷子样品各自全部内生细菌进行比较得到抗病谷子特有内生细菌门16种以及抗病谷子相对丰度较大的优势类群2种。可见,不同谷子品种以及不同部位内生细菌群落组成具有差异,抗病较感病谷子内生细菌种类丰富,其中抗病谷子特有的内生细菌门以及相对丰度大的优势细菌门对谷子白发病可能具有生物防治作用,值得进一步研究。

玉米茎腐病(CSR)对玉米产量和品质危害巨大。为尽快展开玉米茎腐病的有效防治,将吉林省玉米茎腐病的优势致病菌禾谷镰孢,与14株从玉米根际土壤中分离得到木霉菌株分别进行平板对峙试验。观察木霉对禾谷镰孢的抑制作用,筛选得到抑制效果较好的菌株CCTH-2和CCTH-6。复筛通过这2株木霉的发酵液、易挥发性代谢产物、难挥发性代谢产物对禾谷镰孢的抑制效果和对其他病原真菌的抑制效果,最终筛选到一株具有良好防效的木霉菌株CCTH-2;CCTH-2经过形态学和分子生物学鉴定显示,为哈茨木霉,并对其生物学特性进行初步研究。结果表明,平板对峙培养条件下CCTH-2对禾谷镰孢抑制率为82.83%,其发酵液、易挥发代谢物和难挥发代谢物对禾谷镰孢的抑制率为36.56%,46.75%,32.48%,具有显著抑制效果。生物学特性试验显示,CCTH-2菌落生长和产孢的最适培养基为PDA,最适温度为25 ℃,最适光照条件为全光照,外源添加Fe²⁺有利于CCTH-2的生长发育,并且CCTH-2具有一定的适应环境酸碱度和盐含量变化的能力。因此,可以确认哈茨木霉CCTH-2是一株有着良好防效且潜力巨大的生防菌。

为了研究芍药ACS基因的功能,应用RACE技术从芍药切花品种桃花飞雪中克隆了PlACS基因cDNA序列,利用生物信息学方法对其编码的蛋白质进行了综合分析;以pET32a为骨架,构建了PlACS基因的原核表达载体,建立了PlACS蛋白高效的原核表达体系。结果表明,PlACS cDNA全长1 752 bp(GenBank登录号JX512359),共编码492个氨基酸,具有7个保守结构域及活性位点K₂₇₈;分子进化分析表明,PlACS和牡丹ACS亲缘关系最近;二级结构预测发现,PlACS蛋白由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,四者比例分别为40.04%,16.26%,6.91%和36.79%;同源建模显示,PlACS蛋白以同源二聚体形式存在。PlACS蛋白最佳诱导表达条件为基因工程菌菌体密度A₆₀₀达0.2时,在菌液中加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在37 ℃诱导2 h。PlACS重组蛋白高效原核表达体系为后续通过变复性获得有生物学活性的PlACS蛋白及其酶学功能鉴定奠定基础。

大麦黄矮病毒引起的小麦黄矮病是我国小麦生产上重要的病毒病。BYDV GAV株系是我国小麦黄矮病的主要病原,目前有关BYDV GAV编码蛋白质P1、P2和CP的功能研究鲜有报道,因此,研究P1、P2和CP的功能,可为深入研究BYDV GAV的致病机制奠定基础。通过Mega 7.0构建系统进化树,对BYDV GAV株系编码蛋白质P1、P2和CP的核苷酸序列进行同源进化分析;通过构建P1、P2和CP的YFP表达载体,转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟,激光共聚焦显微镜观察确定3个蛋白质的亚细胞定位;构建BYDV GAV 5个编码蛋白质的双分子荧光互补载体,转化GV3101农杆菌后分别与P1、P2和CP共浸润本氏烟叶片,通过激光共聚焦显微镜观察确定这3个蛋白质与其他病毒蛋白质的体内互作情况;通过构建P1、P2和CP的马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体,转化GV3101农杆菌后接种本氏烟,接种后5 d观察症状形成,并采集系统叶进行病毒积累量检测,研究3个蛋白质对该病毒致病性的影响。结果表明,BYDVs的4种分离物中,PAV与GAV在核苷酸水平上的亲缘关系最近。BYDV GAV编码的P1、P2和CP蛋白亚细胞定位均为核质;在植物体内P1存在自身互作;PVXCP接种后5 d即可观察到系统叶褪绿并能够检测到病毒的积累,而PVX、PVXP1、PVXP2处理未能观察到症状且不能检测到病毒的积累;接种后10 dPVX、PVXP1和PVXP2处理能够检测到病毒的积累,表明CP促进了PVX症状的形成和致病进程。综上,P1可能通过自身互作参与病毒的侵染过程,CP可以促进病毒的侵染。

