富含半胱氨酸类受体激酶作为受体激酶重要亚家族,在植物生长发育中发挥关键作用。旨在解析GhCRK26基因与棉花纤维发育的关系,为棉花纤维品质改良提供理论基础。选用陆地棉系9和海岛棉新海16,采集纤维发育不同时期样本及根、茎、叶组织。通过qRT-PCR分析GhCRK26基因表达模式;利用PCR技术克隆GhCRK26基因;借助生物信息学工具构建系统发育树,预测蛋白理化性质、跨膜结构及信号肽;运用PlantCare数据库分析启动子顺式作用元件;通过亚细胞定位试验明确蛋白定位。结果表明,GhCRK26基因在2个品种开花后10,20,30 d的表达量呈现极显著差异;在系9中叶片的表达水平最高,在新海16中,茎与叶的表达量未表现出显著差异。成功克隆获得2 049 bp的CDS序列,编码682个氨基酸。进化树显示,GhCRK26蛋白与野西瓜苗亲缘关系最远,与夏威夷棉、海岛棉最近;该蛋白为亲水不稳定蛋白,含跨膜结构和信号肽;启动子区鉴定到茉莉酸甲酯和脱落酸响应元件;亚细胞定位证实其定位于细胞膜。以上研究为进一步深入解析GhCRK26基因在纤维发育中的功能提供了依据。

棉纤维细胞中的微管及微管结合蛋白对细胞内物质运输及形态建成具有重要调控作用。TOG结构域是调节微管动力学的几个蛋白质家族的重要功能组分,CLASPs则是植物中特有的一类微管结合蛋白,其表达对于微管的动态调整和功能行使十分重要。为了研究Togaram1基因与棉花纤维发育及纤维品质形成的关系,以陆地棉系9和海岛棉新海16为研究材料,克隆获得GhTogaram1与GbTogaram1基因,并对其进行生物信息学分析,同时,利用qRT-PCR技术分析Togaram1基因在不同材料及不同纤维发育时期的表达模式。结果显示,GhTogaram1与GbTogaram1的CDS序列全长均为918 bp,均编码305个氨基酸,但陆地棉和海岛棉之间存在核苷酸和氨基酸序列差异。生物信息学分析表明,Togaram1蛋白属于亲水性蛋白,具有TOG结构域和CLASP-N端结构域,定位于细胞核中。系统进化树和多序列比对表明,GhTogaram1和海岛棉属于同一分支,相似性为99.34%,与二者关系最近的是黄褐棉。qRT-PCR结果表明,Togaram1基因在2种材料纤维发育不同时期(0,5,25 d)相对表达量具有极显著差异;另外,Togaram1基因在HL群体极端子代中纤维发育5 d和10 d具有极显著差异,其中短纤维株系HL-78表达量最高。综上,Togaram1基因在不同棉花材料开花后5 d纤维中优势表达,表明Togaram1基因可能在棉花纤维伸长期发挥作用。随着开花天数的增加,Togaram1基因表达量下降,推测可能是受油菜素甾醇的影响。对Togaram1基因在棉纤维中进行初步的功能验证,为后续Togaram1基因在棉花纤维发育中的研究奠定了基础。

探究棉花GhERF14基因与尖孢镰刀菌致病力的关系,解析尖孢镰刀菌致病分子机制,初步探究棉花GhERF14基因对枯萎病的响应及对相关抗病基因的调控作用,为培育抗枯萎病的棉花新品种提供一定的理论依据。利用基因克隆、病毒诱导基因沉默(VIGS)构建了GhERF14 基因非保守结构域干扰载体pTRV2-GhERF14,通过实时荧光定量(qRT-PCR)技术和VIGS技术,研究枯萎病菌胁迫和激素处理后,GhERF14和下游与木质素(Lignin)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)相关基因,抗氧化酶基因及病程相关蛋白(PR)基因的表达特征,分析其在棉花抗病过程中的作用,表明抑制GhERF14基因的表达可显著降低茉莉酸、水杨酸以及乙烯合成及信号通路相关基因的表达。利用VIGS 技术将 GhERF14 基因沉默后,棉株对枯萎病菌更敏感,表明GhERF14在尖孢镰刀菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。

捕光叶绿素a/b结合蛋白在植物光合进程及非生物胁迫响应中发挥着重要的作用。为了研究陆地棉GhLhcb2A1基因特征、表达特性以及在低温和干旱响应中的功能,以冀棉262叶片cDNA为模板进行PCR扩增,获得了GhLhcb2A1基因的CDS全长,通过生物信息学分析了基因及其编码蛋白的基本特征,利用qRT-PCR技术检测了基因的组织表达特性以及低温和干旱响应表达模式,采用病毒诱导的基因沉默技术验证了GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中的功能。研究结果表明,GhLhcb2A1基因CDS全长为798 bp,编码265个氨基酸。GhLhcb2A1在叶片中高表达,在低温和干旱处理的叶片和根中显著上调表达,并在低温和干旱处理3 h的叶片中达到最大值,分别是对照叶片中的17.42,30.03倍,在低温处理6 h和干旱处理12 h的根中达到最大值,分别是对照根中的11.65,65.04倍。亚细胞定位结果表明,GhLhcb2A1蛋白在细胞叶绿体中表达。GhLhcb2A1基因沉默植株与对照植株相比,低温和干旱处理造成的植株失水干枯等表型更严重,叶片积累的丙二醛含量显著升高,脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性则显著降低,说明GhLhcb2A1基因沉默植株对低温和干旱胁迫的抵抗力降低。以上研究表明,GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中发挥正调控的作用。

为挖掘枸杞棉蚜对杀虫剂吡虫啉产生抗药性的候选基因,以枸杞棉蚜对吡虫啉的室内抗药性品系和相对敏感性品系为材料,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术获得2个品系的转录组数据,通过NCBI数据库进行基因注释,在转录水平上对2个品系的差异基因GO功能及KEGG代谢途径等生物信息学进行分析,采用qRT-PCR技术检测其中8个候选差异基因(CYP6a2、CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CYP4c1、AChE2、CarE和ALP3)的相对表达情况,并分析了抗药性相关基因的进化关系。经测序及序列拼接,共获得70 101条Unigene(单基因簇),平均长度为654.37 bp,在NR、GO和KEGG数据库中分别注释到29 131,27 861,2 993条Unigene。通过对两品系的差异基因进行NR注释分析,共发现289个差异基因,其中,22个可能与抗药性相关,包括9个解毒酶系基因(CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CYP4c1和ALP3各1个,CYP6a2和CarE各2个),8个表皮蛋白基因(CP)及其前体(Cuticular protein precursor,CPP),1个靶标酶系基因(Alkaline phosphatase,AChE2),2个转录因子基因(WRKY1、LZTFL1,Leucine zipper transcription factor-like protein 1 gene),1个胰脂肪酶相关蛋白2基因(PLRP2)和1个多抗相关蛋白基因(Multidrug resistance-associated protein,MRP)。定量结果表明,差异基因CYP6a2、CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CarE和ALP3在抗药性品系的表达量均显著高于敏感性品系。对抗药性相关重要基因CYP、GST、ALP和CP构建系统进化树,通过分析基因的遗传关系,发现枸杞棉蚜与大豆蚜、豌豆蚜的亲缘关系相对较近。获得了枸杞棉蚜对吡虫啉的抗药性与敏感性品系转录组的整体表达模式,筛选到抗药性相关差异表达基因,发现2个品系中87.50%的候选差异基因在转录水平和mRNA水平的表达量变化一致。

