为了深入探究lncRNA TCONS_00143126在E.coli型奶牛乳腺炎中的表达模式及其生物学功能,采用奶牛乳腺上皮细胞的cDNA为模板,运用PCR克隆及测序技术来确认lncRNA TCONS_00143126的存在,并进行lncRNA的亚细胞定位分析、预测可能靶向的miRNA及靶基因,并通过KEGG通路富集分析探讨其在奶牛乳腺炎中的潜在作用机制。此外,采用LPS诱导bMECs以构建奶牛乳腺炎体外模型,并通过RT-qPCR技术检测lncRNA TCONS_00143126在LPS诱导bMECs 6,12,24 h的表达情况。结果表明,lncRNA TCONS_00143126是真实存在的,在LPS诱导的bMECs中的表达量显著上调,且主要分布于细胞核中。靶基因预测及KEGG富集分析结果显示,lncRNA TCONS_00143126可能通过靶向的miRNA(bta-miR-133a、bta-miR-193a-5p和bta-miR-375等)和靶基因(IFNE、SLC2A10、MEX3B)来调节JAK-STAT、mTOR和MAPK等炎症信号通路,进而在奶牛乳腺上皮细胞炎症中发挥作用。

茴香胺5(ANO5)是一种定位于肌膜和肌浆网的多通道膜蛋白,主要在肌膜修复和磷脂争夺中起作用,ANO5基因突变会导致颌骨发育不全以及各种肌肉疾病。为了探讨绵羊ANO5基因的单核苷酸多态性与脂肪沉积性状的关联性,选择健康且系谱清晰的1 005只湖羊公羔群体为研究对象,采用PCR扩增技术和KASPar分型技术对试验群体ANO5基因位点多态性进行检测,并与脂肪沉积性状进行关联分析,并利用qPCR分析ANO5基因在不同组织中的表达水平。结果表明,绵羊ANO5基因在湖羊多种组织中广泛表达,与其他组织相比,ANO5基因在心脏组织中的表达量最高。在绵羊ANO5基因第10内含子中检测到了g.58010 C>T多态位点的3种基因型CC、CT和TT。描述性统计结果表明,肾周脂肪质量与其他脂肪质量的差异最大,变异程度最高。相关分析结果表明,脂肪沉积相关性状与生长性状、饲料效率性状均呈正相关。关联分析结果表明,该多态位点与湖羊肾周脂肪质量及其相关性状呈显著关联。其中,CC基因型个体的肾周脂肪质量及其相对质量均显著低于TT基因型个体。综上所述,绵羊ANO5基因g.58010 C>T突变位点可作为湖羊肾周脂肪沉积性状的候选分子标记。

旨在比较分析国内地方猪种八眉猪和引入猪种大白猪两品种猪泌乳期的乳成分、血清生化指标及泌乳相关基因Leptin、LF的表达水平。选取健康状况良好,体况基本一致,胎次、配种期和分娩期接近(3 d内)的纯种八眉猪和大白猪各6头,于八眉猪和大白猪分娩(即泌乳第1天)、泌乳第7,14,21,28天,分别采集八眉猪和大白猪乳汁50 mL,血清及全血样本各2 mL,用于测定乳汁营养成分和血清中碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等指标,及Leptin、LF基因的表达情况。结果表明,泌乳第1天除了乳脂(Fat)外,八眉猪初乳中酪蛋白(CS)、总蛋白(TP)、总固形物(TS)、非脂乳固体(SNF)、乳糖(L)、游离脂肪酸(FFA)含量和酸度(Acidity)均极显著高于大白猪;八眉猪泌乳第21天的CS、TP、Fat、TS、SNF和L含量极显著低于大白猪。两猪种血清生化指标在泌乳期呈现不同的变化趋势,八眉猪在泌乳第1天,ALT、AST、GLB、BUN以及TG含量显著高于大白猪,而ALP、ALB含量显著低于大白猪。泌乳第1天,Leptin基因和LF基因在八眉猪和大白猪之间差异不显著,但自第7天起,大白猪Leptin基因表达量均极显著高于八眉猪,八眉猪LF基因表达水平均极显著高于大白猪。总的来说,2种猪的乳营养成分随泌乳期的延长呈下降趋势,Leptin基因和LF基因的表达量很有可能与2种猪的产奶量和乳品质有关,有待进一步验证。

