为了探究玉米抗寒过程中涉及的关键调控网络和基因,明确对低温胁迫响应的关键调控通路和基因,为后续深入研究鲜食玉米抗寒胁迫的分子机制奠定基础,以耐寒品种闽甜6855为研究材料,利用转录组技术对其受5 ℃低温胁迫24,48,72 h后的基因表达情况进行分析。PCA结果显示,重复间样本可以显著聚集在一起,且处理样本与CK样本显著分开。差异分析结果显示,闽甜6855在低温处理前后差异基因为4 000~7 000个,而不同时长低温处理样本间差异基因较少,为100~2 000个,表明低温是引起基因差异的主要因素,且对低温胁迫的响应主要在前期。KEGG注释分析结果显示,差异基因在植物激素信号转导和MAPK上存在显著富集,表明这2个信号通路积极响应抗寒胁迫。此外,在植物病原菌互作和植物昼夜节律调控通路差异基因也出现了显著富集,暗示着在生物和非生物胁迫的通路上也存在着重叠或共有调控途径,而调控昼夜节律的基因在植物适应低温环境的过程中起着关键的调节作用。

蛋白激酶是植物逆境防御机制中重要的核心成分,植物蛋白激酶SnRK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可通过磷酸化途径在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。分析草地早熟禾蛋白激酶基因SnRK2.4在非生物胁迫下的表达规律,旨在揭示其在逆境调控中的作用,以优质的冷季型草坪草草地早熟禾为试材,利用RT-PCR方法克隆得到SnRK2.4基因,其包含一个1 092 bp开放阅读框区,编码363个氨基酸序列,利用生物信息学分析其分子特征,并采用实时荧光定量PCR方法观测不同组织部位、非生物胁迫下该基因表达模式。结果表明,草地早熟禾SnRK2.4属于SRK/SAPK 家族,包含典型的STKc_SnRK2结构域,酪氨酸激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点等功能域,其与二穗短柄草同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明,草地早熟禾SnRK2.4基因表达水平存在组织特异性,穗部表达量最高,根、茎、叶中无显著差异,草地早熟禾SnRK2.4基因积极响应干旱、盐、低氮、低磷、ABA、BR等非生物胁迫。

为了解谷子中SibHLH19的功能,以抗病谷子材料十里香叶片cDNA和基因组DNA为模板,分别克隆到SibHLH19基因的CDS序列和启动子序列,并利用生物信息学在线工具分析了启动子顺式作用元件及生物学特征;采用Real-time PCR技术检测了SibHLH19转录因子在谷子不同组织部位和抗谷锈病过程中的表达丰度变化;利用SDS-PAGE技术分析了该基因原核表达特征。结果表明,SibHLH19转录因子CDS序列全长843 bp,编码280个氨基酸,预测蛋白质分子质量为29.97 ku,理论等电点pI为5.85,编码蛋白质化学式为C₁₂₉₆H₂₀₇₁N₃₉₇O₄₀₀S₁₁,含有一个bHLH保守结构域,属于不稳定亲水性蛋白质。该蛋白质二级结构的最大元件是无规则卷曲,最小元件为β-转角。进化分析表明,SibHLH19与禾本科植物糜子(RLM85279.1)、哈氏黍(PUZ71581.1)和柳枝稷(XP_039835205.1)氨基酸序列的同源性较高,与小麦(KAF7059972.1)、节节麦(XP_040244423.1)同源性最低。启动子顺式作用元件分析表明,该基因启动子区存在多个激素、胁迫等应答元件。组织表达分析表明,该基因主要在谷子苗期表达,并以苗期地上部分表达量最高,孕穗期几乎无表达。在谷子响应谷锈菌生物胁迫反应的24 h内,SibHLH19基因在抗病反应8,16 h上调表达,而感病反应中仅在16 h略微上调表达,其余时间均下调表达,推测SibHLH19在谷子抗锈病反应中起正调控作用。构建的原核表达载体pET30a-SibHLH19经0.1 mmol/L IPTG诱导能表达出表观分子质量约44 ku的SibHLH19融合蛋白。

为研究不同类型水稻对镉(Cd)胁迫差异的原因,以镉敏感籼稻恢复系昌恢891(CH891)和镉耐受粳稻品种02428为材料,选取种子萌发后,连续镉处理3 d的和未进行镉处理的幼芽,使用高通量Illumina HiSeq 4000测序技术进行RNA-Seq分析,共得到539 524 490个有效读长,与参考基因组的比对率在94.81%~96.82%,GC含量均在49%以上。通过比较分析,共检测到7 204个差异表达基因(DEGs),其中在CH891中特异表达的基因(SCR3)有849个,02428中特异表达的基因(RCR3)有676个,2个品种均有表达但表达量存在差异的基因(CCR3)有770个。KEGG和GO富集通路分析表明,异黄酮生物合成、磷酸肌醇代谢、黄酮类生物合成和花青素生物合成途径在SCR3中显著富集,细胞核、自噬调节和胰岛素抗性途径在RCR3中显著富集,α-亚麻酸代谢、吞噬体、柠檬烯和蒎烯降解和脂肪酸降解途径在CCR3中显著富集。结果表明,Cd处理后,次级代谢过程主要在CH891中富集,蛋白质代谢主要在02428中富集,综上所述,CH891和02428响应的代谢路径存在差异,控制这些代谢路径的分子机制可能是造成不同水稻镉胁迫差异的主要原因。