当前,传统育种手段已经不能完全满足棉花市场及生产的需求,可以利用分子生物技术来加快棉花品种的更新,转录因子为棉花基因功能研究和遗传育种提供了重要的帮助。MYB转录因子家族作为最大的转录因子家族之一,在多种植物中存在,并且在植物的生长发育过程中行使着多种功能。MYB转录因子具有很高的研究价值,在模式植物中的功能已经得到较为深入的研究,但在非模式植物,特别是棉花中的研究仍然较为有限,大多集中在陆地棉中。为进一步了解MYB转录因子,对部分植物及棉花中MYB转录因子的相关研究进展进行了综述,主要涵盖了它们的分类依据、结构特点、进化方式以及在响应生物及非生物胁迫、棉花纤维发育和次生代谢等方面的作用,并对目前已知的棉花MYB转录因子的相关功能进行了分析。通过对这些内容的综述,有助于加深我们对棉花MYB转录因子的了解,为后续研究不同棉种中MYB转录因子以及深入研究它们的功能和机制提供了重要的参考。

为探明外源H₂O₂对NaCl胁迫下棉花幼苗的生理调节机制,以棉花品种新陆早48号为供试材料,使用室外盆栽法,设置盐胁迫(NaCl,浓度梯度0,100,200 mmol/L) 和H₂O₂(浓度梯度0,0.005,0.010,0.020,0.050 mmol/L) 两因素随机组合,探究棉花幼苗鲜质量、干质量、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合气体参数、抗氧化酶活性和渗透调节系统的变化规律。结果表明,外源H₂O₂有效缓解盐胁迫对棉花幼苗生长的抑制效应,提高棉花幼苗叶绿素含量、光合气体参数、叶绿素荧光参数,维持棉花幼苗光合作用正常运行,保证了干物质的积累;同时,外源H₂O₂提高抗氧化酶(POD、APX、CAT)活性,加速清除棉花幼苗体内ROS,降低了电解质渗出率、MDA含量及Pro、游离氨基酸、SS等渗透调节物质含量,提高棉苗抗盐性。其中0.020 mmol/L外源H₂O₂对棉花幼苗所受盐胁迫缓解作用最佳。综上,外源H₂O₂通过提高盐胁迫棉花幼苗光合性能,保持棉花幼苗稳定的光合作用,维持棉花幼苗体内ROS产生与消除的动态平衡,从而提高棉花幼苗对盐胁迫的适应性。

研究发现陆地棉ENODL6基因具有抗黄萎病功能。为进一步揭示其在棉花抗黄萎病过程中发挥的作用,通过Nimble Cloning技术将GhENODL6插入酵母表达载体pNC-GBKT7,构建了重组质粒pNC-GBKT7-ENODL6。重组质粒转入酵母菌Y2HGold后可在DDO培养基上正常生长,但不能生长于QDO/X/A培养基,表明GhENODL6蛋白对酵母宿主无毒害作用,没有自激活活性。将携带pNC-GBKT7-ENODL6诱饵载体的Y2HGold酵母菌与cDNA文库进行杂交筛选,结果获得一个能够显示蓝色的菌落。通过PCR扩增,在蓝色酵母菌中获得一段526 bp的非载体插入片段,与陆地棉基因组内基因WRKY47序列高度一致。通过同源扩增,从陆地棉中克隆到WRKY47开放读码框,全长1 587 bp,编码528个氨基酸残基。再次利用酵母双杂交技术确认了WRKY47与GhENODL6之间存在互作关系。综上,构建了重组载体pNC-GBKT7-ENODL6,并鉴定到与GhENODL6互作的蛋白WRKY47。

MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用,而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值,因此,从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列,并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析,通过Gataway BP和LR反应,将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件,最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示,GhMYB42(XP_016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸,预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现,MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域,是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示,陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP_012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显,因此,选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37 ℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37 ℃诱导3 h。Western Blot结果表明,重组蛋白的大小正确,最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白,后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。

为探究盐胁迫对棉花生理机制的影响,以耐盐碱棉花中J0710为对照,对山西农业大学棉花育种课题组培育的2个棉花远缘杂交新种质 HL2、A₂H 幼苗进行为期15 d的盐溶液处理(浓度为200 mmol/L),分析参试材料的相对株高、相对根长及相对成活率,计算盐害指数;并结合不同处理时间(0,5,12,24,48 h)的幼苗原初光能转化效率(Fv/Fm)、抗氧化酶活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量等生理指标的测定结果,对参试材料的耐盐性进行综合评价。结果表明,盐胁迫15 d后,对3个材料幼苗生长的伤害程度由弱到强依次为中J0710<HL2<A₂H,盐胁迫极显著抑制了A₂H 的相对株高、相对根长及相对成活率,说明该盐浓度处理下,对HL2及中J0710的生长发育影响较小,而对A₂H的影响较大。在不同的处理时间下,盐胁迫对3个材料的最大光能转化效率均具有不同程度的影响,相较于胁迫前,抑制程度由弱到强依次为HL2<A₂H<中J0710。相较于未胁迫之前,盐胁迫提高了过氧化物酶(POD)活性;其中,整个胁迫过程中HL2的POD活性显著高于A₂H和耐盐对照中J0710,并且在胁迫12~48 h达到显著水平;超氧化物歧化酶(SOD)活性变化规律不明显,且在盐胁迫过程中发挥作用较低;HL2及耐盐对照中J0710的脯氨酸含量积累量均随着盐胁迫时间的延长而增多,种质HL2的可溶性糖及可溶性蛋白含量在整个盐胁迫期间均显著高于耐盐对照中J0710和A₂H。综上,在盐逆境中,耐盐材料具有较发达的根系;而较高的光能转化效率、细胞内较高的活性氧清除能力以及较高的渗透调节物质的积累是其耐盐性较强的生理基础。

旨在评价陆地棉种质资源的遗传多样性和筛选代表性种质,为科学评价和高效利用陆地棉种质资源提供理论依据。基于367份陆地棉种质的SNP标记及其中353份种质的表型数据分别分析其遗传多样性、构建系统进化树及初级核心种质,并对初级核心种质的构建效果进行评价。结果显示,原始陆地棉群体SNP位点多态性信息含量为0.24,各表型性状的遗传多样性指数均接近或大于2.00,与前人研究结果相近。基于SNP标记可以将供试群体划分为3个类群,构建了73份基因型初级核心种质,初级核心种质的Nei's遗传多样性指数、多态性信息含量等指标数值大于原始种质。基于表型数据可将供试群体划分为3个类群,各性状均值呈第Ⅰ类群最小、第Ⅱ类群居中、第Ⅲ类群最大的趋势。构建了含70份材料的表型初级核心种质,各性状均值较原始种质的差异均不显著,极差、遗传多样性指数与原始种质相近,变异系数均高于原始种质。基于SNP标记构建的初级核心种质和基于表型数据构建的初级核心种质有15份重合,这些种质多为基因型第Ⅱ类群和表型第Ⅱ类群。以上结果表明,陆地棉种质资源基因型遗传多样性较低,但表型变异丰富、遗传多样性较高。本研究构建的基因型和表型初级核心种质遗传多样性代表性较好,可作为典型种质进行保存和利用。

鉴定陆地棉 SKS 基因家族成员,解析其演化规律,为棉花抗性育种提供新的候选基因。基于已公布的陆地棉遗传标准系TM-1基因组数据,以陆地棉品种中棉-14为试验材料。通过生物信息学对陆地棉SKS家族成员进行全基因组鉴定,并对其家族成员的染色体分布、进化关系、基因结构、共线性关系等进行预测分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析GhSKS13的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默技术初步探究陆地棉SKS13在棉花抵御大丽轮枝菌过程中的功能。共鉴定到48个陆地棉SKS基因,不均匀分布于陆地棉19条染色体上,聚类分析分为5个亚组,基因序列具有较高保守性,共线性关系分析显示,陆地棉SKS基因家族受到纯化选择。组织模式表达分析显示,GhSKS13在陆地棉根组织中优势表达,并且受大丽轮枝菌诱导显著上调表达。 GhSKS13沉默植株对大丽轮枝菌抗性减弱,同时抑制病程相关基因GhPR1、GhPR2、GhPR3和GhPR5表达。大丽轮枝菌入侵GhSKS13沉默植株,其过氧化氢(H₂O₂)沉积明显低于对照,暗示GhSKS13促进活性氧(ROS)的形成。总之,明确了陆地棉SKS家族成员的系统进化关系、染色体分布特征和基因结构特征;并阐明了GhSKS13参与棉花对大丽轮枝菌抗性反应。