旨在基于组学数据筛选与康乐黄鸡8周龄体质量性状相关的重要候选基因,为康乐黄鸡生长性状的分子标记辅助育种提供理论基础,为完善地方鸡种分子选育方法、加快品种选育进展提供关键的基础数据。以434只康乐黄鸡为研究对象,测定8~22周龄体质量,采用基因芯片技术对康乐黄鸡8周龄体质量性状进行全基因组关联分析,筛选显著关联SNP位点。寻找位于每个显著SNP周围2 Mb区域内的候选基因,对候选基因进行GO和KEGG功能分析。结合前期转录组测序数据、文献数据,筛选与康乐黄鸡8周龄体质量性状相关的关键候选基因。共检测到2个显著关联SNPs,分别位于2号染色体(131 485 613 bp)和4号染色体(60 413 848 bp),筛选到118个候选基因。基因功能注释结果表明,视黄酸代谢过程为最显著富集的生物学过程,脂肪酸降解、酪氨酸代谢和药物代谢-细胞色素P450等12个通路为显著性富集通路。初步确定基因OXR1、RSPO2、EIF3E、TRHR、BMPR1B、ADH1C、MTTP、LAMTOR3、PPP3CA、PDLIM3可作为康乐黄鸡8周龄体质量性状的关键候选基因。研究初步确定了2个与康乐黄鸡8周龄体质量性状显著关联的SNP位点,以及10个关键候选基因。

为探究牦牛Akirin1基因的序列特征,详细了解其组织表达特性。以甘南牦牛肌肉组织cDNA为模板,利用RT-PCR技术克隆甘南牦牛Akirin1基因CDS序列,并使用多种生物在线软件及工具进行生物信息学分析,再利用qPCR技术检测Akirin1基因在甘南牦牛心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和睾丸组织中表达差异。结果显示,甘南牦牛Akirin1基因CDS长579 bp,共编码192个氨基酸,基因编码的蛋白分子式为C₉₆₄H₁₅₂₅N₂₇₅O₂₉₁S₈,蛋白理论等电点为8.91,不稳定系数和总平均亲水性分别为84.14,-0.822,属于不稳定亲水性蛋白;蛋白潜在磷酸化位点有29个,分别为14个丝氨酸,11个苏氨酸和4个酪氨酸;无信号肽和跨膜螺旋结构,亚细胞定位显示,主要存在于细胞核中,属于非分泌型蛋白;蛋白高级结构主要由39.06%的α-螺旋和56.25%的无规则卷曲结构组成。同源性分析比对牦牛与普通牛亲缘关系最近,符合实际情况,说明Akirin1基因在进化过程中相对具有一定保守性。实时荧光定量结果显示,Akirin1基因在成年甘南牦牛心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织均有所表达,而在肾脏组织中相对表达最多,显著高于其他组织,在肌肉和肝脏组织中表达相对较少。本试验为进一步研究牦牛Akirin1基因功能特征提供一定的理论基础。

旨在建立牦牛肌肉和皮肤成纤维细胞系,并分析比较两者的形态、生长、标志基因和蛋白的差异,为更好地了解和研究牦牛相关特性提供材料。首先,从妊娠3个月的牦牛胎儿分离皮肤和肌肉组织块,分别采用组织块法和酶解法培养其原代细胞,观察其生长状态和形态特点;之后,利用CCK8法检测皮肤成纤维细胞和肌肉成纤维细胞的增殖活力,并对2种细胞进行免疫荧光染色分析;最后,利用RT-qPCR分析2种细胞中成纤维细胞标志基因的表达。结果显示,酶解法比组织块法更容易获得胎牦牛皮肤和肌肉成纤维细胞,胎牦牛皮肤成纤维细胞的活力显著高于肌肉成纤维细胞(P<0.05),且皮肤成纤维细胞中标志蛋白VIMENTIN的荧光强度显著高于肌肉成纤维细胞,但二者组蛋白修饰H3K27me3的差异不显著;VIMENTIN和S100A4基因在皮肤成纤维细胞中显著高表达,而FAP和SMA基因在肌肉成纤维细胞中显著高表达,与免疫荧光染色结果一致。综上,建立了牦牛胎儿皮肤和肌肉成纤维细胞系,并通过CCK8、免疫荧光染色和RT-qPCR等方法比较了2种细胞的生理特性。

为调查云南大理州一处奶牛养殖小区BEFV的感染情况及其流行毒株G基因的遗传多样性。对该大理州奶牛养殖小区的10份疑似病例,参考GenBank中牛流行热病毒的G基因序列,设计并合成2对特异性扩增G基因,测序并完成序列分析。同时,采60份血清样本进行抗体检测。结果显示,对10份疑似BEF病牛全血样的检测结果,6份呈BEFV核酸阳性。去除重复序列,获得4株牛流行热病毒云南流行株G基因扩增、测序,序列全长均为1 872 bp,编码623 aa。4株毒株之间组内核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,遗传进化分析与亚洲毒株聚为一类,并独自为一个细小分支。与泰国2017年分离TH-NP0065毒株和中国的毒株关系最近。与我国疫苗株JB76H的氨基酸同源性比较,发现7个氨基酸突变位点,为K⁵³→N⁵³、K⁶²→R⁶²、P¹⁸³→S¹⁸³、G²⁶³→E²⁶³、K⁴⁶¹→E⁴⁶¹、K⁴⁵⁷→R⁴⁵⁷、I⁴⁷⁵→M⁴⁷⁵。除中和抗原位点G1外,G2、G3、G4均出现变异位点。抗体检测试剂盒检测结果,抗体浓度≥52.5 ng/L临界值的样品有19份,阳性率为31.67%。综上所述,该奶牛养殖小区存在BEFV的感染,且流行株G基因存在多位点变异。