为了研究芍药ACS基因的功能,应用RACE技术从芍药切花品种桃花飞雪中克隆了PlACS基因cDNA序列,利用生物信息学方法对其编码的蛋白质进行了综合分析;以pET32a为骨架,构建了PlACS基因的原核表达载体,建立了PlACS蛋白高效的原核表达体系。结果表明,PlACS cDNA全长1 752 bp(GenBank登录号JX512359),共编码492个氨基酸,具有7个保守结构域及活性位点K₂₇₈;分子进化分析表明,PlACS和牡丹ACS亲缘关系最近;二级结构预测发现,PlACS蛋白由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,四者比例分别为40.04%,16.26%,6.91%和36.79%;同源建模显示,PlACS蛋白以同源二聚体形式存在。PlACS蛋白最佳诱导表达条件为基因工程菌菌体密度A₆₀₀达0.2时,在菌液中加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在37 ℃诱导2 h。PlACS重组蛋白高效原核表达体系为后续通过变复性获得有生物学活性的PlACS蛋白及其酶学功能鉴定奠定基础。

CYP79B2是拟南芥中调控生长素合成的有关基因,通过克隆普通白菜CYP79B2的同源基因BrcCYP79B2-1,分析其在不同组织及时期的表达情况,研究其对普通白菜春化开花的调控作用机理,旨在为后续普通白菜生长素编码基因的功能验证奠定理论基础。通过qRT-PCR方法从普通白菜中克隆到CYP79B2的同源基因,命名为BrcCYP79B2-1,利用生物信息学方法对其蛋白的结构、理化性质和亲缘关系进行分析,并利用qRT-PCR方法分析其在普通白菜中不同组织和生育期的表达量。结果表明,BrcCYP79B2-1基因编码序列全长为1 623 bp,编码540个氨基酸;对其蛋白质的理化分析结果表明,蛋白质分子质量为60.849 73 ku,理论等电点为8.71。与其他物种的氨基酸序列进行比对发现,BrcCYP79B2-1在十字花科植物中高度保守,且与芜菁同源性最高,达99.52%;采用qRT-PCR分析普通白菜不同器官的表达量发现,BrcCYP79B2-1在根中的表达量最高,在叶中次之,而在花蕾中的表达量最低;分析幼苗在低温处理0,10,15,16 d的表达发现,BrcCYP79B2-1在低温处理第10天,即营养生长期的表达量达到峰值,而在花芽分化期的表达量有所降低,说明该基因的表达与低温春化有关,可以影响花芽分化。

为了深入了解亚麻种质产量相关性状的遗传变异,以229份亚麻种质为材料,利用广义线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)的关联分析,以挖掘亚麻产量相关性状显著关联的SSR标记。结果表明,呼和浩特地区种植亚麻种质株高((58.40±5.67)cm)、单株果数((17.50±3.50)个)和单株粒质量((0.55±0.15)g)的平均值最大;在集宁地区分枝数((5.00±1.25)个)、果粒数((6.52±2.67)粒)和千粒质量((5.58±1.48)g)平均值最大。7个产量相关性状的表型变异系数为11.18%~18.29%。广义遗传力从大到小依次为千粒质量>果粒数>单株粒质量>株高>单株果数>分枝数>工艺长度。群体结构K=4时,229份亚麻种质分为4个群体。30对SSR引物共扩增出365条带,与亚麻7个产量相关性状进行GLM关联分析共检测到36个SSR标记,表型变异的解释率为1.15%(Lu146)~7.75%(Lu747);MLM关联分析共检测到23个SSR标记,表型变异的解释率为2.26%(Lu203a)~7.16%(Lu291)。在GLM和MLM下,单株粒质量、单株果数和分枝数同时检测到了Lu203a和Lua125a标记,分别分布在第12,2号染色体上。亚麻SSR标记能够很好地关联到产量相关性状,具有一定的解释率。

为探究北方冬麦区小麦品种春化基因组成与冬春性的关系,以北方冬麦区271份小麦主栽品种为试验材料,通过分子标记对4个主效春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3的组成和分布进行检测,并在海南省三亚市观察田间抽穗情况,同时结合资料记载调查其冬春性特性。分子标记检测结果显示,4个显性等位基因中Vrn-D1(占27.7%)在供试品种中分布频率最高,且呈现由南向北逐渐降低趋势;显性等位基因Vrn-B1在该麦区小麦材料中分布频率较低(占3.0%);所检测材料中均不含显性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3;该麦区小麦春化基因组合主要为vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3。通过对供试小麦材料进行冬春性分析,发现部分含有显性等位基因Vrn-D1的材料需要春化才能开花结实,而包含显性等位基因Vrn-B1的小麦材料对春化的需求明显较弱。4个显性春化基因中,只有显性等位基因Vrn-D1和Vrn-B1在所检测的北方冬麦区小麦品种中有分布,且显性等位基因Vrn-B1对小麦春化发育特性的作用强于Vrn-D1。

