元江普通野生稻(YP)是一份被称为植物活化石的种质材料,同时其也拥有大量的抗性(R)基因。为了鉴定元江普通野生稻中含有目前已知白叶枯病抗性基因的情况。以元江普通野生稻(YP)、渗入系后代(L214和G252)及其渗入系的感病亲本栽培稻合系35(HX35)作为供试材料,通过接菌鉴定、功能标记检测、同源克隆和实时荧光定量(qRT-PCR)技术来评价这些材料对白叶枯病的抗性。接菌鉴定结果显示,YP、L214、G252对供试的白叶枯病菌C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C9和PXO99^A均表现出抗性且病斑长度均小于2 cm;而HX35对供试的9个菌株均表现出感病且病斑长度远超6 cm。白叶枯病抗性基因检测结果显示,YP中含有Xa10的同源基因,HX35、L214、G252中含有xa23的感病同源基因。序列比对结果显示,抗病基因Xa10与YP中的Xa10启动子的效应因子结合元件(EBE_AvrXa10)区域序列差异较大。同样地,隐性感病基因xa23与HX35、L214和G252中的xa23启动子的效应因子结合元件(EBE_AvrXa23)区域序列一致。qRT-PCR结果显示,在接了PXO99^A菌株24 h后,YP、HX35、L214和G252中的免疫反应被激活,而YP中的Xa10和HX35、L214、G252中的xa23在所有处理时间段内均未被诱导表达。由此推测,YP、L214和G252中可能含有新的抗白叶枯病基因。

为选育优质抗稻瘟病保持系软华B,以携带稻瘟病抗性基因Pi46和Pi2的优质籼稻H281作为供体亲本、以软华B为轮回亲本,利用分子标记辅助选择(MAS)技术结合系谱选育法,聚合2个外源基因以改良保持系软华B。对性状稳定的改良株系进行稻瘟病抗性鉴定、稻米品质分析等。通过回交及多代自交,并结合分子标记检测,获得以软华B为遗传背景且含有2个纯合目标基因的BC₁F₆群体2个、BC₂F₅群体2个、BC₃F₄群体2个。田间自然诱发鉴定结果表明,不同回交世代改良材料在自然病圃均抗稻瘟病;育性鉴定结果显示,回交世代对不育系的不育度为52.7%~100.0%;农艺性状考查及米质分析表明,改良株系基本保留了软华B的主要农艺性状和稻米品质特性。SNP基因芯片分析结果显示,BC₁F₆的背景回复率为74.42%~77.77%,BC₂F₅的背景回复率为86.42%~87.75%,BC₃F₄的背景回复率为92.27%~92.59%。利用连续回交、自交和分子标记辅助选择等技术可有效聚合多个抗性基因,获得抗稻瘟病的新保持系,快速实现保持系软华B的分子改良,为选育抗病、优质的杂交稻组合提供良好的亲本材料。

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一,旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先,根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物;然后,针对该引物组筛选了其最佳反应温度,检测了LAMP反应的特异性和灵敏度,并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明,本研究设计的引物组在61~68 ℃条件下均能实现对靶标基因的扩增,其中以66 ℃为最佳反应温度;在特异性检测中,引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢;在灵敏度检测中,对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下,25 min左右即可实现扩增;在对玉米根腐病样本检测中,在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。

为了揭示南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄PTI免疫的分子机理,以番茄品种新金丰1号 MiPDCD6超表达苗为试验材料,以番茄品种新金丰1号组培苗为对照,通过转录组测序技术分别对番茄MiPDCD6超表达苗和对照苗进行转录组测序。 以番茄栽培品种Heinz 1706基因组作为参考基因组进行对比,利用FPKM法计算基因表达量,设定参数(|log₂ FC|>1且P<0.05)筛选差异表达基因。利用Gene Ontology(GO)数据库进行差异表达基因GO功能富集分析,统计每个GO term中的差异表达基因数目,计算出基因富集的显著性,找出富集显著的功能条目。利用KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway富集分析,超几何分布检验方法计算每个Pathway中差异表达基因富集的显著性。以FDR和基因数量来衡量KEGG的富集程度。结合基因差异表达分析和功能富集分析,研究MiPDCD6蛋白对番茄PTI免疫相关通路基因的影响。结果发现:在超表达MiPDCD6番茄植株中,与野生型番茄相比,MiPDCD6过表达番茄植株中有2 366个差异表达基因(DEGs),其中1 354个上调基因,1 012个下调基因。 这些DEGs中,通过GO和KEGG注释,植物激素信号转导(sly04075)、植物-病原互作(sly04626)、植物MAPK信号通路(sly04016)和丙环素生物合成(sly00940)等KEGG通路中富集到大量的差异表达基因。SA生物合成途径包括ICS和PAL,MiPDCD6过表达番茄植株中SA合成通路PAL1和PAL-like基因以及SA信号转导途径TGA9、TGA10-like和PR1a2基因均显著下调,表明MiPDCD6基因可能抑制SA合成,从而抑制植物PTI免疫。

旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析;在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下,于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞,提取细胞总RNA,逆转录 PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因,确定ORFV113的动态转录水平;以ORFV-JS株基因组为模板,PCR扩增ORFV113基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV113重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞,通过Western Blotting 鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明,ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守,属于ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒,ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,大小为60~70 ku,比预测分子量大10~20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰;亚细胞定位研究表明,ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上,本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养,经电镜观察和IFA试验进行鉴定,通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增,SnapGene V4进行序列拼接和比对,利用DNAMAN V6对基因组末端5'UTR和3'UTR二级结构进行展示和比较,应用MEGA V7进行遗传进化分析,最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒,均鉴定为PPV1型毒株,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致,其中5'-UTR序列高度保守,呈Y型结构;而3'-UTR呈U型结构,个别碱基有所差异;VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示,突变株生长趋势相对较快,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。

为了探究陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1在棉花黄萎病反应中的生物学功能,为棉花黄萎病抗性基因挖掘及抗病育种奠定基础,通过转录组筛选,克隆获得一个细胞色素P450基因GhP450-94C1,利用生物信息学的方法分析该基因的理化性质,通过荧光定量PCR技术分析GhP450-94C1在黄萎病侵染下的表达模式,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步探究其在棉花抗黄萎病反应中的生物学功能。结果表明,克隆获得一个陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1,其开放阅读框(ORF)为1 503 bp,编码一个含500个氨基酸的酸性、亲水、不稳定的跨膜蛋白,分子式为C₂₅₉₇H₄₀₂₅N₆₉₁O₇₂₅S₂₂,分子质量为57.23 ku,定位于内质网膜,含有一个P450结构域;有86.45%的概率存在信号肽;二级结构预测显示,该蛋白含有24个α-螺旋和8个β-折叠;该基因响应黄萎病菌侵染,抑制其表达后植株对黄萎病菌的敏感性增强。初步证明GhP450-94C1是棉花黄萎病抗性反应的一个正向调控因子。