旨在基于代谢组学分析,探究不同月龄安格斯牛肉质风味差异的机制。以17,20,24月龄的安格斯牛为研究对象,在相同饲养管理条件下对不同月龄安格斯牛背最长肌进行肉质性状检测和代谢组学分析。代谢组结果表明,分别在B17 vs B20、B17 vs B24和B20 vs B24组中鉴定出69,51,53个正离子差异代谢物,53,46,58个负离子差异代谢物,其中上调差异代谢物166个,下调差异代谢物164个。KEGG通路分析表明,差异代谢物主要富集到脂质代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢和内分泌系统等多个代谢途径,包括胰岛素抵抗、胆碱能突触、亚油酸代谢、磷酸戊糖途径、碳水化合物的消化与吸收、胰高血糖素信号传导以及花生四烯酸代谢通路。相关性分析表明,还原谷胱甘肽、甜菜碱、肉碱、胆碱、次黄嘌呤、棕榈油酸、柠檬酸和乳糖等关键代谢物与表型数据具有显著的相关性,可以作为安格斯牛肉质的潜在候选代谢物。结果表明,不同月龄安格斯牛肉质风味存在显著差异,鉴定到的差异代谢物和代谢通路可以为今后安格斯牛育种提供理论基础。

bta-miR-6523a是前期史远刚课题组通过测序数据筛选出的牛脂肪沉积相关基因之一。为筛选bta-miR-6523a的靶基因,鉴定其在不同组织中的表达规律,探索其对牛脂肪沉积的可能调控机制,采用多种数据库信息对bta-miR-6523a靶基因进行预测及筛选,并探究预测的靶基因功能富集通路,最后采用qRT-PCR方法检测bta-miR-6523a在成年牛和犊牛各组织中的表达情况。结果表明,bta-miR-6523a的预测靶基因有SCD、CIDEA、LIPE等;这些预测靶基因显著富集于Ras、Rap1、肌动蛋白细胞骨架的调节以及Hippo等与脂肪细胞的生成与分化、细胞骨架的组织和维护、代谢途径相关信号通路中。qRT-PCR结果表明,牛miR-6523a在肺中的表达量最高,在肾周脂肪中的表达量最低;bta-miR-6523a在心和肝中的表达显著高于皮下脂肪、肌间脂肪、背最长肌以及肾周脂肪,皮下脂肪、肌间脂肪、背最长肌以及肾周脂肪之间差异不显著;miR-6523a在犊牛皮下脂肪、肌间脂肪和背最长肌中的表达差异显著,且显著低于成年牛组织;bta-miR-6523a在肺组织中的高表达以及在脂肪组织表达低于其他组织提示bta-miR-6523a及其靶基因生物学作用可能较为广泛。

为掌握绵羊尾长性状的遗传特性,评估绵羊尾长变异相关候选标记TBXT基因c.C334A基因型的遗传效应,为选育绵羊短尾性状提供参考。选择长尾特克赛尔羊和无尾哈萨克羊及其杂交F₁、F₂群体为研究对象,分析了尾椎数变异的遗传规律,开展了尾椎数和尾长的相关性分析。利用SPSS 26.0回归分析,在特克赛尔羊和哈萨克羊的杂交群体中评估TBXT c.C334A对尾长变异的基因型效应。结果显示,特克赛尔羊平均尾椎数为17.87±1.30、偏度1.18±0.58、峰度1.37±1.12,哈萨克羊平均尾椎数为3.52±1.03、偏度0.54±0.50、峰度0.34±0.97,F₁群体平均尾椎数为12.61±1.82、偏度-0.40±0.54、峰度1.52±1.08,F₂群体平均尾椎数为11.67±2.63、偏度-0.70±0.23、峰度-0.12±0.46,表明绵羊尾椎数在亲本和子代的遗传符合数量性状遗传规律。绵羊尾椎数对尾长的决定系数R²为0.726,表明尾椎数变化是尾长变异的主要影响因素。在受试的杂交群体中,TBXT c.C334A对尾长变异的加性效应、显性效应和替代效应分别为2.62,0.14,2.57,该位点解释了尾长表型变异的43.96%,提示TBXT c.C334A是通过影响尾椎数进而影响尾长作用效应较大的遗传标记。