为探究不同类型超级稻动态株型特点及差异,为华南稻区超级稻育种和栽培提供理论指导,选用华南稻区4个超级杂交稻组合、2个超级常规稻品种和2个优质超高产常规稻为供试材料,于秧苗期、分蘖盛期、幼穗第二次枝梗原基分化期、始穗期和成熟期,考查株叶形态、单位面积干物质量及产量。结果表明,供试材料的株高、单株平均茎蘖数、叶片形态、单位面积干物质量和产量构成因素等5个方面动态株型指标具有明显的季节生态特点。在生长发育前期和中期,除上部3片功能叶的开张角度外,其他各项指标超级杂交稻组合均显著高于超级常规稻品种。单位面积有效穗数、穗粒数、千粒质量、经济系数和单位面积产量,杂交稻组合显著高于常规稻品种;但是常规稻品种的穗长和结实率极显著高于杂交稻组合。因此,早晚兼用型优质超高产水稻育种的动态株型构建,要求苗期早生快发、中后期生物产量大、成熟期收获指数高,其中常规稻品种需要培育品种早生快发特性、提高生物产量、保持高结实率的前提下适当提高千粒质量和穗粒数,杂交稻组合则要进一步提高结实率。

为探讨花期低温对甘蓝型油菜生长发育及生殖器官发育的影响,以甘蓝型油菜GZ恢(抗冬季寒冷强)和10B(抗冬季寒冷弱)为材料,于初花期在人工气候室进行低温(白天14 h,12 ℃;夜晚10 h,2 ℃)胁迫,设置5个处理时间:1,2,3,4,5 d,正常生长环境(白天14 h,22 ℃;夜晚10 h,18 ℃)为对照,测定了低温胁迫下植株苔茎叶和下部叶生理指标以及不同大小花蕾开放后的花粉活力和柱头可授性。结果表明:两材料在低温处理后植株叶片均表现轻微萎蔫,所有处理植株无明显受损;低温处理后叶片各生理指标变化比较复杂,以过氧化物酶(POD)敏感,多表现为显著升高,下部叶较苔茎叶升高更多,10B较GZ恢升高幅度大。渗透调节物质以可溶性糖(SS)含量变化明显,GZ恢显著增加。丙二醛(MDA)含量显著增加,10B较GZ恢升高更多,下部叶和苔茎叶两材料表现不尽一致。低温处理对两材料大于6.0 mm的花蕾花粉活力受影响均很小。小于3.0 mm的花蕾,胁迫4 d以上后期发育停止最终死亡,胁迫2~3 d花粉活力显著下降,且花蕾越小,花粉活力随处理时间增长降低越多。小于6.0 mm的各级花蕾受低温胁迫后,GZ恢花粉活力多高于10B,以3.0~6.0 mm的花蕾差异明显,因此,认为3.0~6.0 mm花蕾可作为鉴定不同品种花期耐低温指标。柱头可授性表现与花粉活力趋势一致,大于3.0 mm的花蕾低温处理3 d以内柱头可授性不受影响,处理4 d以上柱头可授性降低;小于3.0 mm的花蕾,低温处理3 d以内柱头可授性不同程度降低。这些结果表明,在植株遭受低温胁迫后,小于3.0 mm的花蕾对低温较为敏感,导致花粉活力和柱头可授性降低,甚至败育。

为探讨谷子全生育期耐旱性鉴定的有效方法,筛选谷子全生育期耐旱性鉴定指标,加快谷子耐旱育种进程,2019—2020年以30份谷子种质为试材,采用随机不完全区组设计(alpha-格子设计),设干旱胁迫(DS)和正常供水(CK)2个处理,考察相关农艺性状和产量指标的耐旱系数。联合方差分析结果表明,土壤水分环境对千粒质量影响显著,对其他指标影响极显著,基因型对单株穗质量和单株粒质量影响显著,对其他指标影响极显著,基因型与土壤水分环境互作极显著影响谷子的生长性状,对产量性状的影响不显著(千粒质量除外)。在干旱胁迫下,各指标性状值较CK均发生不同程度下降,且各指标性状对干旱胁迫反应的敏感性不同。t检验结果表明,干旱胁迫处理效果显著(千粒质量除外)。GGE双标图解释了数据总变异的71.15%,各指标耐旱系数间存在不同程度的相关性,其中株高、穗长、茎叶干质量和倒二叶叶面积的耐旱系数显著正相关,穗质量、穗粒质量、穗粒数和产量的耐旱系数显著正相关。谷子的耐旱性可以通过不同的农艺性状体现。依据与理想耐旱品种和理想耐旱鉴定指标的距离对供试谷子材料耐旱性和耐旱评价指标进行了排序,其中太选26号、朝谷62号和朝谷13号等材料耐旱性较强,株高和穗质量可作为谷子全生育期耐旱性鉴定首选指标。GGE双标图为谷子耐旱品种选育提供了一个客观有效的新的可视化鉴定方法。