探讨Mn处理下棉花幼苗根部对Cd胁迫生理响应及Cd累积的影响。以湘C178和湘FZ001为试验材料,研究不同浓度Mn离子处理(0,5,10,50 μmol/L)后,Cd胁迫下棉花幼苗根部超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)、Cd含量、干物质质量及主根长度的变化。10 μmol/L Cd胁迫对棉花根部生长有明显影响,棉花幼苗通过构建物理性屏障和抗氧化防卫机制来减轻Cd对根部细胞的损害,导致SOD活性降低,CAT活性、MDA含量和Pro含量增加。同时,Mn处理会影响棉花幼苗根部对Cd胁迫的生理响应。低浓度Mn处理会导致棉花幼苗根部Cd含量降低,SOD活性和Pro含量提升、CAT活性和MDA含量降低,有效预防Cd胁迫对棉花幼苗根部生长的抑制作用;较高浓度Mn处理会导致棉花幼苗根部Cd含量增加,SOD活性提升、CAT活性和MDA含量提升、Pro含量降低,影响棉花幼苗根部生长。在利用棉花修复Cd污染耕地时可用小于10 μmol/L的Mn离子处理来提高棉花耐Cd幼苗能力,保障棉花植株正常生长。

为探究GhFUL1基因在棉花分枝发育进程中的功能,从棉花中克隆MADS-box家族GhFUL1基因及其启动子,对该基因进行功能研究,并对其启动子进行活性分析。结果表明,棉花中GhFUL1基因开放阅读框726 bp,编码241个氨基酸。进化树分析表明,GhFUL1与其他物种中可可的TcAGL8-1亲缘关系最近。烟草亚细胞定位分析结果表明,GhFUL1定位在细胞核和细胞膜。不同组织材料qRT-PCR分析表明,GhFUL1基因在茎尖中表达量最高。构建过表达载体转化拟南芥,结果表明,转基因拟南芥阳性株系中GhFUL1基因表达量显著增加,转基因株系的开花时间、花器官形态与野生型相比无明显变化,但是开花时侧枝数增加。qRT-PCR结果表明,细胞分裂素氧化/脱氢酶基因AtCTK1和AtCTK6表达量减少,推测GhFUL1基因可能通过调控细胞分裂素合成途径影响分枝。利用启动子分析网站PlantCARE预测可知,GhFUL1启动子区域不仅有TATA-box、CAAT-box核心元件,还有参与光响应、生长素响应以及胁迫应答等顺式作用元件。将GhFUL1启动子构建到表达载体pBI121检测其启动子活性,通过对拟南芥转基因阳性株系进行GUS染色,发现GhFUL1启动子在拟南芥幼苗期的茎尖分生组织和成熟期的花器官中特异性表达。初步揭示GhFUL1基因及其启动子转化拟南芥后在其分枝发育过程中具有一定的功能。

为了研究棉花中AOP2-like(GhAOP2-like)与抗旱耐盐的相关性,根据河北省农林科学院棉花研究所遗传育种研究室前期获得的蛋白质组数据,利用同源克隆法得到了GhAOP2-like的基因序列,用生物信息学方法对GhAOP2-like蛋白的理化性质、结构、亚细胞定位等进行了分析,利用qRT-PCR技术检测了GhAOP2-like的组织特异性表达以及在干旱、盐和激素处理下的表达量变化。结果显示,GhAOP2-like位于D13染色体上,CDS序列长972 bp,编码323个氨基酸。生物信息学分析发现,GhAOP2-like蛋白的分子式为C₁₆₅₄H₂₅₂₅N₄₂₉O₄₇₈S₁₉,理论等电点为5.20,不含信号肽和跨膜结构域,定位于细胞质中。聚类分析结果显示,棉花与其他物种中的AOP序列被明显分成2组,但与木槿中AOP序列关系最近。根据qRT-PCR的结果,发现GhAOP2-like在根、茎、叶和发育中的种子中都表达,但在根中表达量最高,并且在干旱、盐、GA₃、MeJA和ABA处理下上调表达,但在MeJA处理下表达变化最强烈,说明GhAOP2-like可能通过参与茉莉酸信号通路调节根系的生长从而提高陆地棉的抗逆性。

为了探析GhERF105-like在棉花色素腺体发育或棉酚代谢中的功能,利用RT-PCR技术克隆了中棉所12的GhERF105-like基因,并进行了生物信息学分析及表达模式分析。结果显示,GhERF105-like编码区为711 bp,编码236个氨基酸。GhERF105-like蛋白分子质量为26.3 ku,理论等电点pI为 7.72;二级结构预测存在22.88%的α-螺旋、13.14%的延伸链、3.81%的β-转角和60.17%的无规则卷曲。GhERF105-like在第91—155位氨基酸处存在1个AP2结构域,预测有2个苏氨酸、1个酪氨酸和1个丝氨酸磷酸化位点位于AP2结构域内。系统进化分析表明,GhERF105-like及其同源蛋白基序组成在不同物种中保守程度较高,GhERF105-like与黄褐棉、达尔文氏棉、雷蒙德氏棉、海岛棉中同源蛋白的基序组成一致。GhERF105-like在有腺体棉中棉所12各个组织中的表达均显著或极显著高于无腺体棉中棉所12显性无腺体;GhERF105-like在不同有腺体棉品种/系叶片中的表达量不同,且均显著高于显性或隐性无腺体棉品种/系。GhERF105-like受ABA、BR诱导显著上调表达,但在MeJA、Eth、NaCl和PEG处理下显著或极显著下调表达。综上所述,GhERF105-like与棉花色素腺体发育密切相关,可能通过ABA、BR、Eth和JA通路调控腺体发育或棉酚代谢。

为分析陆地棉一个低毒Bt基因转化事件的特点,采用特异引物对该Bt基因进行鉴定。结果表明,该Bt基因片段大小拟合美国 Bt 抗虫基因设计引物的特征片段长度 310 bp,显示该种质系所含的Bt基因为美国抗虫基因。利用该种质系与海岛棉胜利1号配置杂交组合,其杂交F₁中Bt基因呈显性表达,分离F₂群体中有Bt、无Bt基因个体数拟合3∶1的理论分离比例,结果显示,该Bt基因是受1对显性基因控制的质量性状,即该外源基因以单位点方式插入陆地棉受体。而后采用海陆杂交F₂群体,以SSR分子标记对低毒Bt基因进行染色体定位,结果显示,它位于棉花第10号染色体上,共有14对引物与目的基因相连锁,分别是SSR标记NAU5166、NAU3574、NAU456、BNL256、cgr6745、cgr5406、cgr6546、NAU7110、HAU3201、BNL1665、dPL0468、NAU5316、BNL2960、NAU3122。Bt基因位于分子标记NAU7110和HAU3201之间,其遗传距离分别为0.9,4.4 cM。

为了探究陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1在棉花黄萎病反应中的生物学功能,为棉花黄萎病抗性基因挖掘及抗病育种奠定基础,通过转录组筛选,克隆获得一个细胞色素P450基因GhP450-94C1,利用生物信息学的方法分析该基因的理化性质,通过荧光定量PCR技术分析GhP450-94C1在黄萎病侵染下的表达模式,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步探究其在棉花抗黄萎病反应中的生物学功能。结果表明,克隆获得一个陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1,其开放阅读框(ORF)为1 503 bp,编码一个含500个氨基酸的酸性、亲水、不稳定的跨膜蛋白,分子式为C₂₅₉₇H₄₀₂₅N₆₉₁O₇₂₅S₂₂,分子质量为57.23 ku,定位于内质网膜,含有一个P450结构域;有86.45%的概率存在信号肽;二级结构预测显示,该蛋白含有24个α-螺旋和8个β-折叠;该基因响应黄萎病菌侵染,抑制其表达后植株对黄萎病菌的敏感性增强。初步证明GhP450-94C1是棉花黄萎病抗性反应的一个正向调控因子。