为了研究东北春麦区不同轮作模式下土壤中小麦赤霉菌的含量和真菌群落组成特点,以小麦-小麦-马铃薯轮作(T)、小麦-小麦-水飞蓟轮作(MT)、小麦-小麦-油菜轮作(R)、小麦-小麦-甜菜轮作(S)和小麦-小麦-小麦连作(W)为对象,利用MiSeq 高通量测序平台ITS2扩增子测序技术,测定土壤真菌群落组成、多样性及小麦赤霉菌相对丰度。数据显示,土壤中真菌OTUs数目在小麦连作,小麦与马铃薯、水飞蓟、油菜和甜菜轮作中分别为:389,362,390,471,438个。油菜和甜菜与小麦轮作模式中,Chao1指数较小麦连作分别增加了11.08%和8.59%。结果表明,水飞蓟、油菜和甜菜与小麦轮作增加了土壤真菌的丰富度。水飞蓟和小麦轮作模式的Shannon指数和Simpson指数在5种种植模式中最高,表明该处理的土壤真菌群落多样性更好。5种不同种植模式中土壤真菌群落结构相似性聚类分析显示,4种轮作模式聚为一支。4种轮作模式与连作相比,担子菌门丰度增加,接合菌门丰度降低。与小麦连作相比,油菜、甜菜和水飞蓟与小麦轮作模式中,玉蜀黍赤霉的相对丰度分别下降了16.67%,50.00%,83.33%,并且有益菌群明显富集。然而,马铃薯与小麦轮作模式中玉蜀黍赤霉丰度显著增加。综上所述,在东北春麦区建议选择水飞蓟、甜菜和油菜与小麦轮作以减轻小麦赤霉病的危害。

鉴定抗病基因并培育抗病棉花品种是目前根治棉花黄萎病的最好方法。利用MEGA 5.2等相关软件,构建棉花抗病相关基因WRKY7与拟南芥和水稻中抗病相关WRKY基因编码蛋白系统进化树。通过亚细胞定位技术、病毒诱导基因沉默技术、qPCR及GUS报告系统分析等技术,阐明GhWRKY7基因对大丽轮枝菌的诱导响应及其机制。结果表明:GhWRKY7和AtWKRY7高度同源,同属于Ⅱ类;GhWRKY7定位于植物细胞核内,其在棉花叶和根器官中的相对表达量显著高于茎;GhWRKY7基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导,在浸染24 h后呈显著上调。沉默GhWRKY7基因棉花对大丽轮枝菌抗性下降;和对照植株(表达TRV空载体植株)相比,接菌后沉默植株中GhPR1、GhPR3、GhPR4、GhPR5、GhPDF1.2、GhPAL1和GhCYP71B36等抗病相关基因的表达水平也显著下调,暗示GhWRKY7通过调控抗病相关基因的表达来提高植株的抗病性。构建GUS报告载体在烟草细胞中瞬时表达分析,揭示GhWRKY7基因能特异地结合GhCYP71B36启动子顺式元件,转录激活下游GhCYP71B36表达,从而提高棉花的抗病性。综上所述,GhWRKY7作为一个正调控棉花抗黄萎病的转录因子,参与如植保素Camalexin合成等下游抗病相关基因的表达,从而提高植株的抗病性。因此,GhWRKY7可以作为棉花抗病育种的候选基因,为棉花生产提供安全保障。

由羽衣草单囊壳菌引起的草莓白粉病是保护地草莓发病面积较大、发病频率较高的草莓病害之一,从苗期到结果期都能发生危害。建立快速、简便、高效的草莓白粉病病原菌检测技术对于该病的有效诊断和防控尤为重要。以羽衣草单囊壳菌ITS基因保守序列为靶基因,设计了1组包括F3/B3、FIP/BIP和LF/LB的环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,通过实时荧光曲线和荧光显色双重判定方法,对体系中影响检测效率的主要因素dNTPs、MgSO₄、BstDNA聚合酶、甜菜碱及温度进行优化,并对优化后的方法进行特异性、灵敏性检测及田间样本检测效果评估。结果表明,建立了草莓白粉病菌LAMP检测体系后,其优化的dNTPs终浓度为1.6 mmol/L,MgSO₄终浓度为8 mmol/L,BstDNA聚合酶终浓度为320 U/moL,甜菜碱终浓度为1.2 mmol/L,反应最佳温度为65 ℃。该方法能够特异性地检测出草莓白粉病病原菌,检测灵敏度达到3.2×10^-4 ng/μL,最低检测浓度可在1 h内完成,效率是普通PCR的100倍。通过LAMP荧光显色法进行草莓白粉病田间样品检测,可有效地检测草莓白粉病发病症状不明显的初侵染样本。该方法具有检测时间短、肉眼直接观察结果、对操作人员要求低、检测成本低等优点,对于草莓白粉病早期诊断、监测,提早预防、确定最佳防治时间具有重要的指导意义。

为探究苹果各器官不同部位的RNA提取和病毒检测效果,以携带3种病毒的苹果植株为试验材料,采用吸附柱法提取苹果的花(雌蕊、花药、花丝、花瓣、花萼、花托和花柄)、叶片(叶柄、叶肉和叶脉)、果实(果柄、果皮、果肉、果核、种皮和胚乳)和枝条(韧皮部)4个器官共17个组织部位的总RNA,利用常规RT-PCR对不同部位进行病毒检测,并采用实时荧光定量PCR分析病毒在不同部位的相对含量。结果表明,苹果不同器官的RNA提取效果存在差异,叶片的浓度最高,其次是花和枝条,果实的浓度最低。花药、花丝、花柄在花中提取效果较好、胚乳和叶柄分别在果实和叶片中提取效果最好。除胚乳外,其余16个组织部位均能检测出3种苹果病毒。定量分析表明,苹果病毒在花中的相对含量最高,在雌蕊、种皮和叶柄中的相对含量分别高于花、果实和叶片的其他组织部位。此外,3种病毒在果实和叶片的不同组织部位的含量变化趋势相似,在花的不同组织部位的分布存在一定的差异。

明确不同品种谷子内生细菌群落组成特征,揭示与白发病抗性相关的关键物种,为利用内生细菌防治谷子白发病提供理论依据。对3种抗白发病和3种感白发病谷子植株的第一节茎与最高节茎组织进行DNA提取和样品中细菌16S rDNA高通量测序,并对内生细菌的群落组成进行分析。结果发现,在各分类水平下,从第一节茎到最高节茎内生细菌种类在抗病、感病谷子样品中分别表现为基本稳定与明显下降的2种不同趋势,且抗病谷子内生细菌群落的物种组成均较感病谷子丰富。得到重要内生细菌门19种:对普遍存在于抗病、感病谷子样品第一节茎中的内生细菌进行比较得到抗病谷子特有内生细菌门2种;对抗病、感病谷子样品各自全部内生细菌进行比较得到抗病谷子特有内生细菌门16种以及抗病谷子相对丰度较大的优势类群2种。可见,不同谷子品种以及不同部位内生细菌群落组成具有差异,抗病较感病谷子内生细菌种类丰富,其中抗病谷子特有的内生细菌门以及相对丰度大的优势细菌门对谷子白发病可能具有生物防治作用,值得进一步研究。

玉米茎腐病(CSR)对玉米产量和品质危害巨大。为尽快展开玉米茎腐病的有效防治,将吉林省玉米茎腐病的优势致病菌禾谷镰孢,与14株从玉米根际土壤中分离得到木霉菌株分别进行平板对峙试验。观察木霉对禾谷镰孢的抑制作用,筛选得到抑制效果较好的菌株CCTH-2和CCTH-6。复筛通过这2株木霉的发酵液、易挥发性代谢产物、难挥发性代谢产物对禾谷镰孢的抑制效果和对其他病原真菌的抑制效果,最终筛选到一株具有良好防效的木霉菌株CCTH-2;CCTH-2经过形态学和分子生物学鉴定显示,为哈茨木霉,并对其生物学特性进行初步研究。结果表明,平板对峙培养条件下CCTH-2对禾谷镰孢抑制率为82.83%,其发酵液、易挥发代谢物和难挥发代谢物对禾谷镰孢的抑制率为36.56%,46.75%,32.48%,具有显著抑制效果。生物学特性试验显示,CCTH-2菌落生长和产孢的最适培养基为PDA,最适温度为25 ℃,最适光照条件为全光照,外源添加Fe²⁺有利于CCTH-2的生长发育,并且CCTH-2具有一定的适应环境酸碱度和盐含量变化的能力。因此,可以确认哈茨木霉CCTH-2是一株有着良好防效且潜力巨大的生防菌。