为了探究夏玉米粒位效应对增密的响应及其碳氮代谢特征,2020—2021年在河北省农林科学院粮油作物研究所堤上试验站,通过设置不同密度处理(PD1:6.0万株/hm²;PD2:7.5万株/hm²;PD3:9.0万株/hm²)的大田试验,研究了增密对玉米不同粒位籽粒灌浆与碳氮代谢生理特征的影响。结果显示,增密对弱势粒灌浆影响较为明显,其灌浆速率和粒质量差异呈现时间分别自授粉后20~25 d和30~35 d开始。弱、强势粒粒质量比随着种植密度的增加明显降低,与PD1相比,PD3处理的弱、强势粒粒质量比平均降低8.45%。增密明显降低了单株干物质积累量,主要归因于花后干物质积累量的明显降低。通过对弱、强势粒碳氮代谢生理相关指标的分析表明,增密加剧了玉米弱、强势粒间淀粉和蛋白含量差异,同时也加剧了玉米灌浆中期弱、强势粒间蔗糖磷酸合成酶(SPSase)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGase)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性的差异,这主要与增密明显降低弱势粒SPSase、ADPGase和GS活性有关;综上所述,增密通过明显降低弱势粒灌浆充实而加剧玉米的粒位效应,增密限制玉米弱势粒灌浆一方面与其降低花后干物质积累有关;另一方面与其明显影响弱势粒碳氮代谢酶SPSase、ADPGase和GS活性密切相关。

旨在为梅乐葡萄优质生产和精准施肥提供理论基础,通过对各生育期、不同组织部位矿质元素含量的测定,并依据果实酚类物质所形成的品质指数进行营养诊断分析。利用Topsis分析法,计算果实酚类物质的综合品质指数,即CI值,通过比较不同生育期各组织各矿质元素含量与CI值的相关性,确定营养诊断因子;采用CND法对高优品质指数的果园进行划分,对低优果园进行营养诊断。结果表明,蓬莱产区梅乐葡萄叶片、叶柄与果实各矿质元素间存在显著的协同与拮抗关系。转色期果实N、成熟期果实P、转色期果实K、转色期叶片Ca、盛花期花序Mg、转色期果实Fe、盛花期叶片Mn、成熟期果实Zn、盛花期叶柄Cu、转色期叶柄B、盛花期叶片Mo被选为植株营养诊断因子。高优园的品质指数拐点值为0.735 5,其中有7个果园满足此条件,占总体样本的14.58%。依据高优园植株矿质元素含量范围确定营养诊断因子的适宜值分别为:N(8.85~11.81)mg/g、P(1.98~4.26)mg/g、K(14.97~20.70)mg/g、Ca(35.57~68.83)mg/g、Mg(3.69~15.51)mg/g、Fe(70.96~103.26)mg/kg、Mn(166.20~277.67)mg/kg、Zn(10.71~20.27)mg/kg、Cu(9.54~14.90)mg/kg、B(11.44~17.07)mg/kg、Mo(0.69~1.60)mg/kg。低优园营养诊断表明,其植株的K、Ca、Mn、Mg表现偏低。以获得最高果实品质指数为目标,每公顷建议施肥量分别为N 62.25 kg、P₂O₅ 46.50 kg、K₂O 0.00 kg、CaO 56.25 kg、MgO 46.50 kg。Ca和Mg肥施应采用少量多次的原则;加强果园水肥管理,提高树体对K元素吸收;通过叶面喷施,适当补充缺乏的Mn元素。

为探究滴灌水肥一体化条件下施氮量和施氮时期组合对夏玉米穗位叶叶片光合特性、衰老特性、籽粒灌浆特性及产量的影响,选用夏玉米品种郑单958为试材,设置了210 kg/hm²条件下,拔节期、大喇叭口期和开花期追肥处理(A1),拔节期、大喇叭口期追肥处理(A2),拔节期、开花期追肥处理(A3);180 kg/hm²条件下,拔节期、大喇叭口期和开花期追肥处理(A4),拔节期、大喇叭口期追肥处理(A5),拔节期、开花期追肥处理(A6);并设置传统畦灌为对照(CK),总施氮量为240 kg/hm²,CK1在拔节期一次性追施氮肥,CK2在拔节期和大喇叭口期分别追施氮肥,共计8个处理。结果表明,A1、A4处理与CK1相比,在夏玉米生育后期维持了LAI、SPAD值的同时,亦显著提高了抗氧化酶(SOD、POD、CAT)的活性,且有效抑制了过氧化物MDA的含量,从而延缓了其叶片的衰老进程,保护了叶片细胞功能结构。因此,该处理下的夏玉米在其生育后期维持了高效的光合特性,促进了籽粒灌浆速率,进而增加了穗粒数和千粒质量,使得玉米产量得以显著提高。A1和A4处理产量差异不显著,但A4相比A1施氮量降低14.3%,减少了氮肥的投入,节约了投入成本,为试验的推荐处理。