旨在探明五指山猪断奶后仔猪肠道的应激变化以及对肠道黏膜AA转运载体表达量的影响。共用五指山仔猪24头,分别在断奶0天、断奶后第3,7,10天进行屠宰,并收集仔猪血清、小肠肠段和黏膜。测定其血液免疫指标、小肠形态学和肠道黏膜AA转运载体相关基因表达量。结果表明:与断奶前相比,断奶后第3天肠绒毛断裂稀疏,十二指肠和回肠绒毛高降低,空肠和回肠绒毛表面积的变化差异显著。断奶后第7天后绒毛高等数值均有好转;血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白和葡萄糖含量在断奶后显著降低,天门冬氨酸氨基转移酶、总胆固醇、乳酸脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶含量差异显著;断奶后血清中二胺氧化酶、D-乳酸和脂多糖变化显著;断奶后小肽转运载体PepT1相对表达丰度按照十二指肠、空肠和回肠的顺序依次进行增加,酸性AA转运载体EAAT3相对表达丰度在肠道中不显著,中性AA转运载体B⁰AT1、ASCT2和rBAT在空肠以及回肠中的相对表达量更高,碱性AA转运载体CAT1、y+LAT1和4F2hc,在断奶后十二指肠的表达量降低,载体在回肠的表达中相对更加稳定。综上所述,早期断奶应激引起五指山仔猪绒毛缩短和隐窝增生等明显肠道变化,血液免疫蛋白及二胺氧化酶、D-乳酸和脂多糖等含量降低,同时肠道AA转运载体表达量变化,尤其断奶后第3天各项指标变化明显,但随着断奶日龄增长至第10天逐渐恢复,仔猪免疫力增强,肠道黏膜通透性增加。

旨在探究PLA2G4A基因对坝上长尾鸡腿肌肌肉组织中肌苷酸(IMP)的调控水平,为进一步探究坝上长尾鸡PLA2G4A基因的生物学功能奠定基础。以选取270日龄的坝上长尾鸡腿为试验材料,将坝上长尾鸡腿肌组织以肌苷酸含量高低进行分组,每组各5个样本,从腿肌组织中提取总RNA,对其进行转录组测序分析,并进行KEGG富集分析GO功能注释和蛋白互作网络分析;利用RT-qPCR技术,分析差异基因在坝上长尾鸡腿肌组织中的mRNA表达水平;从测序结果中筛选参与甘油磷酸酯代谢通路的基因PLA2G4A。KEGG富集分析结果表明,与肌苷酸合成相关的信号通路包括甘油磷酸酯代谢、醚脂代谢、花生四烯酸代谢等。GO功能注释表明,PLA2G4A基因参与11个生物学过程,包括甘油磷酸酯代谢,醚脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢等。蛋白互作发现,PLA2G4A基因与花生四烯酸代谢和甘油磷酸酯代谢过程中的重要调控酶共享功能。RT-qPCR结果显示,坝上长尾鸡腿肌组织中PLA2G4A基因的表达量在样本中存在显著性差异。综上所述,PLA2G4A基因可能是影响鸡肉IMP沉积的主效基因。

为探讨沙门氏菌感染对番鸭的影响,拟通过转录组测序技术检测并分析沙门氏菌人工感染番鸭后不同时间脾脏组织的转录调控变化。14 d雏番鸭在肠炎沙门氏菌人工感染后1,3,10 d分别采集试验组和对照组脾脏组织样本。Illumina测序平台测序后进行生物信息学分析,筛选差异基因、信号通路,并预测基因功能。结果表明,在番鸭感染沙门氏菌1,3,10 d分别发现95,53和12个差异基因(P<0.05,|log₂(fold change)|>1)。GO分析表明,3个时间点中这些差异基因在生物学进程、分子功能、细胞部分均有富集。KEGG分析表明,感染1 d差异基因富集在细胞因子-细胞因子相互作用信号通路最多,包括CXCR4、CCL3、GDF9和CNTFR;感染3 d,富集在神经活性配体-受体相互作用信号通路的差异基因最多,包括ADRA1A、ADRA1b、GRIA1和MC5R;感染10 d获得的差异基因H2-EB1参与多条信号通路。结果提示,在番鸭沙门氏菌感染过程中这些信号通路和差异基因可能发挥了重要作用。

为有效控制畜禽粪便堆肥过程中的氮素损失,采用反应器进行模拟堆肥试验方法,以鲜牛粪为原料、玉米秸秆为辅料,研究不同黏土矿物与化学物质复配添加剂对牛粪堆肥过程中氮素损失、氮素形态转化规律以及理化性质的影响。结果表明,添加剂未对物料的腐熟过程造成显著影响,堆肥结束后有机肥种子发芽率和pH值均达到《有机肥料》(NY525-2021)的要求。添加黏土矿物蛭石和膨润土后,牛粪堆肥过程中氨气总排放量均较对照显著下降,分别为21.83%和14.22%;而黏土矿物与化学物质复配可进一步降低堆肥氨排放,以蛭石+过磷酸钙组合的氨减排效果最佳,其次是蛭石+磷酸二氢钙组合,氨气排放总量均较单一蛭石处理显著下降,分别为28.47%和21.18%。相关分析表明,在物料pH值7.0~8.0,堆体氨排放总量与物料pH值呈线性相关关系(y=52.97x-351.77,r=0.83),物料pH值每降低0.1个单位,氨排放总量可降低5.30 g/kg。堆肥结束后各处理全氮含量较对照处理增加6~14百分点。可见,黏土矿物与磷酸二氢钙、木醋液、过磷酸钙等化学物质复配,可有效降低堆体pH值,减少堆肥过程中的氨排放总量,增加堆肥中氮含量,进而实现牛粪堆肥过程中的保氮增肥功效,以蛭石和过磷酸钙复配的效果最佳。