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

为探究猕猴桃AcWRKY70转录因子在不同抗病性品种中响应猕猴桃溃疡病胁迫的作用机制,以抗性病品种徐香和高感病品种红阳猕猴桃叶片cDNA为模板克隆AcWRKY70基因,并对红阳AcWRKY70基因序列特征进行分析,对编码蛋白进行系统进化分析及亚细胞定位预测。通过RT-qPCR分析AcWRKY70基因的组织特异性,不同抗性猕猴桃品种对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Psa)和水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)处理下表达模式的差异。结果显示,红阳AcWRKY70基因序列总长906 bp(GenBank登录号:MW881147),开放阅读框885 bp,编码294个氨基酸;含有典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为C2-HC,属于WRKY家族第Ⅲ类组,亚细胞定位预测表明,其定位于细胞核,系统进化树分析表明,其与茶树亲缘关系最近。红阳和徐香AcWRKY70基因均在叶片中表达量最高。在Psa处理下,12 h徐香品种AcWRKY70基因相对表达量迅速上升至对照的80.58倍;而在红阳中48 h该基因相对表达水平上升至最高。在SA与Psa(SA+Psa)和MeJA与Psa(MeJA+Psa)共同处理下,12 h徐香AcWRKY70基因相对表达量达到最高;而红阳AcWRKY70基因分别在72,24 h表达量达到最大。AcWRKY70基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,不同抗性的猕猴桃品种中响应病原菌的抗性机制可能存在较大差异。

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBac^TMHTB载体上的酶切位点BamH Ⅰ和Xba Ⅰ分别加入上下游引物,利用PCR技术对N基因进行扩增,先后连接T-Vector pMD19(simple)载体与pFastBac^TMHTB载体,并获得重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N和pFastBac^TMHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达,获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因,构建的重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确,在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N通过PCR鉴定得到预期2条带,大小分别为2 430,3 690 bp,证明成功得到重组杆粒,用该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,同时设立重组GFP蛋白对照组,转染120 h后分别收集重组N蛋白与重组GFP蛋白并制样;分别进行SDS-PAGE和WB分析,使用HRP-His标记抗体验证转染成功且重组N蛋白与重组GFP蛋白均在Sf9细胞内顺利表达,试验结果与预期相符,重组N蛋白条带大小约为46 ku。该试验成功构建了呼吸道冠状病毒N基因真核表达载体,并在昆虫细胞内成功表达,为建立ELISA检测方法等相关研究提供试验基础。

为了揭示不同品种以及不同器官中内生菌的多样性特征,初步明确内生菌群落结构与宿主品种及器官类型的相关性。以感谷瘟病品种沙湾谷子、冀谷22和抗谷瘟病品种小青谷、石榴子为材料,分别取植株的茎、叶片、叶鞘,通过基于16S rDNA V3—V4区的高通量测序进行微生物多样性分析。结果显示,感病品种与抗病品种内生菌物种组成具有一定差异性,所用供试样本中,门水平优势类群均为变形菌门、放线菌门,拟杆菌门、绿弯菌门、粘菌门、厚壁菌门次之。Alpha多样性分析表明,感病品种(沙湾谷子、冀谷22)叶片内生菌丰富度较高;PCoA分析则表明,器官类型比品种对内生菌群落结构影响更大。物种组成分析表明,感病品种沙湾谷子及冀谷22含有与小青谷、石榴子(抗谷瘟病)差异较大的内生菌群,感谷瘟病品种(沙湾谷子、冀谷22)叶片都具有Entotheonellaeota;抗谷瘟病品种则在叶鞘中均具Hydrogenedentes。明确了感、抗谷瘟病品种谷子及各个品种的不同器官内生菌的多样性及群落结构具有一定差异,器官类型比品种对内生菌群落结构的影响更大。

为探讨硅酸钠增强马铃薯黑痣病抗性的分子机制,将硅酸钠诱导马铃薯转录组中表达量较高的基因StWRKY11进行克隆和生物信息学分析。从马铃薯中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增该基因并克隆,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及分析。结果表明,从马铃薯大西洋中克隆了阅读框为1 005 bp的StWRKY11基因,编码334个氨基酸,表达蛋白分子式为C₃₀₁₃H₅₀₂₃N₁₀₀₅O₁₂₆₀S₁₉₉,分子质量为81.867 94 ku,理论等电点(pI)为5.09,原子总数为10 500。表达蛋白含有一个典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为CX₅CX₂₃HXH,属于第二类Ⅱd亚家族;表达的为疏水稳定性蛋白,无跨膜区和信号肽结构域,二级结构元件是α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规卷曲,其中无规则卷曲比例最高,达61.68%,共有29个磷酸化位点,可能定位于细胞核内。启动子上游具有与抗性胁迫响应相关的顺式调控元件及与生长发育和激素响应顺式作用调控元件。该基因与马铃薯StWRKY5基因的亲缘关系较近,编码蛋白的氨基酸同源性达到95%。