为研究成都平原油菜-水稻轮作体系下不同秸秆用量对土壤活性有机碳组分及碳循环酶活性的影响,于2017—2020年开展连续3 a的田间定位试验,分析秸秆不还田对照(CK)、常规化肥(NPK)、常规化肥+1/2量秸秆(SR1)、常规化肥+全量秸秆(SR2)、常规化肥+2倍秸秆(SR3)5个处理下土壤理化性质、活性有机碳组分含量、碳循环酶活性及其相互间的相关性。结果表明:相比试验前,秸秆还田能有效改善土壤理化性状,提高土壤速效氮、磷、钾等养分含量;与CK处理相比,秸秆还田处理的土壤有机碳、易氧化有机碳、溶解性有机碳以及微生物量碳含量分别显著提升了5.05%~8.55%,18.40%~36.80%,35.76%~66.93%,27.20%~52.10%,且均表现为秸秆用量越大活性有机碳组分含量越高。另一方面,与CK和NPK处理相比,3个秸秆还田处理土壤纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶活性均显著提升;其中SR2处理下的土壤纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶活性值最高,比SR1处理分别显著高出16.25%,8.49%,14.69%,SR3处理下的过氧化氢酶活性最高,比SR1处理显著高出25.10%。相关性分析可知,土壤SOC、活性有机碳组分及碳循环酶活性之间均呈现显著正相关。由此可见,在成都平原稻-油轮作体系下,实行全量秸秆还田是提高土壤活性有机碳组分含量及碳循环相关酶活性、促进土壤质量正向提升的最佳选择。

为了进一步揭示寒地玉米秸秆在施用低温降解秸秆菌剂下腐熟的过程及机理,为寒地秸秆的腐熟和综合利用工作提供新的策略和参考理论依据,采用低温降解秸秆菌剂在寒地条件对玉米秸秆进行腐熟并对其理化性状及微生物多样性进行分析。根据发酵过程中温度的变化,将玉米秸秆腐熟过程分为5个时期:初始期(A1)、升温期(A2)、腐熟期(A3)、平稳期(A4)及降温期(A5)。不同腐熟时期玉米秸秆的理化性质监测结果如下:随着腐熟时间的延长,玉米秸秆表皮上的纤维束逐渐被破坏;在腐熟结束后,玉米秸秆中纤维素的相对含量降至33.48%,半纤维素的相对含量降至16.57%;秸秆中全氮、铵态氮的含量呈先降低后升高的趋势,有机质的含量降至149.7 g/kg。发酵垛中微生物多样性的监测结果如下:耐冷酵母属在腐熟过程中的丰富度最高,占重要的主导地位;假单孢菌属和鞘氨醇杆菌属在腐熟初始期和腐熟期为主要菌属;在腐熟过程的平稳期和降温期中,嗜热微生物发挥着主要作用。该研究明确了寒地条件下玉米秸秆在施用低温降解秸秆菌剂后腐熟过程中理化性状及发酵垛中微生物多样性的改变。

分蘖期和拔节—孕穗期是水稻产量构成要素中穗数和穗粒数形成的2个关键生育时期,氮素影响分蘖成穗和穗粒数的形成,细菌是土壤氮素循环的重要参与者。以高产水稻品种Y两优900和早丰优69为试验材料,通过设置2个氮肥施用比例(基蘖肥和穗粒肥比例分别为7:3和6:4),分析了分蘖期和拔节—孕穗期土壤细菌数量、群落特征的差异,及其与水稻产量、土壤氮素的关系。结果表明,水稻的分蘖期和拔节—孕穗期土壤细菌群落结构存在差异;分蘖期和拔节—孕穗期稻田土壤细菌优势菌门是变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和酸杆菌门等。分蘖期绿弯菌门的相对丰度比拔节—孕穗期高6.16百分点,酸杆菌门的相对丰度比拔节—孕穗期高2.65百分点;拔节—孕穗期的变形菌门相对丰度比分蘖期高0.69百分点,拟杆菌门相对丰度比分蘖期高1.09百分点。相关性分析发现,水稻产量与分蘖期土壤细菌数量呈显著负相关关系,而与拔节—孕穗期土壤细菌数量和全氮含量均呈显著正相关关系;有效穗数与分蘖期土壤细菌数量呈显著正相关关系,穗粒数与分蘖期、拔节—孕穗期的氨氧化潜势均呈显著正相关关系。冗余分析(RDA)结果表明,稻田土壤细菌群落结构受多种因素共同影响,分蘖期土壤的铵态氮和拔节—孕穗期土壤的氨氧化潜势是显著影响稻田土壤细菌群落结构的2个环境因子。FAPROTAX功能预测进一步说明,分蘖期7:3处理的反硝化功能增强,其中Y两优900土壤细菌的反硝化功能最强。因此,分蘖期土壤细菌数量的增加可提高水稻有效穗数。拔节—孕穗期土壤细菌参与的氨氧化作用可促进水稻穗粒数的增加。高产水稻品种Y两优900和早丰优69在不同施氮比例下,产量、有效穗数和穗粒数的形成与土壤细菌数量、群落组成及其生态功能关系密切。