探究内蒙古自治区通辽市牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染毒株主要基因型,为BVDV流行病学及防控提供参考依据。试验前期在内蒙古通辽市某牛场采集腹泻犊牛粪便样品经PCR检测,将BVDV阳性的粪便样品处理后接种到牛肾细胞(MDBK)中进行分离,通过RT-PCR、间接免疫荧光染色对分离株进行鉴定,并对其基因组全长进行测序,根据5'UTR 、N^pro和E2基因序列进行遗传进化分析和基因分型鉴定。结果表明,试验成功分离到一株BVDV毒株,将其命名为NM-21,接种NM-21的MDBK未产生细胞病变,说明该毒株为非细胞病变型(NCP),RT-PCR、间接免疫荧光染色鉴定均为阳性,病毒滴度为10^-3 TCID₅₀/mL。基于基因组全长序列、5'UTR 、N^pro和E2基因序列的同源性和遗传进化分析,分离株NM-21与中国内蒙古自治区毒株NM2103(GenBank登录号ON337882.1)核苷酸同源性最高,为BVDV-1c亚型。

为研究牦牛磷酸酪氨酸互作结构域1基因(PID1)的结构及功能,并探究其在各组织中的表达情况,以桑桑牦牛脂肪组织cDNA为模板克隆桑桑牦牛PID1基因CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。同时,采用实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR),对牦牛的7个不同组织包括心、肝、脾、肺、肾、背部肌肉及脂肪进行PID1基因表达水平的定量。结果表明,牦牛PID1基因的编码区长度是654 bp,编码217个氨基酸;通过同源性比对,结果发现,牦牛与野牦牛之间的亲缘关系最为接近,相似度达到100%;经过蛋白质分析发现,牦牛PID1蛋白的分子质量约为24.84 ku,理论等电点为6.30。根据不稳定系数计算结果显示,其不稳定性较高(47.96),属于一种不稳定蛋白质。该蛋白内含有1个N-糖基化位点和23个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构。RT-qPCR试验结果表明,在各个组织中都能检测到PID1基因的表达情况,其中在肺部表达量最高。该研究克隆了牦牛PID1基因,并对其蛋白结构进行了分析,同时还研究了该基因在牦牛组织中的表达情况。为进一步探究PID1基因在牦牛脂肪沉积过程中的作用提供了初步数据。

由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的高度接触性胃肠道传染病对我国养猪业造成巨大的经济损失。为建立PEDV抗体检测方法及N蛋白的功能研究奠定基础,通过噬菌体展示技术针对PEDV N蛋白进行筛选获得其特异性的纳米抗体(Nb)。利用前期制备的N蛋白免疫羊驼,采集其外周血并分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增重链抗体重链可变区(VHH),插入pCANTAB5E-ccdb载体,电转化至ER2738感受态细胞,构建VHH噬菌体展示文库;随后,以PEDV N蛋白作为靶向蛋白,对文库进行4轮淘选获得阳性噬菌体,将其克隆至pET-30a 载体,表达纯化后通过间接ELISA、Western Blot鉴定Nb的结合力和特异性。结果显示,羊驼经5次免疫后,抗体效价达到1∶25 600。构建的噬菌体展示文库库容为4.72×10⁸,丰度为4.3×10¹⁰ cfu/mL,阳性率为93.75%。经过4轮筛选,获得16株氨基酸序列不同的Nb,随后验证了Nb45与PEDV N蛋白具有良好特异性和结合能力。研究筛选获得了PEDV N蛋白特异性Nb,为PEDV检测方法的建立和基础研究提供生物材料。

旨在分析禽戊型肝炎病毒(aHEV)CaHEV-GDSZ01株ORF2蛋白的结构和生物学功能等,并利用大肠杆菌原核表达系统表达ORF2重组蛋白及制备抗ORF2蛋白多克隆抗体,验证重组蛋白的免疫原性和反应原性等。利用生物信息学软件对CaHEV-GDSZ01株ORF2蛋白的理化性质、结构和功能等方面进行分析;通过酶切、连接pET-32a(+)载体与CaHEV GDSZ01株的ORF2基因,构建pET-32a-ORF2-His和pET-32a-ORF2原核表达质粒,并转化至DE3感受态细胞中进行诱导表达,分析其表达形式;ORF2重组蛋白经切胶纯化,利用Western Blot试验验证其反应原性后,免疫新西兰大白兔以获得兔抗ORF2蛋白多克隆抗体,并通过Western Blot方法对多抗进行鉴定分析、利用间接ELISA方法进行抗体效价检测。生物信息学分析结果显示,CaHEV-GDSZ01株的ORF2蛋白为亲水性的、不稳定的蛋白,且其存在信号肽的概率高达93.59%,其二级结构主要以无规则卷曲为主,具备结合抗体的结构条件,其保护性抗原整体预测评分则表明ORF2蛋白具备良好的免疫原性。试验成功构建了ORF2重组原核表达质粒,并成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE试验和Western Blot试验显示,诱导表达的蛋白主要为非可溶性蛋白,并具有良好的反应原性;而制备的兔源抗 aHEV ORF2蛋白多克隆抗体的效价为1∶102 400,且能特异性识别免疫原ORF2蛋白、非免疫原ORF2-His蛋白和截短的sORF2蛋白。以上结果初步分析了ORF2蛋白的理化性质和部分生物学功能,成功表达了aHEV ORF2蛋白,制备了抗ORF2蛋白的兔源多克隆抗体。