为了研究芍药ACS基因的功能,应用RACE技术从芍药切花品种桃花飞雪中克隆了PlACS基因cDNA序列,利用生物信息学方法对其编码的蛋白质进行了综合分析;以pET32a为骨架,构建了PlACS基因的原核表达载体,建立了PlACS蛋白高效的原核表达体系。结果表明,PlACS cDNA全长1 752 bp(GenBank登录号JX512359),共编码492个氨基酸,具有7个保守结构域及活性位点K₂₇₈;分子进化分析表明,PlACS和牡丹ACS亲缘关系最近;二级结构预测发现,PlACS蛋白由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,四者比例分别为40.04%,16.26%,6.91%和36.79%;同源建模显示,PlACS蛋白以同源二聚体形式存在。PlACS蛋白最佳诱导表达条件为基因工程菌菌体密度A₆₀₀达0.2时,在菌液中加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在37 ℃诱导2 h。PlACS重组蛋白高效原核表达体系为后续通过变复性获得有生物学活性的PlACS蛋白及其酶学功能鉴定奠定基础。

大麦黄矮病毒引起的小麦黄矮病是我国小麦生产上重要的病毒病。BYDV GAV株系是我国小麦黄矮病的主要病原,目前有关BYDV GAV编码蛋白质P1、P2和CP的功能研究鲜有报道,因此,研究P1、P2和CP的功能,可为深入研究BYDV GAV的致病机制奠定基础。通过Mega 7.0构建系统进化树,对BYDV GAV株系编码蛋白质P1、P2和CP的核苷酸序列进行同源进化分析;通过构建P1、P2和CP的YFP表达载体,转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟,激光共聚焦显微镜观察确定3个蛋白质的亚细胞定位;构建BYDV GAV 5个编码蛋白质的双分子荧光互补载体,转化GV3101农杆菌后分别与P1、P2和CP共浸润本氏烟叶片,通过激光共聚焦显微镜观察确定这3个蛋白质与其他病毒蛋白质的体内互作情况;通过构建P1、P2和CP的马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体,转化GV3101农杆菌后接种本氏烟,接种后5 d观察症状形成,并采集系统叶进行病毒积累量检测,研究3个蛋白质对该病毒致病性的影响。结果表明,BYDVs的4种分离物中,PAV与GAV在核苷酸水平上的亲缘关系最近。BYDV GAV编码的P1、P2和CP蛋白亚细胞定位均为核质;在植物体内P1存在自身互作;PVXCP接种后5 d即可观察到系统叶褪绿并能够检测到病毒的积累,而PVX、PVXP1、PVXP2处理未能观察到症状且不能检测到病毒的积累;接种后10 dPVX、PVXP1和PVXP2处理能够检测到病毒的积累,表明CP促进了PVX症状的形成和致病进程。综上,P1可能通过自身互作参与病毒的侵染过程,CP可以促进病毒的侵染。

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

为探究猕猴桃AcWRKY70转录因子在不同抗病性品种中响应猕猴桃溃疡病胁迫的作用机制,以抗性病品种徐香和高感病品种红阳猕猴桃叶片cDNA为模板克隆AcWRKY70基因,并对红阳AcWRKY70基因序列特征进行分析,对编码蛋白进行系统进化分析及亚细胞定位预测。通过RT-qPCR分析AcWRKY70基因的组织特异性,不同抗性猕猴桃品种对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Psa)和水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)处理下表达模式的差异。结果显示,红阳AcWRKY70基因序列总长906 bp(GenBank登录号:MW881147),开放阅读框885 bp,编码294个氨基酸;含有典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为C2-HC,属于WRKY家族第Ⅲ类组,亚细胞定位预测表明,其定位于细胞核,系统进化树分析表明,其与茶树亲缘关系最近。红阳和徐香AcWRKY70基因均在叶片中表达量最高。在Psa处理下,12 h徐香品种AcWRKY70基因相对表达量迅速上升至对照的80.58倍;而在红阳中48 h该基因相对表达水平上升至最高。在SA与Psa(SA+Psa)和MeJA与Psa(MeJA+Psa)共同处理下,12 h徐香AcWRKY70基因相对表达量达到最高;而红阳AcWRKY70基因分别在72,24 h表达量达到最大。AcWRKY70基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,不同抗性的猕猴桃品种中响应病原菌的抗性机制可能存在较大差异。

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBac^TMHTB载体上的酶切位点BamH Ⅰ和Xba Ⅰ分别加入上下游引物,利用PCR技术对N基因进行扩增,先后连接T-Vector pMD19(simple)载体与pFastBac^TMHTB载体,并获得重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N和pFastBac^TMHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达,获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因,构建的重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确,在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N通过PCR鉴定得到预期2条带,大小分别为2 430,3 690 bp,证明成功得到重组杆粒,用该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,同时设立重组GFP蛋白对照组,转染120 h后分别收集重组N蛋白与重组GFP蛋白并制样;分别进行SDS-PAGE和WB分析,使用HRP-His标记抗体验证转染成功且重组N蛋白与重组GFP蛋白均在Sf9细胞内顺利表达,试验结果与预期相符,重组N蛋白条带大小约为46 ku。该试验成功构建了呼吸道冠状病毒N基因真核表达载体,并在昆虫细胞内成功表达,为建立ELISA检测方法等相关研究提供试验基础。

为了揭示不同品种以及不同器官中内生菌的多样性特征,初步明确内生菌群落结构与宿主品种及器官类型的相关性。以感谷瘟病品种沙湾谷子、冀谷22和抗谷瘟病品种小青谷、石榴子为材料,分别取植株的茎、叶片、叶鞘,通过基于16S rDNA V3—V4区的高通量测序进行微生物多样性分析。结果显示,感病品种与抗病品种内生菌物种组成具有一定差异性,所用供试样本中,门水平优势类群均为变形菌门、放线菌门,拟杆菌门、绿弯菌门、粘菌门、厚壁菌门次之。Alpha多样性分析表明,感病品种(沙湾谷子、冀谷22)叶片内生菌丰富度较高;PCoA分析则表明,器官类型比品种对内生菌群落结构影响更大。物种组成分析表明,感病品种沙湾谷子及冀谷22含有与小青谷、石榴子(抗谷瘟病)差异较大的内生菌群,感谷瘟病品种(沙湾谷子、冀谷22)叶片都具有Entotheonellaeota;抗谷瘟病品种则在叶鞘中均具Hydrogenedentes。明确了感、抗谷瘟病品种谷子及各个品种的不同器官内生菌的多样性及群落结构具有一定差异,器官类型比品种对内生菌群落结构的影响更大。