大麦黄矮病毒引起的小麦黄矮病是我国小麦生产上重要的病毒病。BYDV GAV株系是我国小麦黄矮病的主要病原,目前有关BYDV GAV编码蛋白质P1、P2和CP的功能研究鲜有报道,因此,研究P1、P2和CP的功能,可为深入研究BYDV GAV的致病机制奠定基础。通过Mega 7.0构建系统进化树,对BYDV GAV株系编码蛋白质P1、P2和CP的核苷酸序列进行同源进化分析;通过构建P1、P2和CP的YFP表达载体,转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟,激光共聚焦显微镜观察确定3个蛋白质的亚细胞定位;构建BYDV GAV 5个编码蛋白质的双分子荧光互补载体,转化GV3101农杆菌后分别与P1、P2和CP共浸润本氏烟叶片,通过激光共聚焦显微镜观察确定这3个蛋白质与其他病毒蛋白质的体内互作情况;通过构建P1、P2和CP的马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体,转化GV3101农杆菌后接种本氏烟,接种后5 d观察症状形成,并采集系统叶进行病毒积累量检测,研究3个蛋白质对该病毒致病性的影响。结果表明,BYDVs的4种分离物中,PAV与GAV在核苷酸水平上的亲缘关系最近。BYDV GAV编码的P1、P2和CP蛋白亚细胞定位均为核质;在植物体内P1存在自身互作;PVXCP接种后5 d即可观察到系统叶褪绿并能够检测到病毒的积累,而PVX、PVXP1、PVXP2处理未能观察到症状且不能检测到病毒的积累;接种后10 dPVX、PVXP1和PVXP2处理能够检测到病毒的积累,表明CP促进了PVX症状的形成和致病进程。综上,P1可能通过自身互作参与病毒的侵染过程,CP可以促进病毒的侵染。

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

为探究猕猴桃AcWRKY70转录因子在不同抗病性品种中响应猕猴桃溃疡病胁迫的作用机制,以抗性病品种徐香和高感病品种红阳猕猴桃叶片cDNA为模板克隆AcWRKY70基因,并对红阳AcWRKY70基因序列特征进行分析,对编码蛋白进行系统进化分析及亚细胞定位预测。通过RT-qPCR分析AcWRKY70基因的组织特异性,不同抗性猕猴桃品种对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Psa)和水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)处理下表达模式的差异。结果显示,红阳AcWRKY70基因序列总长906 bp(GenBank登录号:MW881147),开放阅读框885 bp,编码294个氨基酸;含有典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为C2-HC,属于WRKY家族第Ⅲ类组,亚细胞定位预测表明,其定位于细胞核,系统进化树分析表明,其与茶树亲缘关系最近。红阳和徐香AcWRKY70基因均在叶片中表达量最高。在Psa处理下,12 h徐香品种AcWRKY70基因相对表达量迅速上升至对照的80.58倍;而在红阳中48 h该基因相对表达水平上升至最高。在SA与Psa(SA+Psa)和MeJA与Psa(MeJA+Psa)共同处理下,12 h徐香AcWRKY70基因相对表达量达到最高;而红阳AcWRKY70基因分别在72,24 h表达量达到最大。AcWRKY70基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,不同抗性的猕猴桃品种中响应病原菌的抗性机制可能存在较大差异。

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBac^TMHTB载体上的酶切位点BamH Ⅰ和Xba Ⅰ分别加入上下游引物,利用PCR技术对N基因进行扩增,先后连接T-Vector pMD19(simple)载体与pFastBac^TMHTB载体,并获得重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N和pFastBac^TMHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达,获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因,构建的重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确,在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N通过PCR鉴定得到预期2条带,大小分别为2 430,3 690 bp,证明成功得到重组杆粒,用该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,同时设立重组GFP蛋白对照组,转染120 h后分别收集重组N蛋白与重组GFP蛋白并制样;分别进行SDS-PAGE和WB分析,使用HRP-His标记抗体验证转染成功且重组N蛋白与重组GFP蛋白均在Sf9细胞内顺利表达,试验结果与预期相符,重组N蛋白条带大小约为46 ku。该试验成功构建了呼吸道冠状病毒N基因真核表达载体,并在昆虫细胞内成功表达,为建立ELISA检测方法等相关研究提供试验基础。