鉴定抗病基因并培育抗病棉花品种是目前根治棉花黄萎病的最好方法。利用MEGA 5.2等相关软件,构建棉花抗病相关基因WRKY7与拟南芥和水稻中抗病相关WRKY基因编码蛋白系统进化树。通过亚细胞定位技术、病毒诱导基因沉默技术、qPCR及GUS报告系统分析等技术,阐明GhWRKY7基因对大丽轮枝菌的诱导响应及其机制。结果表明:GhWRKY7和AtWKRY7高度同源,同属于Ⅱ类;GhWRKY7定位于植物细胞核内,其在棉花叶和根器官中的相对表达量显著高于茎;GhWRKY7基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导,在浸染24 h后呈显著上调。沉默GhWRKY7基因棉花对大丽轮枝菌抗性下降;和对照植株(表达TRV空载体植株)相比,接菌后沉默植株中GhPR1、GhPR3、GhPR4、GhPR5、GhPDF1.2、GhPAL1和GhCYP71B36等抗病相关基因的表达水平也显著下调,暗示GhWRKY7通过调控抗病相关基因的表达来提高植株的抗病性。构建GUS报告载体在烟草细胞中瞬时表达分析,揭示GhWRKY7基因能特异地结合GhCYP71B36启动子顺式元件,转录激活下游GhCYP71B36表达,从而提高棉花的抗病性。综上所述,GhWRKY7作为一个正调控棉花抗黄萎病的转录因子,参与如植保素Camalexin合成等下游抗病相关基因的表达,从而提高植株的抗病性。因此,GhWRKY7可以作为棉花抗病育种的候选基因,为棉花生产提供安全保障。

为了进行苗期转ScALDH21基因棉花的耐盐性鉴定。以新农棉1号的T₄转ScALDH21基因棉花株系为研究材料,分别在大田条盆及温室盆栽条件下进行试验。大田条盆试验中,分别统计0.4%,0.5%,0.6%盐土栽种下转ScALDH21基因与受体棉花的叶绿素含量和存活率,并测定其净光合速率、气孔导度、蒸腾速率及瞬时水分利用效率;室内盆栽试验中,分别统计NaCl(150 mmol/L)和清水处理下不同棉花株系MDA、POD、木质素、Na⁺、K⁺及Na⁺/K⁺值。结果表明,在盐胁迫条件下,与受体棉植株相比,转ScALDH21基因棉株的存活率上升,叶绿体含量增加,净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及瞬时水分利用效率均提高;MDA含量降低,POD活性上升,木质素含量增加。从形态及生理指标层面验证了转ScALDH21基因棉花在苗期提高了植株的耐盐性。

海岛棉纤维品质优良,并具有抗逆性强、抗黄萎病等优点。将海岛棉的优异基因用于陆地棉的遗传改良,实现海陆棉遗传重组,一直是棉花种质资源创新和利用研究的重要课题之一。本研究对海陆棉基因组水平上的常规遗传重组杂交技术、外源海岛棉DNA导入的基因枪法和花粉管通道法、利用染色体水平上的置换系技术的方法、特点和应用进行了综述。回顾了在应对种间遗传障碍时,遗传学家及育种家进行的多种遗传重组技术策略上的尝试。通过育种家们建立的携带有海岛棉染色体基因的陆地棉背景的染色体置换系,可望筛选出能被育种家直接利用的、稳定的、综合性状好的、或具有优异特性的种质材料,以期对今后海陆棉优异种质创制和利用研究起到促进作用,进而加快棉花育种进程。

合理减氮运筹是解决我国农田氮素损失量大、利用率低等问题的重要途径。为明确减少氮肥投入是否能维持油后密植棉花的产量。以洞庭湖区油后直播棉田为研究对象,比较2 a氮肥减量深施下棉花的产量、主茎叶光合特性、氮肥利用率等差异特征,分析氮肥减量深施的可行性,为油后直播棉田施肥管理措施的制定提供科学依据。于2018-2019年,在湖南省常德市湖南省棉花科学研究所茅湾基地开展了氮肥减量深施试验,设置了5个氮肥施用量处理(0,90,180,270,360 kg/hm²)和2个施肥深度处理(5,15 cm),于棉花主要生长时期取样测定了主茎功能叶净光合速率、可溶性糖及淀粉含量、地上部分植株生物量以及各部分NPK含量,研究氮肥减量深施处理对油后密植棉花的产量、光合特性、地上部分植株生物量、NPK积累与分配规律的影响。结果表明,随施氮量的增加,棉花中后期主茎功能叶净光合速率、可溶性糖和淀粉含量、以及棉株NPK累积量均呈先升后降的变化趋势,均在270 kg/hm²时最高;而氮肥表观利用率、农学利用率、偏生产力与生产效率则相反;另外,相同施氮量条件下,深施15 cm处理的各项指标均高于浅施5 cm处理。合理减少氮肥用量,并配合深施处理利于棉株营养器官和生殖器官生物量积累与平衡,以及氮、磷、钾吸收和分配,以促进产量与品质的提高。基于油后密植模式,推荐棉花以施氮量180~224 kg/hm²,施肥深度15 cm为宜。

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提高15%和11%左右,而拟南芥CRE1功能缺失型突变体萌发势降低15%左右。 该研究揭示,GhCRE1基因过表达能显著提高拟南芥萌发速度。

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。

为探究滨海盐渍棉田施用微生物菌肥的降盐效果及棉花长势响应，选择黄河三角洲滨海轻度、中度盐渍棉田，布设不同种类生物产品、不同用量微生物菌肥的棉花田间试验，采集土壤盐分、棉花株高、SPAD值、冠层NDVI等数据，以各处理间的对比分析及方差分析方法，系统分析微生物菌肥对盐渍棉田的降盐效果及其棉花的长势响应。结果表明：不同种类的生物产品处理均有一定降盐效果，表层和下层、根际和垄间含盐量均有所下降。轻度盐渍棉田土壤含盐量降幅7.03%~35.06%，株高增幅9.76%~15.40%，SPAD值增幅12.97%~22.64%，NDVI值增幅12.58%~19.85%，微生物菌肥处理效果最佳；中度盐渍化棉田土壤含盐量降幅6.18%~31.85%，株高增幅10.02%~17.12%，SPAD值增幅13.67%~15.55%，NDVI值增幅9.22%~18.69%，微生物菌肥的降盐效果最为明显。综合看，施用微生物菌肥的降盐和长势促进效果，优于有机物+有益微生物处理，优于商品有机肥处理，微生物菌肥的推荐施用量1 500 kg/hm²。本研究证明滨海盐渍棉田施用微生物菌肥有明显降盐效果，并对棉花的长势有积极促进作用，研究结果为滨海盐渍农田生物改良提供了参考。

为探讨水分和种植密度对棉花氮素利用效率的影响，于2019－2020年河北农业大学清苑试验站进行大田试验，以农大棉601为试验材料，采取两因素裂区设计，主区为水分处理：W1（土壤相对含水量60%～70%）和W2（土壤相对含水量40%～50%），副区为种植密度：D6（6万株/hm²）、D9（9万株/hm²）和D12（12万株/hm²），对不同水分和种植密度下棉株各器官氮素积累分配及产量进行测定。结果表明：不同水分处理下，D12植株氮素总积累量和生殖器官氮素积累量最高，年际间趋势一致，与W2相比，W1生殖器官氮素积累量和氮素积累总量显著升高，但不同水分处理间生殖器官氮素分配比例无显著差异。随种植密度增加，籽棉产量随之升高，同一密度处理下，2019年W2籽棉产量相较于W1降低了13.74%，2020年W2籽棉产量仅降低了2.54%。通过相关性分析得出，棉株氮素积累分配与棉花籽棉产量和单位面积铃数呈显著正相关。因此表明，减少灌水量配合适当增加种植密度（9～12万株/hm²）是当地节水高产及提高棉花氮素吸收量的有效途径。