为探讨硅酸钠增强马铃薯黑痣病抗性的分子机制,将硅酸钠诱导马铃薯转录组中表达量较高的基因StWRKY11进行克隆和生物信息学分析。从马铃薯中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增该基因并克隆,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及分析。结果表明,从马铃薯大西洋中克隆了阅读框为1 005 bp的StWRKY11基因,编码334个氨基酸,表达蛋白分子式为C₃₀₁₃H₅₀₂₃N₁₀₀₅O₁₂₆₀S₁₉₉,分子质量为81.867 94 ku,理论等电点(pI)为5.09,原子总数为10 500。表达蛋白含有一个典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为CX₅CX₂₃HXH,属于第二类Ⅱd亚家族;表达的为疏水稳定性蛋白,无跨膜区和信号肽结构域,二级结构元件是α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规卷曲,其中无规则卷曲比例最高,达61.68%,共有29个磷酸化位点,可能定位于细胞核内。启动子上游具有与抗性胁迫响应相关的顺式调控元件及与生长发育和激素响应顺式作用调控元件。该基因与马铃薯StWRKY5基因的亲缘关系较近,编码蛋白的氨基酸同源性达到95%。

为了探讨玉米对灰斑病胁迫的生理生化响应,采用田间自然接种法,以2个自交系K365(抗)和K169(感)以及2个杂交种正红431(抗)和正红532(感)为试验材料,研究灰斑病对不同抗性玉米自交系及杂交种叶片光合作用、活性氧含量、抗氧化酶活性以及内源激素含量的影响。灰斑病胁迫导致玉米叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO₂浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)均下降,其中除Ci以外,抗病材料的3项光合指标下降程度未达显著水平,具体为K365的Pn、Gs和Tr分别下降24.41%,25.00%,4.20%,正红431的Pn、Gs和Tr分别下降11.53%,21.43%,0.06%,而感病材料的3项光合指标下降程度达显著水平,具体为K169的Pn、Gs和Tr分别下降59.32%,95.28%,80.18%,正红532的Pn、Gs和Tr分别下降85.39%,69.60%,56.77%;同时灰斑病胁迫可使玉米叶片的过氧化氢(H₂O₂)含量、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、水杨酸(SA)含量、茉莉酸(JA)含量均上升,其中抗病材料能激发更高的POD、SOD和CAT活性,维持相对稳定的H₂O₂含量,更合理的调节SA和JA含量,能够保持内源激素的平衡。抗病材料可能通过合理积累SA、JA等信号分子来调控抗氧化系统,使其在感病后期体内仍维持较高水平的防御酶活性来更有效清除多余的H₂O₂,同时调节叶片的内源激素平衡使其适应灰斑病带来的影响,从而增强玉米的抗病性。

为了探索施氮肥对大豆孢囊线虫病的控制效果,进行了不同施肥水平的盆栽试验和田间试验,以分析氮肥对大豆孢囊线虫卵孵化和繁殖的影响,及其对大豆生长和产量的影响。盆栽试验设置了0.016,0.032,0.048,0.064 g/kg土壤4个施氮水平,分析土壤淋溶液和根系浸出液对卵孵化及线虫繁殖的影响;田间试验设置了22.50,56.25,67.50,78.75 kg/hm² 4个施氮水平,分析不同氮肥水平对孢囊减退率的影响,盆栽试验和田间试验均以不施用氮肥作为空白对照。室内盆栽试验结果表明,施氮肥后的土壤淋溶液和根系浸出液都可以显著提高卵孵化抑制率,0.032,0.064 g/kg土的土壤淋溶液中大豆孢囊线虫卵孵化抑制率较高,分别为34.21%,29.31%;0.064 g/kg土的根系浸出液中大豆孢囊线虫卵孵化抑制率最高,达55.09%,与对照相比有显著差异。田间试验表明,适量施用氮肥可以显著提高孢囊减退率,增加大豆产量。使用56.25 kg/hm²氮肥处理对线虫的防治效果最好且增产率最高,孢囊减退率达25.29%,增产率可达14.75%;而对照区孢囊数量增加了30.77%。因此,适当增施氮肥对大豆孢囊线虫病具有较好的抑制作用,可提高大豆产量和品质,该方法是一种防治大豆孢囊线虫经济安全的方法。

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒-甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列,利用Premier 5.0 软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物;以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板,在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增,初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系;通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化,建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系,并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示,优化的多重RT-PCR体系,各病毒引物之间不会出现交叉干扰,所扩增的4条目的条带清晰,能够明确区分上述4种甘薯病毒;挑战检测和灵敏度测试显示,此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒,不仅准确灵敏,而且降低了检测成本,提高了病毒检测效率。

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。

为明确木醋液改良再植病土壤的作用机理,以苹果砧木-八棱海棠为试材,通过田间试验研究木醋液处理对植株生长的影响以及7月和10月土壤主要理化性质和酶活性,基于Illumina高通量测序分析植株根际土壤微生物多样性的变化。结果表明:与对照相比,100倍木醋液灌根后,八棱海棠幼苗株高、地径和叶面积年增长量均有显著提高。木醋液灌根处理显著提高了再植病土壤主要养分含量和酶活性,其中7月土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷和速效钾的含量分别为CK1的1.31,1.38,1.20,1.60,1.65倍,10月分别为CK2的1.12,1.03,1.58,1.40,1.25倍,且均有显著差异;7月和10月蔗糖酶和脲酶活性均显著增加。木醋液提高了夏秋两季根际土壤微生物多样性。7月和10月对照和木醋液处理,根际细菌前5优势门均为变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门和棒状杆菌门;在属水平上主要为uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae、uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales、RB41和MND1。根际真菌前5优势门均为子囊菌门、担子菌门、被孢霉门、壶菌门和球囊菌门;在属水平上主要为枝孢属、被孢霉属、土赤壳属、久浩酵母属和镰刀菌属。由相关性网络图可知,根际有益细菌RB41和uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae及致病真菌镰刀菌属和土赤壳属与其他种群呈负相关。木醋液灌根可提高苹果再植土壤养分和酶活,增加土壤微生物多样性,改善土壤微生物群落结构,有利于促进植株生长,增强植株抗性,减轻再植病的危害。

为研究辣椒CaWRKY30转录因子与番茄斑萎病毒互作的响应机制,以辣椒湘研11为试验材料,通过RNA提取、RT-PCR、切胶纯化及克隆等试验获得CaWRKY30编码序列。生物信息学分析结果表明,CaWRKY30全长1 122 bp,编码373个氨基酸,该基因编码的蛋白含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂结构域,属于典型的Ⅱ(e)亚家族成员。系统发育分析表明,与马铃薯StWRKY22氨基酸序列的亲缘关系最近。本氏烟叶片亚细胞定位试验发现,CaWRKY30在本氏烟幼苗中定位于细胞核和细胞膜,并且导致细胞膜加厚。实时荧光定量PCR分析结果表明,观察番茄斑萎病毒机械摩擦接种辣椒后的病毒积累量,发现病毒积累量在接种1~14 d逐渐上升,在接种后14 d处于最大值,接种14 d后病毒积累量逐渐下降;同时,CaWRKY30受番茄斑萎病毒接种后诱导,在接种病毒1~14 d CaWRKY30表达量上调,14 d达到峰值,14 d以后表达量逐渐下降。综上,获得了CaWKRY30转录因子基因序列,该转录因子定位于细胞核和细胞膜,并初步阐述了辣椒CaWRKY30转录因子在番茄斑萎病毒胁迫下的表达趋势。