为研究Toll样受体2(TLR2)在水禽如鸭先天免疫中的作用,利用荧光定量PCR分析dTLR2 mRNA在1~10周龄鸭免疫器官中表达水平以及大肠杆菌、沙门氏菌感染后血液中dTLR2 mRNA表达变化,初步解析dTLR2在鸭抗感染中的可能作用;通过体外表达鸭dTLR2胞外段,并免疫家兔获得特异性抗体以期为鸭dTLR2免疫应答研究提供生物素材。结果表明,dTLR2 mRNA在不同周龄鸭免疫器官中都有表达,脾脏和胸腺组织中,表达量在不同周龄有显著或极显著变化,但在法氏囊组织中,各周龄间表达变化差异不显著;鸭感染大肠杆菌或者沙门氏菌后,第1天及第2天感染组表达量显著高于对照组,但在第3天时,感染组和对照组表达量差异不显著。研究分析dTLR2编码基因,预测胞外区段并设计引物,构建pET28a-TLR2重组表达质粒,重组表达dTLR2-His融合蛋白。经SDS-PAGE检测表明,重组蛋白成功高效表达,分子质量约29 ku。重组蛋白经镍柱纯化并透析后免疫家兔制备抗血清;所获家兔免疫抗血清能特异性的识别重组TLR2蛋白和组织中内源性TLR2蛋白。鸭dTLR2 mRNA组织中表达分析及多克隆抗体的成功制备将为进一步研究dTLR2的生物学功能提供生物素材。

为检测汶上芦花鸡CDKN2A基因SNP位点,并对该基因进行生物信息学及其在皮肤组织中的表达规律分析。研究基于江苏省家禽科学研究所资源保护与评价课题组前期组装的汶上芦花鸡高质量染色体水平基因组,将其与鸡参考基因组(GRCg7b)比对获得CDKN2A基因SNP位点,采用MassARRAY核酸质谱技术对其进行多态性检测和基因分型;运用生物信息学软件预测CDKN2A基因调控序列,及其编码蛋白质理化性质和结构特征;采用转录组和实时荧光定量方法分析该基因在汶上芦花鸡不同时期皮肤组织中的表达情况。结果表明,汶上芦花鸡CDKN2A序列总长度为9.854 kb,CDS全长183 bp,共编码60个氨基酸,在该基因及其上下游1 kb序列范围内共发现41个SNP,其中4个为新发现的SNP,分别位于基因下游和内含子区,第1外显子上发现2个错义SNP:V9D和C10R,41个SNP中34个SNP在汶上芦花鸡群体中检出率在91%以上,但基本均为纯合突变型,无多态存在;汶上芦花鸡CDKN2A基因上游2 kb区域内预测到8个启动子和5个CpG岛,启动子区包含Sp1、MEB-1、YY1、C/EBPα和AP-2α等12种转录因子结合潜在位点,该基因编码蛋白分子质量为7.30 ku,理论等电点为12.82,为带正电荷的、不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位主要在线粒体中,无信号肽区域和信号肽剪切位点,共存在8个潜在磷酸化位点,不存在糖基化位点,含有典型的TRP_2(瞬时受体电位离子通道Ⅱ)保守结构域,其二级和三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,并与MDM2、NPM1、USP36蛋白存在相互作用;汶上芦花鸡1~35日龄CDKN2A基因在其背部皮肤中的表达呈上升趋势。

旨在探讨羧基酯脂肪酶基因(CEL)的单核苷酸多态性与湖羊眼肌面积的相关性。选取1 049只具有准确表型记录且健康的湖羊,屠宰后测定其眼肌面积,采集血液提取基因组DNA,通过PCR和KASPar SNP分型技术对CEL基因进行目的片段扩增和基因分型,并与湖羊眼肌面积进行关联分析,采用RT-qPCR检测CEL基因在湖羊10种组织中的表达情况。结果显示,湖羊CEL基因在不同组织中均有表达,且在十二指肠中表达量最高;该基因存在一个g.4039718 C>T的同义突变,呈中等多态。性状关联分析表明,该多态位点与湖羊的眼肌面积显著关联,TT型个体的眼肌面积显著高于CC型个体。描述性统计结果显示,眼肌面积的变异系数为12.29%,具有较高的选择潜力。相关性分析表明,眼肌面积与体质量、体高、体长、胸围、屠宰率、胴体质量和宰前活质量等生长性状和屠宰性状呈正相关。结果表明,g.4039718 C>T多态位点可作为候选分子标记用于湖羊眼肌面积性状的遗传改良。

旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV 感染对 DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)探究外源过表达DDX21及敲低 DDX21 对 TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调; RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID₅₀试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N 基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601—784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。

表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中,48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中,经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率,RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达,建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体,由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系,PCR产物交换入线性化表达载体,获得了阳性转化子8个,大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为 3.5×10⁸ TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著,经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示,EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升,且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株,犬EGFR的过表达催化了细胞分裂,使DNA复制加快,同时刺激了细胞凋亡。

旨在探究Ezrin对小鼠卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育的影响,揭示其可能作用机制。分别向小鼠GV期卵母细胞和原核期胚胎注射Ezrin的siRNA(si-Ez)或阴性对照siRNA(si-NC),观察对小鼠卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育的影响,并分别通过扫描电镜和免疫荧光染色的方法观察GV期注射si-Ez对小鼠成熟卵母细胞表面微绒毛生长、纺锤体定位和皮质颗粒迁移的影响。结果显示,GV期敲低Ezrin可显著降低小鼠卵母细胞成熟率,极显著降低受精后早期胚胎的囊胚率,虽可降低成熟卵母细胞的受精率,但差异不显著;在原核期敲低Ezrin,可极显著降低小鼠囊胚细胞数,桑椹胚存活率和囊胚率虽有下降趋势,但与对照组无显著差异;扫描电镜观察发现,敲低小鼠GV期卵母细胞Ezrin后显著降低了MⅡ期卵母细胞表面微绒毛的长度和密度;免疫荧光结果显示,敲低小鼠GV期卵母细胞Ezrin影响了纺锤体和皮质颗粒的迁移。结果表明,Ezrin通过影响微绒毛形成、纺锤体定位和皮质颗粒的正常迁移阻滞了小鼠卵母细胞成熟,进而影响了受精和早期胚胎发育。

为了探究解偶联蛋白3(UCP3)在民猪不同组织中的表达情况以及对民猪前脂肪细胞中线粒体相关基因和ATP合成酶相关基因表达的影响,采集1月龄民猪的背部脂肪组织作为研究材料,通过酶消化法分离前脂肪细胞进行体外培养,同时采集腋下脂肪、胸部脂肪、背部脂肪、腹股沟脂肪、肾周脂肪和肌内脂肪构建组织表达谱。通过体外转染UCP3基因的过表达载体或干扰片段的方法,采用实时荧光定量PCR技术检测MCU家族基因(MCU、MICU1、MICU2)、ATP合成酶(ATP5B、ATP5E)和1,4,5-三磷酸肌醇受体1型基因(ITPR1)的表达情况以及不同脂肪组织中UCP3基因的表达情况。结果显示:采用酶消化法可以在背部脂肪组织中快速获得足量的前脂肪细胞,细胞边缘折光性良好,边界清晰,形态与成纤维细胞相似。UCP3基因在不同脂肪组织中均有表达,在背部脂肪组织中表达量最高,在腹股沟脂肪中表达量最低。过表达UCP3基因后,MCU家族基因和ITPR1基因表达水平显著升高,ATP5B基因表达水平显著下降。干扰UCP3基因后,MCU家族基因和ITPR1基因表达水平显著降低,ATP合成酶基因表达水平显著升高。结果说明:UCP3基因在不同脂肪组织中存在表达差异,可促进MCU家族基因和ITPR1基因表达、抑制ATP5B基因表达。

为探究牛Bta-miR-494的序列特征及其组织表达情况,运用生物信息学方法分析其上游序列的 CpG岛、启动子及转录因子特征及其在不同物种间的保守性;之后对牛Bta-miR-494的靶基因进行预测及功能富集分析;最后通过qRT-PCR方法检测其在牛不同组织及不同时期同一组织间的时空表达特征。结果表明,Bta-miR-494在不同物种间高度保守且与山羊亲缘关系最近,其上游不含CpG岛、存在2个转录起始位点;预测靶基因富集分析表明,Bta-miR-494的靶基因显著富集在PI3K-Akt、p53及MAPK等与肌肉生长发育及代谢相关的信号通路;qRT-PCR结果显示,Bta-miR-494在成年牛肝脏中的表达量最高,睾丸中表达量最低;且Bta-miR-494在成年牛股二头肌中的表达量显著高于初生犊牛,而心肌和背最长肌中的表达量显著低于初生犊牛。这种组织间差异性表达提示,Bta-miR-494可能在牛不同生长阶段的肌肉组织发育过程中主导不同的生肌表达模式。