为了解析棉花种子质量突变体ims-15千粒质量降低的相关机制，以该突变体和其近等基因系Ji737系为试验材料，利用Illumina平台测定了开花后30 d种胚的转录组，并利用实时荧光定量PCR技术对测序结果进行验证。共筛选获得4 239个差异表达基因，其中，在ims-15中上调表达基因2 229个（52.6%），下调表达基因2 010个（47.4%）。GO功能富集分析表明，差异表达基因显著富集在生物过程中的细胞壁高分子代谢、光合作用-光能捕获、细胞壁高分子代谢、光合作用等7个条目，分子功能中的叶绿素结合、四吡咯结合、铁离子结合等4个条目和细胞组分中的光系统、类囊体、光合膜等9个条目，其中光合作用相关条目注释到的差异基因中下调基因占比达85.11%，且光能捕获、叶绿素结合和光系统Ⅰ等3个条目注释到的差异基因均为下调基因。KEGG富集分析表明，光合作用-天线蛋白、类黄酮生物合成、植物激素信号转导、苯丙素的生物合成、MAPK信号途径、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢等20个代谢通路显著富集，其中光合作用-天线蛋白通路的富集程度最高且该通路注释到的18个差异表达基因均在ims-15中下调表达，植物激素信号转导通路中富集到的差异基因最多。此外，发现有大量转录因子如WRKY、Dof和AP2/EREBP等家族成员影响种子粒质量的形成。qRT-PCR和RNA-seq数据相关系数R²=0.955 9，验证了RNA-seq结果的可靠性。基于各项分析结果，明确了一些与种子质量发育密切相关的代谢途径，尤其胚性光合作用途径在种子质量形成中起重要作用；发现了植物激素信号转导途径和转录因子在种子质量形成中起着重要调控作用。

为了深入分析棉花产量相关性状的分子遗传机制，挖掘有效的分子标记和基因，以高产稳产品种冀丰914为母本、优质自交系冀丰817为父本，构建F₂、F₃群体，结合高密度SNP遗传图谱，对单铃质量（BW）、衣分（LP）、子指（SI）和果枝数（FBN）4个性状进行QTL定位及候选基因筛选。结果发现，冀丰914的4个性状均大于冀丰817，子代的4个性状呈正态分布。子指与单铃质量呈极显著正相关，与衣分呈极显著负相关。共定位到50个产量相关的QTL位点，分布于22条染色体，包括8个BW相关QTL、20个LP相关QTL、15个SI相关QTL和7个FBN相关QTL，单个位点最大贡献率（PVE）为12.96%，qBW-A11-1和qLP-A6-1能够在2个世代中重复定位到（稳定QTL）。在主效（PVE≥10%）或稳定QTL位点内注释到41个基因，主要参与植物细胞壁形成、纤维素生物合成过程等途径；根据转录组信息，编码肉桂酰辅酶A还原酶2类蛋白的Ghir_D03G005440.1基因在TM-1中的表达量高于Hai 7124，该基因位于主效QTL qSI-D3-1内，可能参与棉花子指性状的调控。为进一步探索棉花高稳产性状的分子遗传机制提供更多基础。

为研究陆地棉早熟性、产量、纤维品质之间相互影响的分子遗传基础，以中棉所36为母本、G2005为父本构建重组自交系群体，连续6 a调查群体早熟性、产量、纤维品质相关的13个性状，分析3类性状之间的相关性，并结合QTL定位结果分析其遗传基础。结果表明，早熟性较好的材料，其铃重较低、纤维品质相对较差；纤维品质较好的材料，其产量性状相对较差；共检测到494个QTL位点，发现68个QTL重叠区段至少影响两类性状，包括11个同时影响早熟性、产量和纤维品质性状的区段，11个同时影响早熟性和产量性状的区段，39个同时影响早熟性和品质性状的区段，7个同时影响产量和纤维品质性状的区段，仅有24个区段内QTL增效基因来源相同。此外，共检测到99个多环境上位性QTL，其中45个位点与加性QTL重叠。

探究调环酸钙对棉花的调控效果和增产潜力，为新疆棉区高产栽培提供科学依据。于2019年在新疆呼图壁县大丰镇和沙湾县四道河子镇进行，采用随机区组试验设计，以缩节胺为对照（CK），设置4个调环酸钙处理剂量：T1（750 g/hm²）、T2（1 350 g/hm²）、T3（1 950 g/hm²）、T4（2 550 g/hm²），于现蕾期、初花期、打顶前和打顶后分剂量喷施。调查棉花干物质积累量、农艺性状和产量及品质等指标。喷施调环酸钙后主茎日增长量随时间先增加后降低，在施药2次后（初花期）达到峰值，调环酸钙对株高的调控效果具有一定剂量效应，随剂量的增加先增强后减弱，在T3水平下抑制效果最显著，吐絮期在两试验点棉花株高较对照增加3.35%，7.15%。同时调环酸钙提高了棉花地上部生物量积累，T3生殖器官生物量在两试验点分别较对照提高35.07%，34.35%；调环酸钙处理叶枝较对照长3.89~14.34 cm，第一果枝长度较对照增加4.83~10.16 cm，第四果枝的长度增加3.34~12.34 cm；相比对照，调环酸钙处理棉花单株结铃数提高4.90%~23.04%，籽棉产量增加226.14~907.87 kg/hm²，两试验点均以T3产量最高，皮棉产量为2 885.66，2 879.53 kg/hm²，同时调环酸钙具有优化纤维品质的作用。全生育期喷施1 950 g/hm²的5%调环酸钙能显著控制棉花株高，塑造高产株型，有效协调营养生长与生殖生长的关系，显著提高棉花产量，改善纤维品质。

为探讨化学封顶后棉株内源激素变化规律与果枝及结铃空间分布的关系。选用新陆早45号为试验材料，设置化学封顶（C）及2个对照组：不打顶（CK）和人工打顶（M），采用酶联免疫吸附法测定打顶后棉花倒四叶4种激素含量的昼夜变化。化学封顶后IAA含量较不打顶和人工打顶有明显的迅速下降趋势，并在168 h后仍保持较低水平；化学封顶后棉花GA₃含量与不打顶接近，这为棉花“二次生长”提供了一定的理论依据；化学封顶后棉花CTK上升速度较不打顶和人工打顶慢，但其峰值最大，并在168 h后仍维持较高水平；化学封顶后ABA含量一直维持较高水平直至试验结束；试验中各项指标峰值及底峰值均出现在化学封顶处理中。化学封顶能显著改变棉花倒四叶内源激素含量，同时化学封顶能有效控制棉株果枝长度，使结铃主要分布在中部和下部果枝，在顶部结铃上相较人工打顶有明显优势。

为了挖掘陆地棉黄萎病菌侵染应答相关基因，揭示陆地棉应对黄萎病菌侵染的应急响应机制。以抗黄萎病品种冀2658为材料，用大丽轮枝菌Vd991侵染1 h的棉花根部为样品，以水处理做对照，利用同位素标记相对和绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技术进行蛋白质组研究。结果共筛选到46个差异表达蛋白质，37个上调表达，9个下调表达。对差异蛋白进行基因本体（Gene ontology，GO）注释分析，发现差异蛋白的功能分为24类，分子功能占7类，生物过程占8类，细胞组分占9类。KEGG Pathway分析发现，差异表达蛋白参与32个代谢通路，其中苯丙氨酸代谢P值（0.025 308 8）最小，达到显著水平。通过分析差异表达蛋白的功能，发现在黄萎病菌胁迫早期（1 h），能量代谢相关蛋白、组织结构代谢相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白、抗氧化物酶类、核苷二磷酸激酶等参与到棉花抵抗黄萎病的过程。并且，细胞色素C（Cyt-c）的释放说明棉花根部启动程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）来抑制黄萎病菌的传播。