为明确豇豆轻斑驳病毒江苏分离物的基因组结构特征,阐明其分类地位及进化特点,选择采自江苏的CpMMV大豆分离物作为研究对象,针对病毒基因组序列设计了4对特异性引物,以病样总RNA反转录后获得的cDNA为模板,通过分段法对其基因组序列片段进行了PCR扩增,扩增产物克隆至T载体经验证后进行序列测定,获得的序列片段经拼接组装得到病毒全基因组序列。序列分析结果显示,CpMMV江苏分离物基因组核苷酸序列全长8 194 bp,编码6个蛋白,5'端和3'端各含有一个非编码区(UTR),长度分别为72,117 nt;在编码的6个蛋白中,CP与其他分离物之间的同源性较高(96.5%~100.0%),相对保守;而RdRp(81.1%~98.2%)、TGB1(81.0%~97.0%)、TGB3(80.9%~95.6%)同源性相对较低,在不同分离物中表现较好的多样性;基于全基因组序列的系统进化分析结果显示,江苏分离物与已公开的其他CpMMV分离物同源性较高,共同聚类到一个大分支上,其中与中国安徽分离物同源性最高(98.2%),与海南分离物次之(96.0%),而与美国、巴西、印度、墨西哥、肯尼亚等国外分离物同源性相对较低(<82.7%)。这些研究结果表明,CpMMV江苏分离物与其他CpMMV分离物具有类似的基因组结构特征,在系统进化上,江苏分离物与国内分离物近缘而与国外分离物远缘。

为了在生理和分子水平上初步揭示向日葵对黄萎病的抗性机制,以抗(SC89)、感(LD5009)黄萎病的向日葵品种为材料,测定接种大丽轮枝菌毒素后H₂O₂含量、ROS清除酶(SOD、CAT、POD和PAL)的活性以及抗病信号通路关键基因转录水平的变化。结果表明,接种6 h后H₂O₂在抗病品种SC89中迅速升高,分别在接种大丽轮枝菌毒素12,36 h达到最高值0.55,0.60 μmol/g,随后开始下降,而感病品种中虽然在接种12 h后有一个小的峰值0.17 μmol/g,但是积累水平远远低于抗病品种;ROS清除酶SOD、CAT、POD和PAL活性表现为,抗病品种SC89接种大丽轮枝菌毒素后都在短时间内迅速达到峰值,随后逐渐降低,而感病品种LD5009的峰值低于抗病品种,而且呈现出峰值滞后的现象。同时,接种后抗病信号路径相关基因如Pr5(JA)、Pal(SA)以及ROS清除酶基因如Sod、Sco和Cat转录水平表现为,接种后抗病品种SC89被显著上调。这些结果表明,SA、JA以及H₂O₂等信号分子在向日葵抗黄萎病过程中均发挥着重要的作用。

为了更好地利用分离自棉花根部的内生拮抗细菌S258进行生物防治，特别是利用其产生的挥发性有机物进行植物病害的防治，以棉花黄萎菌和西瓜枯萎菌作为靶标病原真菌，以拟南芥作为指示植物，通过二分格培养皿对峙培养法测定其产生的挥发性有机物对病原真菌的抑菌活性，以及对植物的促生长活性。结果表明，内生细菌S258产生的挥发性有机物对病原真菌的生长具有抑制作用，并且能够促进植物的生长。与阴性对照大肠杆菌DH5α相比，对棉花黄萎菌和西瓜枯萎菌菌丝生长的抑制率分别达到80.9%，10.1%。与不加细菌的空白对照相比，对拟南芥的生长具有很强的促进作用，使拟南芥单株鲜质量达到空白对照的5.3倍。用顶空固相微萃取法收集内生细菌S258产生的挥发性有机物，再用气质联用的方法，分析其挥发性有机物的组成，经NIST和WILIY质谱数据库自动检索，鉴定得到其挥发性有机物包含30种单体化合物，分别属于烷烃、烯烃、醇、酮、醚、醛、酯及杂环类。根据总离子流图的峰面积判断，主要气体成分为二甲基二硫醚和吲哚。综上所述，内生细菌S258能够产生具有抑菌促生长活性的挥发性有机物，是开发为生防产品的重要微生物资源，其挥发性有机物也具有较高的研究和应用价值。

为了培育优良的抗虫玉米自交系，通过农杆菌介导的方法，将含有自主改造合成的抗虫基因Cry1Ab-t的植物表达载体pCAMBIA3300m导入玉米杂交种HiⅡ基因组中，通过双丙氨磷筛选、PCR检测获得阳性转基因植株，采用RT-PCR、试纸条、ELISA方法检测外源基因的表达情况，并进行抗虫性鉴定。结果表明，用双丙氨磷筛选后，获得了116株转基因玉米植株；经目的基因Cry1Ab-t和标记基因Bar的PCR检测，获得转基因阳性植株82株。选取长势好的转基因材料YA108进行RT-PCR、Bt-Cry1Ab/Ac试纸条和ELISA分析发现，转基因玉米YA108的Cry1Ab-t基因在转录、翻译水平上均表达。玉米花丝接虫试验表明，非转基因玉米花丝虫食严重，表现为高感玉米螟；而转基因玉米YA108花丝抗虫效果明显，均达到高抗水平，抗虫性表现稳定；吐丝期接虫试验表明，非转基因玉米接虫后期被咬食严重，茎秆多处有蛀孔，伤口处大多有霉菌，而转基因玉米YA108没有受到危害。田间接虫后，无论叶片和花丝，转Cry1Ab-t基因抗虫玉米材料YA108对亚洲玉米螟都具有非常好的抗性，能够短时间杀灭玉米螟幼虫，并极大程度减少了由于虫害引起的霉变。室内和田间接虫鉴定结果表明，转基因玉米YA108对亚洲玉米螟有较强的杀虫效果，田间抗虫等级为1级，抗性水平为高抗。

为了挖掘防控苹果轮纹病的植物源药剂，检测了韭菜、大蒜、洋葱和大葱等4种常见的葱属植物的提取物对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用，在此基础上通过代谢组学分析了4种葱属植物代谢物差异，并检测了其中主要活性成分的对苹果轮纹病菌丝生长及苹果果实轮纹病害发生抑菌作用。结果显示：在整个试验过程中，4种粗提取原液（1×）对苹果轮纹病菌丝生长的抑制率高达100%；在4种葱属植物中检测到78种代谢物。其中3种主要成分焦谷氨酸、磷酸和柠檬酸对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制率在29.10%~100.00%，对苹果果实轮纹病发生的抑制率高达44.38%~91.45%。研究表明，4种葱属植物及其主要成分均能高效抑制苹果轮纹病菌的生长，从而显著抑制苹果轮纹病的发生。研究结果为进一步认识和开发葱属植物中抗菌成分奠定了理论基础，并为苹果轮纹病的防治提供了一种可能方法。

玉米茎腐（青枯）病不仅在我国广泛发生，也是世界性的玉米病害，严重影响全球玉米的总产量以及种子品质。简要概述了该病的发生与危害，致病菌及发病成因和相应栽培措施；通过对已有的玉米抗病鉴定方法及病原菌鉴定方法总结分析，认为抗病育种与抗性鉴定之间存在一定的关联不够问题；着重介绍了玉米种质资源的筛选，玉米对茎腐（青枯）病抗性遗传规律和分子生物学领域的研究进展；并且对玉米茎腐（青枯）病的研究方向提出了一些参考建议。