为了探究褪黑素在小麦与叶锈菌互作中的作用,以小麦品种洛夫林10(简称L10)与叶锈菌生理小种260组成不亲和组合为研究对象,通过外源注射甲基紫精(甲基紫精作为一种氧化剂诱发产生超氧阴离子,可以有效增加活性氧的含量),诱导产生活性氧,利用褪黑素清除活性氧的能力确定褪黑素最佳作用浓度;然后在小麦幼苗叶片中注射褪黑素并接种叶锈菌生理小种260,通过DAB染色观察H₂O₂含量变化;通过Rohringer染色检测HR面积;通过测定小麦过氧化物酶和过氧化氢酶活性,探究外源注射褪黑素对小麦抗氧化能力的影响;通过以上研究以明确褪黑素在小麦与叶锈菌互作中的作用。结果表明:外源注射甲基紫精引起的活性氧增加,其清除最适的褪黑素注射浓度为10 μmol/L。对不亲和组合的DAB染色结果显示,注射10 μmol/L褪黑素后,叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H₂O₂积累量少于对照组,表明褪黑素参与了H₂O₂清除作用; Rohringer染色结果表明,经过外源性褪黑素处理后小麦HR细胞面积减小,有效增强了对叶锈菌的抗性。此外,外源注射褪黑素提高了抗氧化酶POD和CAT的活性,表明小麦的抗氧化能力获得显著提升。试验结果表明,外源注射褪黑素参与了小麦抗叶锈菌过程中活性氧的清除,提高了小麦的抗病能力。

为了揭示不同品种以及不同器官中内生菌的多样性特征,初步明确内生菌群落结构与宿主品种及器官类型的相关性。以感谷瘟病品种沙湾谷子、冀谷22和抗谷瘟病品种小青谷、石榴子为材料,分别取植株的茎、叶片、叶鞘,通过基于16S rDNA V3—V4区的高通量测序进行微生物多样性分析。结果显示,感病品种与抗病品种内生菌物种组成具有一定差异性,所用供试样本中,门水平优势类群均为变形菌门、放线菌门,拟杆菌门、绿弯菌门、粘菌门、厚壁菌门次之。Alpha多样性分析表明,感病品种(沙湾谷子、冀谷22)叶片内生菌丰富度较高;PCoA分析则表明,器官类型比品种对内生菌群落结构影响更大。物种组成分析表明,感病品种沙湾谷子及冀谷22含有与小青谷、石榴子(抗谷瘟病)差异较大的内生菌群,感谷瘟病品种(沙湾谷子、冀谷22)叶片都具有Entotheonellaeota;抗谷瘟病品种则在叶鞘中均具Hydrogenedentes。明确了感、抗谷瘟病品种谷子及各个品种的不同器官内生菌的多样性及群落结构具有一定差异,器官类型比品种对内生菌群落结构的影响更大。

为探讨硅酸钠增强马铃薯黑痣病抗性的分子机制,将硅酸钠诱导马铃薯转录组中表达量较高的基因StWRKY11进行克隆和生物信息学分析。从马铃薯中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增该基因并克隆,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及分析。结果表明,从马铃薯大西洋中克隆了阅读框为1 005 bp的StWRKY11基因,编码334个氨基酸,表达蛋白分子式为C₃₀₁₃H₅₀₂₃N₁₀₀₅O₁₂₆₀S₁₉₉,分子质量为81.867 94 ku,理论等电点(pI)为5.09,原子总数为10 500。表达蛋白含有一个典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为CX₅CX₂₃HXH,属于第二类Ⅱd亚家族;表达的为疏水稳定性蛋白,无跨膜区和信号肽结构域,二级结构元件是α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规卷曲,其中无规则卷曲比例最高,达61.68%,共有29个磷酸化位点,可能定位于细胞核内。启动子上游具有与抗性胁迫响应相关的顺式调控元件及与生长发育和激素响应顺式作用调控元件。该基因与马铃薯StWRKY5基因的亲缘关系较近,编码蛋白的氨基酸同源性达到95%。