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中，在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探讨棉花MYB转录因子的功能，采用同源克隆技术，在棉花叶片组织中克隆GhMYBPA1基因，并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明，从中棉35中成功克隆得到1个新的MYB转录因子基因GhMYBPA1（基因登录位点为XM_016869420），cDNA全长为825 bp，开放阅读框630 bp，编码210个氨基酸；生物信息学分析结果表明，GhMYBPA1蛋白分子质量为20.183 ku，N端含有2个MYB的DNA保守结合域，属于R2R3-MYB型转录因子；氨基酸同源分析发现，GhMYBPA1蛋白与来自亚洲棉GaMYB12-like同源性较高；qRT-PCR分析结果表明，GhMYBPA1在棉花根、茎、叶、花中均有表达，花中相对表达量最高，其次是叶；逆境胁迫分析表明，在受到高盐、低温和干旱处理诱导时，GhMYBPA1基因的表达量均发生了变化，推测GhMYBPA1可能在棉花非生物胁迫过程中起重要的调控作用。研究结果可为进一步开展GhMYBPA1基因功能研究奠定理论基础。

为探索棉花GhMADS43基因在茎尖和花分生组织发育过程中的机理，从棉花中克隆了MADS-box家族中GhMADS43基因，并对该基因进行表达分析和酵母自激活分析，以期利用酵母双杂交筛选GhMADS43的互作蛋白质。对棉花中GhMADS43基因进行克隆及组织特异性表达分析，结果显示，GhMADS43基因全长696 bp，编码231个氨基酸，与其他植物中编码FUL蛋白的基因亲缘关系相近。由特异性表达分析可得，GhMADS43基因在根和顶芽中表达量较高；对2种不同果枝材料进行不同顶芽发育时期的表达分析表明，该基因在无限果枝材料中棉所50五叶期和六叶期的表达量显著高于一式果枝材料早铃1号。将该基因构建到酵母诱饵载体pGBKT7，得到pGBKT7-GhMADS43诱饵表达载体。重组质粒转化酵母Y2HGold菌株后，在SD/-Trp平板上生长良好，表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落变蓝。利用不同浓度的3-AT对其进行筛选发现，该基因不能在三缺培养基SD/-Trp/-His/-Ade中生长，表明该基因不具有自激活活性。构建好诱饵表达载体后，可进一步从棉花酵母双杂交cDNA文库中筛选GhMADS43的互作蛋白质，为将来研究该基因在茎尖和花分生组织发育过程中的功能和调控通路提供基础。

丙酮酸脱氢酶磷酸酶GhPDP与棉花雄性不育能量调控方面密切相关。为了得到大量有活性的GhPDP蛋白，试验将对目的蛋白原核表达条件进行优化。将编码GhPDP基因的cDNA序列插入pET-22b中构建重组表达载体pET-22b-GhPDP，转化到大肠杆菌Transetta（DE3）进行IPTG诱导表达，通过单因素试验和正交试验对诱导温度、诱导时间、IPTG终浓度和OD₆₀₀进行优化，利用SDS-PAGE和GeneTools凝胶分析软件分析目的蛋白的表达量，以摸索目的蛋白可溶性表达的最佳条件。结果显示，成功构建重组表达载体pET-22b-GhPDP；目的蛋白在Transetta（DE3）菌株中表达，表达形式多为包涵体；单因素试验结果表明，在诱导温度20℃、诱导时间为5 h、IPTG终浓度0.10 mmol/L和菌体密度OD₆₀₀为0.8条件下，目的蛋白可溶性表达量最高；通过正交分析得出，影响目的蛋白可溶性表达的因素强度由高到低依次为诱导温度、IPTG终浓度、诱导时间及菌体密度OD₆₀₀。综合单因素试验和正交试验结果，确定诱导的最佳条件：菌体密度OD₆₀₀为0.8、诱导温度为20℃、诱导时间为5 h、IPTG终浓度为0.10 mmol/L。

PP2C是一大类重要的蛋白磷酸酶，广泛参与不同的逆境胁迫响应。为了解PP2C基因在干旱响应中的功能，以亚洲棉石系亚1号为材料，利用RT-PCR方法从中克隆了GaPP2C24基因，并对该基因进行了生物信息学分析，荧光定量PCR研究了其在亚洲棉不同组织和干旱胁迫下的表达情况。结果表明，GaPP2C24基因CDS序列全长为1 251 bp，编码416个氨基酸。序列同源比对发现，GaPP2C24与其他植物的PP2C氨基酸序列有较高的相似性，其中与可可树（EOY33930.1）、黄麻（OMO91132.1）的相似性分别为85%，84%。进化分析表明，GaPP2C24与同属锦葵目的黄麻聚在一支，亲缘关系最近，与可可树的亲缘关系次之。实时荧光定量PCR结果表明，GaPP2C24基因在子叶、下胚轴、胚根、叶、茎和根均有表达，且在茎中的表达量最高，根中次之。GaPP2C24受干旱胁迫的诱导表达，其在根和叶片中的相对表达量在处理1 h后最高，分别达到对照的53.9，6.9倍，推测该基因在棉花干旱响应中有重要作用。

为了探究GhNAC201在棉花色素腺体发育中的作用，应用RT-PCR的方法克隆了有腺体棉花中棉所12中GhNAC201基因的编码区序列，并进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR对有腺体和无腺体棉花材料不同生育时期、不同组织部位和不同激素处理下GhNAC201基因的表达情况进行分析。结果显示， GhNAC201编码区为948 bp，编码315个氨基酸。GhNAC201蛋白分子量为36.8 ku，理论pI 5.97，二级结构预测存在27.94%的α-螺旋、5.40%的β-转角、18.10%的延伸链和48.57%的无规则卷曲。三维结构预测表明，GhNAC201的26-190氨基酸与水稻胁迫应答NAC1蛋白序列高度匹配，模型维度为X：55.229Å，Y：36.150Å，Z：46.112Å。GhNAC201在30-163氨基酸处存在1个NAM结构域，预测有5个苏氨酸、6个丝氨酸和4个酪氨酸磷酸化位点位于NAM结构域内。亚细胞定位预测GhNAC201可能位于分泌通路或除线粒体、叶绿体之外的其他亚细胞结构。不同物种中GhNAC201同源蛋白序列的相似性较高，存在5个高度保守的基序。GhNAC201与亚洲棉、雷蒙德氏棉中的同源蛋白的基序组成模式完全一致。GhNAC201基因在中棉所12各组织部位的表达量均极显著高于显性和隐性无腺体棉，且受ABA、BR、GA和MeJA诱导极显著上调表达，基因的时空表达模式与腺体密度的时空分布规律也趋于一致。综上所述， GhNAC201与棉花色素腺体发育密切相关，可能通过ABA、BR、GA和JA通路调控腺体发育或棉酚代谢。

棉花中miRNA的数量仍较少，miRNA在棉花早熟发育中的作用有待证明和揭示。为丰富棉花中miRNA的数量，同时，为揭示miRNA在早熟棉发育中的作用，以早熟棉花品种石早1和中熟棉花品种冀棉958为材料，利用高通量测序技术构建了2个小RNA文库，鉴定新的miRNA，比较早熟棉花和中熟棉花中miRNA表达的差异、特点。结果共鉴定到131个miRNA，包括41个不同家族的64个已知miRNA和67个新的miRNA；新miRNA中，54个miRNA属于已知miRNA家族，13个miRNA属于新的miRNA家族。比较2个品种中miRNA表达的差异，共发现39个miRNA在2个品种中的表达差异超过2倍，占总miRNA数的29.8%，主要为中低量表达的miRNA。15个高表达miRNA中，只有miR398家族的ghr_21在2个品种中的表达差异超过2倍（达到3.4倍）；比较相同家族的不同miRNA在两品种中的表达差异，发现相同家族的miRNA在2个品种中表达差异可以不同，推测有不同的生物学功能。揭示了miRNA在早熟棉发育过程中，对其早熟性具有重要作用，为进一步研究miRNA在棉花早熟性调控中的作用提供依据。