为了探究细菌群体感应（QS）信号分子N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）在植物上诱导对于真菌病害的抵抗能力。以番茄为试验材料，以灰霉为病原指示菌，通过不同侧链长度和侧链修饰的AHLs信号分子预处理后接种病原菌，发现长链信号分子N-3-羰基十四烷酰基高丝氨酸内酯（3OC14-HSL）对灰霉有最佳的抗性效果。实时荧光定量PCR检测抗病基因发现，与未处理对照组相比，信号分子3OC14-HSL预处理能显著诱导接种灰霉病后的番茄体内与茉莉酸（JA）信号通路相应基因PI1、PI2上调；而与水杨酸信号（SA）通路相关的NPR1基因显著下调，PR1基因则没有显著变化。进一步通过DAB染色、过氧化氢含量测定以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性检测发现，3OC14-HSL预处理相比未处理对照组使得番茄产生大量活性氧，且可以保持较高的POD、SOD活性。这些结果表明，长链信号分子N-3-羰基十四烷酰基高丝氨酸内酯可以诱导番茄对灰霉的抗性，而且该抗性效果可能与茉莉酸信号路径相关。

为研究不同砧木对烟草嫁接苗抗病性的影响，明确抗病材料云烟87（Y87）作为砧木提高接穗红大金元（HD）对青枯病抗性的机理，采用劈接加生料带缠绕法以易感青枯病品种HD作为接穗，以HD和Y87作为砧木，分别构建HD/HD和HD/Y87嫁接烤烟苗，然后测量HD/HD和HD/Y87保护性酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的变化，最后利用高通量测序技术和Illumina HiSeqTM 4000测序平台，提取5株HD/HD或HD/Y87 mRNA，反转录构建总cDNA文库，测序，过滤低质量Reads后，用TopHat2比对参考基因组，用Cufflinks和DESeq软件获得基因表达量和差异表达基因。结果发现，不同取样时间HD/Y87 PAL活性均显著高于HD/HD，4个样品分别得到48 414 474~48 697 874条Clean Reads和38 272~40 938条基因，但HD/Y87发生选择性剪切事件数高于HD/HD；比较HD/Y87和HD/HD两组间基因表达量，得到3 904条差异基因，其中3 096条基因上调，808条基因下调；在上调基因中有参与木质素合成的3条编码苯丙氨酸解氨酶基因，5条Myb家族转录因子基因，5条编码多酚氧化酶基因；还有2条病程相关蛋白基因和3条相应的ERF转录因子基因等。这些结果表明，Y87作为砧木能够提高接穗HD PAL活性和多种抗性基因（包含木质素、多酚及病程相关蛋白）表达量，从而提高接穗红大金元对青枯病等病害抗性。

为明确马铃薯StPR1基因在抗病中的作用，构建了植物表达载体pBI121-StPR1，并通过农杆菌转化法将StPR1基因导入烟草中，采用不同的致病菌对转基因烟草进行处理，对其抗病性及生理特性进行研究，包括细菌病害软腐病（胡萝卜软腐欧文氏菌、菊欧氏菌和胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种）和青枯病（茄科雷尔氏菌）、真菌病害干腐病（接骨木镰孢、燕麦镰孢）致病菌。结果表明，接种致病菌后，转基因型烟草和野生型烟草叶片上的病斑直径会随着病菌胁迫时间的延长而增大，并且转基因型烟草病斑直径明显小于野生型烟草；在生理特性分析中，野生型烟草和转基因烟草叶片中生理指标都会随着病菌胁迫时间的延长而呈上升趋势，但转基因烟草SOD、POD和CAT活性较野生型烟草均有不同程度的提高。抗病性及生理特性分析结果均表明，转基因烟草对于致病细菌和真菌均具有更强的抗性，说明StPR1基因在马铃薯植物抗病中起着重要的作用，为PR1基因在植物的抗病方面提供了理论基础。

小麦赤霉病是一种危害性很强的小麦真菌病害，而Fhb1是抗赤霉病的主效基因。为了筛选黄淮冬麦区携带Fhb1基因的种质材料，利用TaHRC-Kasp和His-InDel标记对来自河北、河南、山东、陕西、江苏和安徽的共336份小麦材料进行检测，共筛选出2份来自河北省的材料（石家庄75和紫茎白）携带Fhb1基因。通过序列分析，其His基因序列与苏麦3号一致，为抗赤霉病类型。利用9 779个SNP位点对供试的336份材料进行PCA主成分分析，结果显示，石家庄75和紫茎白与江苏的材料亲缘关系较近。石家庄75是建国初期的育成品种，紫茎白是河北省的地方农家种，其携带Fhb1基因，说明最初Fhb1基因可能在国内一些地方品种中有所分布，但在现代育种进程中受到人工选择而消失。研究结果为黄淮冬麦区抗赤霉病小麦育种提供了宝贵的遗传信息及亲本材料。

为了快速检测谷子种子携带线虫情况并了解不同地区线虫种群的多态性，利用PCR技术对采集自中国谷子主产区不同区域内的99份谷子种子的带线虫情况进行了检测，并分析其不同地区线虫种群的遗传多样性。结果表明，根据贝西滑刃线虫核糖体28S rRNA-D2/D3片段设计的引物对谷子线虫具有高度的特异性和灵敏性，扩增出245 bp的特异性目的片段，对谷子线虫的检测浓度最低为0.125 ng/μL。在99份谷子种子DNA中，有33份种子检测到特异性扩增条带，测序结果表明，所有扩增条带对应序列与线虫28S rRNA序列的相似性达97%以上，进一步说明33份种子携带线虫。重复试验结果表明，阳性种子的带线虫频率介于33.3%~100%，且带线虫的谷子种子主要来自春谷区。分析33份阳性样品的28S rRNA片段序列，存在29个变异位点和22种单倍型，其中单倍型AB1为优势单倍型，河北张家口市和内蒙古松山区两地线虫的单倍型遗传多样性最丰富。本研究建立了一种特异性好、灵敏度高的检测谷子种子带线虫的一步PCR方法；谷子线虫病是夏谷区的主要病害，随着谷子春夏谷区的交流，线虫病成为春谷区病害，种子带病可能是主要初侵染源；不同地理来源的线虫28S rRNA序列存在差异，AB1为优势单倍型。

为探讨腐烂病胁迫下核桃枝条生化代谢和树体抗病性之间相互作用关系，随机选取健康、轻度、中度和重度4种病害程度植株各7株，然后运用线性回归分析各枝条POD、Pro、PAL活性及核桃长势（核桃基茎）与病害程度（病斑面积）关系。结果表明：3种抗氧化酶活性的变化规律具有一定差异，其中PAL活性最高值分别出现在轻度病害植株叶片和中度病害枝条，而POD活性的极大值则出现在健康植株叶片和中度病害枝条，叶片中Pro活性与POD显示相似规律，均显著高于其他病害样品活性（P<0.05）。另外枝条Pro活性具有双峰特征即侵染初期其活性快速升高，病害程度进一步加剧其活性反而显著降低，随着病害发展其活性又明显增加；PAL活性和Pro活性极小值出现在病害侵染前期，POD活性极小值则出现在病害发展末期。相关分析显示，病害程度受POD活性和核桃长势（核桃基茎）极显著负影响，相关性分别达到-0.76（P<0.01），-0.85（P<0.01）；病害程度受Pro极显著影响，相关性为0.52（P<0.01）。由此可见，腐烂病侵染过程中，增强核桃长势即增加核桃基茎对腐烂病侵染过程有极强抑制作用，另外也表明，核桃植株体内POD活性增加，有利于增强核桃抵抗腐烂病的抗性。