松果体-下丘脑-垂体-甲状腺轴(PHPTA)对动物的繁殖活动有重要的调节作用。为探讨Kiss1/GPR54系统在甘加藏羊PHPT轴的表达及其对繁殖活动的调控,选取24只处于发情周期内健康未孕的甘加藏羊作试验组,6只处于非繁殖季节的甘加藏羊作对照组,运用酶联免疫吸附法检测其血浆Kisspeptin动态变化,用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学方法检测视神经、松果体、下丘脑、垂体和甲状腺组织中Kiss1、GPR54 mRNA及其蛋白的表达与分布。结果显示:血浆Kisspeptin分泌量在发情后期显著高于其他时期(P<0.05),繁殖季节内各时期分泌量均显著高于非繁殖季节(P<0.05)。Kiss1、GPR54 mRNA及其蛋白在视神经、PHPT轴组织中均有表达:视神经Kiss1、GPR54 mRNA相对表达量在发情前期显著高于其余时期;松果体在Kiss1 mRNA及其蛋白乏情期达到最大值,显著高于繁殖周期;下丘脑和甲状腺Kiss1、GPR54 mRNA相对表达量均在发情后期显著升高(P<0.05);垂体组织中二者mRNA的相对表达量在发情期显著高于其他时期。免疫组织化学检测结果显示:在视神经中,Kisspeptin与GPR54分别主要分布在神经胶质细胞核与胞质中;松果体细胞胞质中二者均呈强阳性表达;在下丘脑中,Kisspeptin表达在神经内分泌小细胞和神经胶质细胞中,GPR54表达在神经内分泌小细胞胞质中;在垂体组织中,Kisspeptin和GPR54主要表达在嗜碱性细胞的胞质中;而在甲状腺中,二者主要表达在滤泡细胞胞质中。甘加藏羊发情周期血浆Kisspeptin的动态变化及Kiss1、GPR54在各组织中的差异表达,表明Kiss1/GPR54系统参与调节了甘加藏羊的生殖生理活动。

为明确吻素(KISS1)和酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)在诱导排卵动物生殖轴组织中的表达模式和生理功能,解析KISS1和TrkA对诱导排卵动物生殖的调控机制,以家兔为诱导排卵动物模型,采集妊娠中期(14~18 d)家兔生殖轴系组织(下丘脑、垂体、卵巢和子宫),通过苏木精-伊红染色(H&E)、免疫组织化学染色(IHC)、半定量PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印迹(WB)分析妊娠家兔生殖轴组织中KISS1和TrkA的表达规律和分布特征。IHC结果表明,家兔垂体嗜碱性细胞和卵子透明带中KISS1蛋白的阳性反应较强;TrkA蛋白在下丘脑神经内分泌小细胞、垂体嗜碱性细胞、卵巢颗粒黄体细胞、子宫固有层呈阳性表达。RT-PCR结果显示,妊娠家兔生殖轴组织中均有KISS1表达,且两两比较组间差异显著;下丘脑、垂体、卵巢各组织中TrkA mRNA表达丰度组间差异极显著。KISS1和TrkA 基因qRT-PCR结果与RT-PCR结果表达趋势一致。WB结果发现,KISS1蛋白仅在垂体组织表达;TrkA蛋白在生殖轴组织中均有表达,且表达量在子宫、卵巢、垂体、下丘脑各组织依次呈下降趋势。结果说明,KISS1和TrkA参与调控家兔妊娠过程,且TrkA的作用范围更为广泛。

旨在利用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪背最长肌组织样本进行mRNA测序和差异分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键基因,从而为猪肉品质研究提供新的参考信息。采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌组织样本,提取其RNA,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对mRNA进行测序,并对获得的reads进行比对、注释和差异表达分析,用NOISeq筛选出差异表达基因并进行相关生物学功能富集分析。结果表明,从2个猪种间共筛选出了664个差异表达基因,其中,364个基因在松辽黑猪中高表达,300个基因在长白猪中高表达。通过对差异表达基因进行生物学功能分析,筛选出LPIN1、FADS1、FADS2、PLIN2、PPARGC1A、PRKAG2和ACSL1等基因参与脂类代谢和肌肉发育相关的调控,相关通路为脂肪酸代谢、PPAR信号通路、AMPK信号通路、胰岛素信号通路和脂肪细胞因子信号通路等。

为了探究C型凝集素(C-type lectin)家族成员在合浦珠母贝机体内的作用及表达模式,为进一步解析合浦珠母贝PfCLEC17A的免疫应答机制,通过 RACE 技术克隆获得合浦珠母贝C型凝集素基因PfCLEC17A;利用生物信息学方法分析了PfCLEC17A的分子特征,并通过荧光定量PCR检测PfCLEC17A基因在合浦珠母贝的鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、血液、足和肝胰腺等组织及溶藻弧菌感染后在肝胰腺中的表达情况。结果显示,从合浦珠母贝中克隆获得新的C型凝集素基因PfCLEC17A,cDNA全长为699 bp,其中开放阅读框(ORF)长534 bp,编码178个氨基酸残基,含有一个CTL结构域。系统进化树分析表明,合浦珠母贝与其他贝类的PfCLEC17A基因聚集在一个分支。实时荧光定量 PCR 结果显示,PfCLEC17A在合浦珠母贝的鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、血液、足和肝胰腺等各个组织中均有表达,其中在肝胰腺中的相对表达量最高且显著高于在其他组织中的相对表达量。肝胰腺作为软体动物重要的免疫器官,暗示PfCLEC17A基因可能参与机体免疫过程。藻弧菌感染 1 h 后,合浦珠母贝PfCLEC17A基因表达水平显著升高并达到最大值,说明该基因参与弧菌等微生物刺激的早期反应。综上所述,PfCLEC17A基因参与合浦珠母贝的免疫应激反应,具有一定的免疫功能。