种质资源是遗传育种研究的基础，分析种质资源的遗传多样性，可为亲本选配提供一定的理论依据。通过对500份棉花种质资源材料的11个表型性状，进行遗传多样性、相关性、主成分和聚类分析，结果表明，11个性状的平均变异系数为9.69%，有6个性状的变异系数超过了10.0%，其中结铃数的变异系数最大为20.14%，纤维整齐度的变异系数最小为1.81%；各性状的遗传多样性指数为1.71~2.06，结铃数的遗传多样性指数最高，生育期的遗传多样性指数最低；相关性分析表明，各性状间存在着不同的相互关联，纤维长度与纤维整齐度、断裂比强度、生育期呈极显著正相关，与马克隆值极显著负相关，断裂比强度与马克隆值、生育期呈极显著正相关，衣分与纤维长度、纤维整齐度、马克隆值呈极显著正相关，与子指呈极显著负相关，铃质量与衣分、纤维长度、纤维整齐度、生育期呈极显著正相关；主成分分析提取到了5个主成分，累积贡献率为73.677%，第1主成分与纤维长度、断裂比强度、纤维整齐度有关，第2主成分主要和衣分有关，第3主成分主要与马克隆值有关，第4主成分主要与果枝数有关，第5主成分主要与铃质量有关；聚类分析将500份棉花种质材料在遗传距离1.33处分成了4大类，第Ⅰ类群包含1份材料，属于株高高、铃质量大、衣分低、子指高的材料；第Ⅱ类群包含73份材料，属于结铃数少，衣分偏低，纤维品质较差的棉花材料，第Ⅲ类群包含122份棉花材料，属于铃质量、衣分、纤维长度、纤维强度最好的棉花材料，第Ⅳ类群包含304份棉花材料，属于铃数、铃质量、衣分、纤维长度、纤维强度适中的棉花材料；提取了50份棉花资源材料构建了核心种质库，核心种质库与原始群体相比各性状的变异系数、方差更高，表明核心种质具有更好的异质性，更大的变异。核心种质库用最少的资源数目保留了种质资源的遗传信息，不仅减少了种质保存的工作量，也更有利于育种亲本的选配。

为探讨夏（麦/油后）直播棉适宜的氮肥用量，2018年在湖北省3个主产棉区5个试验点进行施氮量分别为120，150，180，210，240 kg/hm²的一年多点试验，在固定磷肥和钾肥及夏直播模式下研究见花一次施肥技术的氮肥用量对棉花产量和品质及田间表现的影响。结果表明：皮棉产量随施氮量增加呈先增后减的趋势，氮肥用量为150 kg/hm²的处理皮棉产量最高（1 498 kg/hm²），但是5个处理间没有显著差异，该模式在本试验设置的施氮水平范围内可获得最佳产量及比较稳定的产量；纤维品质在5个不同氮肥处理间没有表现出显著差异，此模式下施氮量对棉花品质没有产生影响；棉花生育特性及田间长相在5个不同氮肥施用量处理间也没有显著差异，该模式下一次施氮量的5个处理对棉花生育进程及长势没有产生影响。因此，湖北棉区夏直播模式条件下，见花一次施氮量在120~240 kg/hm² 可实现棉花稳长，并获得稳定的产量和品质。为提高植棉效益，从“减投不减产”植棉策略出发，夏直播棉一次施氮量不超过150 kg/hm² 是可行的。

LEA基因以基因家族的形式在高等植物中广泛存在，在植物生长发育及逆境胁迫应答的过程中发挥重要的作用。为深入研究棉花LEA基因的作用和功能，利用RT-PCR的方法，从棉花纤维均一化cDNA文库中分离得到2个LEA家族基因，分别命名为GhLEA和GhLEAG1（登录号分别为KF906314和KF906316）。GhLEA全长948 bp，编码315个氨基酸，等电点4.4，分子质量为35 ku，GhLEAG1全长756 bp，编码251个氨基酸，等电点10.76，分子质量为27 ku。系统进化树表明，GhLEA属于LEA2亚家族，GhLEAG1属于LEA3亚家族，2个基因的保守基序组成有明显的差异。荧光实时定量PCR表明，GhLEA和GhLEAG1均在棉花纤维20DPA表达量最高，GhLEA在棉花根中表达量最高，而GhLEAG1在茎中的表达量最高。在高盐和PEG处理条件下，2个基因的表达模式差异明显，此外，2个基因还受到脱落酸（ABA）的诱导表达，基因表达量均呈现先升高后降低的趋势，推测2个基因均参与了棉花高盐、PEG等非生物胁迫应答。本研究可为进一步研究LEA蛋白在棉花中的功能提供理论依据。

为了挖掘外源硅（Si）在盐分逆境胁迫应答中的作用，探讨外源Si对盐分逆境胁迫响应机制，以棉花品种新陆早45号为供试材料，分别对其实施不同程度的盐分逆境处理（盐分（NaCl）、硅（Si）2因素随机组合，分别为盐分（NaCl：0，100，200 mmol/L）、硅（K₂SiO₃：0，262.3 mg/L），总计6个处理），研究施用外源Si后，棉花幼苗生长、渗透调节系统、活性氧、丙二醛（MDA）含量和电解质渗出率的变化，探讨外源Si缓解盐分逆境胁迫对棉花幼苗各测量指标的抑制效应及其机制。结果发现：与对照（CK）相比，随着NaCl浓度的增加，棉花幼苗叶片鲜质量、叶片干质量、茎鲜质量、茎干质量、根干质量、根冠比、根系活力、苹果酸和柠檬酸均呈下降趋势；游离脯氨酸（Pro）、过氧化氢（H₂O₂）、丙二醛（MDA）含量、电解质渗出率和氧自由基（O₂^·）产生速率均呈上升趋势；可溶性糖（SS）和游离氨基酸含量呈先上升后下降的趋势。相同浓度盐分处理施加外源硅后，棉苗生物量及渗透调节物质含量明显增加，氧自由基产生速率、电解质渗出率、过氧化氢和丙二醛含量明显减少。综合分析表明，盐胁迫对棉花幼苗生长有抑制作用，且随盐浓度的增加，其生长受抑制和渗透胁迫程度加剧，外源硅通过提高棉花幼苗渗透调节物质积累量并降低活性氧积累，缓解盐胁迫对棉花幼苗生长的抑制作用，提高棉花幼苗抗盐性。

为了防治棉花黄萎病对棉花生产的危害，利用抗病基因培育抗病品种是最经济有效的方法。从陆地棉中克隆了1个WRKY转录因子基因，命名为GhWRKY48；其编码序列全长为882 bp，编码293个氨基酸残基，预测分子质量和等电点分别为32.68 ku和6.10。qPCR组织特异性表达分析结果表明，GhWRKY48在根、茎和叶中均表达，而在茎中为优势表达；同时GhWRKY48表达受到大丽轮枝菌、茉莉酸和水杨酸的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术获得GhWRKY48基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析，结果显示，沉默植株的病株率和病指均低于对照植株，表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。综上所述，GhWRKY48是一个负调控转录因子，抑制下游抗病基因的表达，从而参与棉花对大丽轮枝菌的抗性；因此，GhWRKY48基因可以作为一个理想的候选基因用于棉花的抗病育种。

为解析棉花中磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1b基因对胁迫的响应及生理功能，从棉花中克隆了磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1b基因，并对该基因进行表达分析和蛋白质互作研究。利用启动子分析软件PlantCARE预测得出，GhTFL1b启动子区域有茉莉酸响应元件、脱落酸响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和光周期响应元件等。对GhTFL1b进行组织特异性表达分析，发现该基因在花中表达量最高，其次是根和顶芽，其他组织中表达量极低。进一步比较栽培种和半野生种不同时期的表达，发现无明显差异。激素和胁迫处理研究表明，GhTFL1b基因受水杨酸（Salicylic acid，SA）诱导低调表达，而受盐胁迫处理后高调表达。酵母双杂交验证GhFD与GhTFL1亚组蛋白互作，结果表明GhFD蛋白只能与GhTFL1b互作，而不与GhTFL1a、GhTFL1b、GhTFL1c互作。GhTFL1b基因不参与光周期调控通路，可能参与植物逆境胁迫水杨酸和盐胁迫响应的调控。