为了研究不同的施氮模式和种植密度对西南夏玉米产量形成及茎腐病和穗粒腐病的影响。在大田试验条件下，设置2个施氮模式（CNP：传统施氮模式；RDNP：氮肥减量间隔穴深施模式）和3个密度（D1：习惯稀植5.25万株/hm²；D2：密植6.75万株/hm²；D3：密植8.25万株/hm²），分析不同施氮模式和密度对玉米产量及构成、干物质积累、光合生理特性的影响，以及探明影响玉米机收质量的茎腐病和穗粒腐病发病规律。结果表明，施氮模式对玉米产量影响不显著，但是RDNP下的氮肥偏生产力比CNP提高了33.7%；RDNP通过缓解花后净光合速率（Pn）、叶片SPAD值及叶面积指数的衰减幅度，弥补花前形成穗粒数不足，从而使其干物质总量和产量稳定不变；RDNP下的玉米茎腐病发病率和病情指数分别较CNP下降了4.8百分点和26.8%，而对穗粒腐病的发病率影响不显著。密植D2和D3较稀植D1均可显著增产，但D3持续增产幅度下降明显，同时D3下的玉米茎腐病和穗粒腐病发病严重，而D2和D1下的发病轻且二者间无显著差异。施氮模式RDNP与适度密植D2处理在氮肥减量的同时可提高玉米单产和氮肥偏生产力，有效控制玉米茎腐病和穗粒腐病，降低植株倒折风险，为西南夏玉米实现绿色增产和利于机械化收获提供理论依据。

番茄褪绿病毒病（ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）存在复合侵染的现象，其发病率逐年递增，成为一种新的威胁番茄产业的病毒病害。为了研究复合侵染样品中2种病毒的互作和基因变异情况，对天津番茄产区发生的TYLCV全基因组和ToCV的CP基因和HSP基因进行了克隆和序列分析。结果表明，与单独侵染样品进行比对，TYLCV的基因序列在复合侵染的样品中共有6处碱基发生了变异，分别为73位A→C、92位A→G、347位C→T、1 209位C→T、1 618位A→G、2 107位A→T，除73位和92位的变异未在编码区，其余的变异碱基均在ORF框内，其中1 209位为同义突变，其他均发生了错义突变。ToCV的CP基因有1处同义突变，ToCV的HSP基因共有4处碱基变异，其中826位由T→C和1 166位由G→A均为同义突变，1 395位和1 630位均由A→G，为错义突变。利用实时荧光定量PCR技术对单独侵染和复合侵染的番茄样品中TYLCV和ToCV病毒积累量进行分析。结果表明，在田间单独侵染和复合侵染的样品中，TYLCV的拷贝数差异不显著，ToCV的拷贝数在单独侵染和复合侵染的样品中差异也不显著。在复合侵染的样品中，TYLCV的拷贝数约为ToCV的262~436倍。

旨在筛选河北地区抗枯萎病、炭疽病、白粉病西瓜品种与资源，分析其所含有的抗病基因，为筛选和培育抗病西瓜新品种提供参考。采用改良后的CTAB法提取西瓜种芽DNA，并用超微量分光光度计检测DNA浓度，将其稀释至2~10 ng/μL后使用许勇团队开发的西瓜抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病分子标记，利用高通量分型KASP标记技术对西瓜抗枯萎病、抗炭疽病和抗白粉病性状相关的基因进行了检测。试验材料为河北省近年来审（鉴）定西瓜品种和优势组合（星研七号、美佳、美胜、贵妃、17-11等）以及优异种质资源（花早绿、JB-1、JB-3、901新等）共130份材料，抗病对照为3抗302，感病对照为GBZG。结果表明，所有被检测材料中33份材料含抗枯萎病基因（Fon-1），19份材料含抗炭疽病基因（AR1），7份材料含抗白粉病基因（PM1），5份材料同时含Fon-1和AR1，1份材料同时含AR1和PM1，1份材料同时含Fon-1、AR1、PM1 3种抗病基因。根据KASP检测结果对试验材料进行聚类分析，将试验材料分为4类，分别为抗白粉病基因处均无检测信号或杂合抗性12份、抗白粉病或同时感2种病害材料67份、抗枯萎病或抗炭疽病材料38份，抗枯萎病、抗炭疽病或抗白粉病基因方面均无检测信号或杂合抗性13份。

为明确青海春小麦品种高原363成株期抗条锈性遗传基础，分别以成株期抗条锈性青海春小麦品种高原363与感病春小麦品种Taichung 29（T29）杂交并自交创建F_2：3分离群体，通过在青海省西宁市和海东市互助县2个试验地点各2 a的田间病圃抗病性鉴定，使用单个分离世代分析法用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析高原363/T29 F₂群体的抗性遗传效应。F_2：3群体的反应型和严重度的频率分布结果表明，高原363/T29 F_2：3群体的病害严重度和反应型在西宁和互助共2个环境2 a测试下呈现双峰分布，没有出现连续性分布现象，但是又出现了不同区段内连续性变化，初步分析认为，高原363对小麦条锈病的成株期抗性是一种复杂遗传，这种遗传不仅仅由主效基因控制，同时还受到微效多基因控制，遗传模型分析结果表明，在2个不同地点测试下的高原363，无论是采用严重度数据得出的最优遗传模型还是使用反应型数据得出的最优遗传模型，都是被微效基因影响的2对主基因遗传，并且主基因的作用方式（C-1：2MG-ADI加性-显性-上位性，C-5：2MG-AED完全显性，C-6：2MG-EEAD等显性）是不同的。

在前期研究发现，韭菜处理可以减轻香蕉枯萎病和根结线虫病害的发生，推测韭菜中含有能抑制病原菌及致死根结线虫的生防菌。对韭菜根际真菌和内生（叶片和根系）真菌的种群结构及多样性进行比较分析，以期为分离鉴定韭菜中抑菌和杀根结线虫的生防真菌提供理论依据。通过Illumina平台对韭菜根际真菌和内生（叶片和根系）真菌样品中的18S rRNA序列进行测序，并进行生物信息学分析。结果表明：从韭菜根际土壤、根系、叶片中获得348 484高质量序列和123个操作分类单元（OTU）。根际真菌的Chao、ACE、Shannon指数显著高于内生真菌（叶片和根系），而Simpson指数则显著小于内生真菌。根际真菌群落主要由子囊菌门（Ascomycota）（67.20%）和担子菌门（Basidiomycota）（24.44%）2个菌门组成；而内生真菌主要由子囊菌门组成，在叶片和根系中含量分别为91.39%和96.60%。在检测到的5个菌门中，内生真菌中子囊菌门显著高于根际土壤，其他菌门则显著低于根际土壤。叶片和根系中内生真菌稍有不同，但是差异并不显著。该研究表明，韭菜根际真菌和内生真菌的种群结构存在显著差异，根际真菌的多样性及丰富性显著高于内生真菌。该研究为分离鉴定韭菜中抑制植物病原菌及致死根结线虫的生防真菌提供参考。