为了探讨棉秆炭施用方式对干旱区灰漠土棉田产生的影响。通过大田试验随机区组设计，解析棉秆炭施用方式（每年施棉秆炭NPKC、常氮+1.5棉秆炭NPKBc1.5、低氮+1.5棉秆炭N低PKBc1.5、常氮+3.0棉秆炭NPKBc3.0、低氮+3.0棉秆炭N_低PKBc3.0）对灰漠土棉花形态及土壤理化性质的影响。结果表明，与CK相比，NPKBc1.5棉花单株叶面积显著增加，花蕾花铃数提高45.67%。分别增加施氮量和棉秆炭的效果不同，单独有限度增加棉秆炭22.5 t/hm²，单株叶面积显著增加24.27%；增加施氮量，单株叶面积增加不显著。正常施氮，棉秆炭从22.5 t/hm²增加到45.0 t/hm²，根冠比增加13.3%，叶面积减小11.84%；减少施氮量但增加棉秆炭施用量，花蕾花铃数显著增加（P<0.05），土壤结构和理化性质得到改善，相较CK，施用45.0 t/hm²棉秆炭，土壤pH值降到7.09，降低1.16%；分别在N_低PKBc1.5和NPKBc1.5基础上各增加1倍的棉秆炭，自然含水量分别增加1.7，0.3百分点，田间持水量分别增加3.5，2.4百分点，饱和含水量分别增加6.2，1.6百分点；施入≥45.0 t/hm²棉秆炭，土壤有机碳含量达到试验最大值17.23 g/kg，相比对照增加79.72%。花蕾花铃数和单株叶面积受到有机碳和容重的影响较大，但未达到显著影响（P>0.05），有机碳对二者具有促进作用，而容重表现出抑制效应。含水量对于花蕾花铃数有一定积极影响。因此说明，灰漠土增施适量棉秆炭可弥补氮的不足，改善土壤理化性质。

为探讨低温胁迫下不同棉花品种萌发差异成因，以强耐低温萌发品种鲁棉研37号、鲁棉研36号和低温萌发敏感品种斯字棉2B、斯字棉5A为材料，研究了不同低温下不同萌发时期的生理指标与基因表达的差异。结果显示，12℃胁迫36 h，低温萌发敏感品种MDA含量急剧上升，至胁迫48 h，低温萌发敏感品种斯字棉2B、斯字棉5A比鲁棉研37号MDA含量分别提高了48.17%，50.65%，因此，12℃胁迫36 h MDA含量的变化可以作为耐低温萌发的选择指标；SOD、POD活性在各种处理水平下鲁棉研37号、鲁棉研36号均保持较高水平；CAT活性在低温的刺激下，强耐低温萌发品种逐渐超越低温萌发敏感品种；游离脯氨酸含量在12℃胁迫48 h时，鲁棉研37号与斯字棉2B、斯字棉5A相差幅度分别为33.32%，23.27%，这些生理指标差异较好地反映了不同品种耐低温萌发差异。4个CBF基因家族成员CBF1、CBF2、CBF4、CBF6在强耐性品种中表达上调更迅速，在胁迫12 h时达到表达峰，这可能是强耐低温萌发品种应答低温胁迫时，表现更灵敏与迅速的原因。

为筛选合理密植条件下不同棉花品种的适宜株行距配置模式，为黄河流域机采棉的发展提供一定的技术支撑，试验筛选了3个冀中南地区主栽品种：冀棉958、石抗126和冀863，设置了75 000株/hm²种植密度下4个不同的株行距配置，行距分别为80（Ⅰ），75（Ⅱ），70（Ⅲ），（100+50）cm（Ⅳ），同时设置常规种植密度45 000株/hm²为对照（CK，行距80 cm），研究了合理密植条件下不同株行距配置对棉花生长发育和产量品质的影响。结果表明，合理密植下不同株行距配置对不同品种的株高、茎粗和果枝台数等农艺性状的影响不尽相同；冀棉958和石抗126不同株行距配置的单株成铃数之间无显著差异，均显著低于低密度下的CK，单株成铃率则均为处理Ⅱ与处理Ⅳ显著高于处理Ⅰ与处理Ⅲ；冀863的单株成铃数以处理Ⅳ最高，其次为处理Ⅱ；冀棉958籽棉产量以处理Ⅳ最高，石抗126籽棉产量为处理Ⅱ与处理Ⅳ显著高于处理Ⅰ与处理Ⅲ，冀863的籽棉产量则为处理Ⅱ与处理Ⅳ略高于处理Ⅲ，处理Ⅲ又略高于处理Ⅰ。推荐3个棉花品种适宜的株行距配置为75 cm行距与（100+50）cm 2种种植模式。

通过关联分析挖掘与陆地棉黄萎病抗性关联的分子标记，为陆地棉抗黄萎病性状的分子检测及标记辅助选择育种提供有益参考。选用在棉花基因组上均匀分布多态性较好的237个SSR标记对214份陆地棉材料的基因组变异进行了扫描，并使用PowerMarker v3.25分析群体的遗传多样性，Structure 2.2分析群体结构，在此基础上结合3年黄萎病抗性鉴定数据，采用Tassel 2.1中的GLM（Q）方法挖掘与黄萎病抗性相关的QTLs。结果表明，不同陆地棉材料黄萎病发病情况差异显著；237个标记共检测到280个多态性位点，共计695个等位变异，变异范围2~6个，平均等位变异数2.479 0；按照基因型数据可将该群体划分为2个亚群；通过关联分析，在不同年份中发掘与黄萎病抗性显著关联（P<0.01）的SSR位点27个，其中有2个位点（BNL3442和BNL1064）在3年均被重复检测到，表型变异解释率最高分别为12.10%和8.02%。这些在不同年份中稳定存在的SSR标记位点有可能与抗病基因紧密连锁，有望用于棉花黄萎病抗性材料筛选和抗病基因挖掘。

为了克隆棉花抗黄萎病相关基因，利用生物信息学、病毒诱导基因沉默技术（VIGS）、实时定量PCR（qPCR）和接菌分析来研究棉花WRKY基因对大丽轮枝菌的诱导响应和抗性。结果从棉花中筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因，这些直系同源WRKY基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导响应。其中有6个GhWRKY基因的表达均受到大丽轮枝菌诱导上调，而GhWRKY70和GhWRKY48的表达量随着不同的时间点呈现上调或下调。GhWRKY22等5个基因表达量在24，72 h分别表现为上调，呈现出双峰曲线。对GhWRKY22表达特征进一步分析，结果显示，GhWRKY22基因在茎里优势表达，同时表达受到大丽轮枝菌、水杨酸和茉莉酸激素的诱导。GhWRKY22基因沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性增加，抗病标志基因（PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1.2）表达量也显著降低，揭示GhWRKY22是通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应过程。总之，棉花中8个WRKY基因参与棉花对黄萎病抗性调控，其中GhWRKY22基因正调控棉花的抗性，可作为棉花抗病育种的候选基因。

为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因的生物学功能，利用RT-PCR技术，从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9.2。生物信息学分析表明，2个基因开放阅读框（ORF）长分别为1 281，1461 bp，分别编码405，486个氨基酸。序列分析表明，2个基因均含有bZIP和DOG1结构域，属于bZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量（qRT-PCR）技术进行表达特征分析表明，GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）诱导上调表达，水杨酸（SA）诱导后，在各处理时间点，该基因表达量均低于Mock，以上结果表明，GhTGA1基因可能通过参与乙烯（ET）和茉莉酸（JA）信号通路调控棉花对枯萎病的抗性；枯萎病处理后，GhTGA9.2基因在各时间点表达量均低于Mock，呈下调表达，但能被激素（ET、JA、SA）诱导上调表达。结果表明，GhTGA9.2基因可能通过激素（ET、JA、SA）途径参与胁迫应答，通过对GhTGA1与GhTGA9.2基因表达特征分析为后续研究提供基础。