为了研究木醋液对土壤微生物，尤其是镰孢菌及疫霉菌数量的影响，采用室内培养方法，向大棚土壤加入系列量木醋液，25℃下培养35 d。结果显示，在培养期间，各处理土壤pH值变化很小。除培养第7天外，木醋液对土壤pH值没有显著的影响，只有加入量达到3.3 mL/kg，土壤pH值才显著降低了近0.2个单位。培养初期加入木醋液的土壤矿质氮含量略有降低，降低量为15.1~28.2 mg/kg。但随着培养时间的延长，所有土壤矿质氮含量逐渐增加至相近的水平（324.9~344.8 mg/kg）。在35 d培养期间，加入不同体积木醋液的土壤，可培养细菌、真菌及放线菌数量与对照土壤仅在某些时间点有明显的差异，但在第14天时，1.3，3.3 mL/kg处理的土壤可培养放线菌数量分别比比对照土壤低31.4%，34.4%；在第21天时，0.7，1.3，3.3 mL/kg处理可培养细菌数量与对照相比显著降低了20.2%，24.8%，40.6%，0.3，0.7，3.3 mL/kg处理可培养真菌数量与对照相比显著降低了45.9%，35.5%，36.6%。加入系列量木醋液的土壤，在培养过程中其镰孢菌和疫霉菌数量的变化很大，但与对照土壤没有显著性差异。总体来看，木醋液作为酸性液体，对土壤酸度产生一定的影响，但对土壤矿质氮、细菌、真菌、放线菌，以及镰孢菌和疫霉菌数量没有显著的影响。说明木醋液几乎没有杀灭镰孢菌和疫霉菌的作用，不适合用作土壤熏蒸剂，减轻土传病害的作用可能也很有限。

为了探讨花生几丁质酶在抵御真菌性病害中的作用，克隆了花生几丁质酶基因并通过遗传转化验证了该基因的功能。以花生品种花育23号基因组DNA和RNA为模板，通过PCR及RT-PCR扩增分别获得长度为1 779 bp的花生几丁质酶基因DNA序列及795 bp的全长cDNA序列。DNA及cDNA序列比对结果表明，该基因包含3个外显子和2个内含子，内含子剪切符合"GT……AG"规则，其cDNA序列被命名为Ah-Chi，编码265个氨基酸，GenBank注册号为HQ439775。利用NCBI在线Blast进行序列比对，结果表明，该蛋白产物与水稻、玉米、紫花苜蓿、大豆、拟南芥的相关蛋白的同源性分别达到83%，83%，72%，58%，49%。用Ah-Chi替换掉植物表达载体pCAMBIA1301上的Gus基因，成功构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-Ah-Chi。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-Ah-Chi转化花生胚小叶外植体，获得再生小苗，经嫁接移栽获得再生植株。利用PCR扩增筛选获得转基因阳性植株，RT-PCR扩增结果表明，转基因植株中Ah-Chi基因表达量增加。用黑斑病菌接种转基因植株和非转基因对照植株离体叶片7 d后，发现非转基因植株叶片褐化及坏死程度较为严重，而转基因植株叶片褐化及坏死程度相对较轻，初步说明转基因植株抗病性增强。

为了揭示hrp基因表达的Harpins蛋白能够广泛地诱导植物对植物病虫害防卫反应的分子机制，通过琼脂固体平板法，发现胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株具有很高的胞外酶分泌活性，该菌接种非寄主植物烟草，能够引起过敏反应（HR），结果表明，Ecc36携带hrp基因。用地高辛标记的hrpN基因作探针，通过Southern 杂交证明了Ecc36菌株中含有hrpN基因，命名为hrpN_EccPR基因；核苷酸序列分析表明，hrpN_EccPR基因的开放阅读框ORF为1 254 bp，编码的Harpin蛋白（命名为HrpN_EccPR蛋白）由417个氨基酸残基组成，其分子量为45.27 ku，等电点为5.73，与其他几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。此外，将hrpN_EccPR基因克隆到表达载体pET28a（+）上，将构建的hrpN_EccPR基因表达载体（pET30a -EccPR）转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG（异丙基硫代-β-D半乳糖苷）诱导HrpN_EccPR蛋白表达，纯化后的HrpN_EccPR能诱导烟草发生过敏反应，表明HrpN_EccPR蛋白具有激发植物免疫反应的生物活性，可为进一步研究HrpN_EccPR蛋白诱导植物防卫反应的机制奠定基础。

白粉病是威胁我国乃至世界小麦生产的最主要病害之一。筛选和培育抗病品种是预防小麦感病减产的一条安全有效途径。为了将合成六倍体小麦中的白粉病抗病基因Pm30导入综合农艺性状好、产量高的优良小麦品种中，利用自育中抗白粉病的优良品系冀资356与合成小麦Synthetics（He-48）（T.dicoccon PI94625/Ae.squarrosa）杂交，经过连续6年的选育，选育出高抗白粉病且农艺性状优良的品系7份。利用与Pm30连锁的SSR标记Xgwm159对这7份品系进行检测，用中国春和Pm30做对照，结果表明，14YF650和14YF675 2个品系扩增出430，460，500 bp条带，说明这2份材料携带来自于野生二粒小麦的抗白粉病基因Pm30。这2个品系表现矮秆抗倒、大穗、综合农艺性状较好，可以作为抗白粉病的亲本直接应用于抗病育种。

为了探索沼液合理的资源化利用方法，为沼液农用提供理论参考，因地制宜地指导农业生产，降低农业生产成本，研究了沼液农用对芥菜产量、品质以及病虫害防治的影响，探究在芥菜产量、品质以及病虫害防治状况最佳情况下的沼液施用量。结果表明，与化肥对照（处理2）相比，大部分施用沼液的小区芥菜产量有所提高，芥菜营养品质有所改善，沼液施用量控制在83 333~108 333 kg/hm²时，芥菜生长优良，产量相对较高，沼液施用量控制在91 667~108 333 kg/hm²时，芥菜品质达到最优。综合考虑芥菜产量和品质，替代化肥施用的沼液控制在91 667~108 333 kg/hm²时最佳。适量沼液喷施对芥菜病虫害防治有良好作用。沼液施用量控制在1 750~2 500 kg/hm²时，芥菜虫口密度接近施药对照；沼液施用量控制在2 250~2 500 kg/hm²时，芥菜虫害率和病情指数均相对最低且接近农药处理对照，当替代农药喷施的沼液控制在2 250~2 500 kg/hm²时，对芥菜病虫害防治得到较好效果。综上所述，施用沼液能显著提高芥菜产量，保证芥菜品质优良，同时对芥菜病虫害防治效果良好，但需要控制在一定施用量范围内并合理施用才能保证芥菜生长各方面的需求，提高沼液的利用效益。

为了分析马铃薯扩展蛋白基因家族的进化与功能，鉴定了马铃薯的扩展蛋白基因家族，分析了其基因结构特征、系统发育及表达模式等。结果表明，马铃薯基因组包含33个扩展蛋白基因，包括A（21）、B（5）、LA（1）和LB（6）4个亚家族，分布在马铃薯11条染色体上。扩展蛋白氨基酸长度为194~488 aa，编码蛋白质具有保守的结构域，蛋白质亚细胞定位预测结果表明所有蛋白均定位于细胞外。基因结构分析表明，马铃薯扩展蛋白家族有23个基因（69.7%）含有2~3个内含子。基因表达分析发现，该家族基因在马铃薯根、茎、匍匐茎、果实及块茎发育过程中表达丰度较高，并且其表达受到高温、盐、激素及病害等逆境的调控。

为了确定引起河北省丰南区发现的一种植株青枯、维管束褐变的番茄病害的病原菌，进行了病原菌分离培养纯化、致病性测定、田间接种后再分离、菌落和形态学观察结合分子鉴定，确定该病害为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型引起的番茄颈腐根腐病。确定病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型。对茎基接种和浸根接种进行了评价，结果表明，茎基接种发病率和死亡率均高于浸根接种。为接种完成该病害的抗病育种和防治药剂筛选的研究提供了理论依据。