旨在对禽戊型肝炎病毒的ORF3蛋白进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为进一步研究aHEV ORF3蛋白生物学功能新型疫苗提供生物材料。通过RT-PCR方法扩增CaHEV-GDSZ01株ORF3基因,连接pET-32a(+)表达载体以构建重组原核表达质粒,并转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达;利用SDS-PAGE凝胶电泳分析ORF3蛋白的表达形式后进行纯化,并免疫新西兰白兔以获得兔抗ORF3蛋白多克隆抗体,利用间接ELISA试验检测多克隆抗体的效价,利用Western Blot试验和间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体特异性。结果显示,成功构建了pET-32a-ORF3重组原核表达质粒,并通过原核表达系统成功诱导表达了27 ku不可溶性的aHEV ORF3重组蛋白;Western Blot试验和IFA试验结果显示,制备的多克隆抗体可以特异性识别ORF3蛋白,ELISA结果显示,多克隆抗体效价为1∶51 200。成功表达CaHEV-GDSZ01株的ORF3蛋白,并制备了其多克隆抗体。

为探究陆川猪骨骼肌生长发育过程中MyoD1基因所起作用,对陆川猪成肌细胞决定基因1(MyoD1)进行克隆,展开生物信息学分析,对其在陆川猪不同组织中的表达进行分析,以NCBI上已公布的野猪MyoD1基因序列为模板,进行特异性引物设计,克隆陆川猪MyoD1基因CDS区,并与NCBI已公布的野猪、牛、绵羊、人、小鼠、大鼠基因序列进行相似性比对,由此构建系统进化树,通过在线软件开展生物信息学分析,而后使用实时荧光定量PCR检测在陆川猪不同组织中MyoD1基因的相对表达量。陆川猪MyoD1基因CDS区全长960 bp,共编码319个氨基酸,碱基突变共存在5处,与野猪、牛、绵羊、人类、小鼠、大鼠的MyoD1基因CDS序列相似性分别为99.2%,93.0%,92.3%,90.0%,84.3%,84.0%,其中与野猪相似性最高,表明二者亲缘关系最为接近;陆川猪MyoD1基因原子总数为4 680,蛋白的分子质量为33.99 ku,分子式为C₁₄₅₇H₂₂₉₆N₄₄₂O₄₇₁S₁₄;不稳定系数为63.87,表明其缺乏稳定性;等电点为5.63,属于酸性蛋白;不存在跨膜结构,存在35处磷酸化位点及1处糖基化位点;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比60.69%。陆川猪MyoD1基因在背最长肌中的表达量最高,且显著高于其他组织,表达量最低的组织为肾脏。陆川猪各组织中均有MyoD1基因表达,且主要在背最长肌中表达,由此推测,MyoD1基因在陆川猪肌肉生长发育过程中可能起到至关重要的作用。

旨在克隆麦洼牦牛MFSD4A基因序列并阐明其在不同组织中的表达模式,分析MFSD4A互作蛋白mRNA表达水平及其相关性,确定MFSD4A蛋白的亚细胞定位,为后续MFSD4A在牦牛睾丸生长发育调控研究中提供理论依据。以4头健康麦洼牦牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、臀肌、背部肌肉、睾丸、结肠组织作试验材料,用 RT-PCR技术克隆麦洼牦牛MFSD4A 基因CDS序列并对其进行生物信息学分析;利用RT-qPCR技术检测MFSD4A基因在心、肝、脾、肺、肾、臀肌、背部肌肉、脂肪、睾丸、淋巴等10个组织中的表达及与其互作蛋白的相关性;构建pEGFP-MFSD4A融合质粒转染牛肾细胞系(MDBK)探究MFSD4A蛋白的亚细胞定位情况。结果表明,麦洼牦牛MFSD4A基因 CDS 区全长为1 530 bp,编码509个氨基酸,理论等电点(pI)为8.66,具有12个跨膜结构域,属于碱性跨膜蛋白;RT-qPCR结果显示,MFSD4A mRMA在麦洼牦牛各组织中差异表达,且在睾丸组织中表达量最高,与MFSD9、CBY1、INHBA、UNC93A、SVOP、ID1在睾丸组织中的表达量呈极显著正相关,推测MFSD4A基因可能与牦牛睾丸的生长发育调控有关;构建 pEGFP-MFSD4A 融合质粒转染牛肾细胞(MDBK)后的荧光定位显示该蛋白主要定位于细胞核。

为探究干扰素刺激外切酶基因20(ISG20)在肉牛子宫内膜上皮细胞容受态形成中的表达及功能分析。采用RT-PCR结合测序技术获得肉牛ISG20基因的CDS区,利用生物信息学在线工具进行了ISG20基因及其所编码的蛋白质的序列分析,并利用qRT-PCR检测了ISG20基因及其相关基因在肉牛子宫内膜上皮细胞容受态形成中的表达量。结果显示,ISG20基因的CDS区长度为516 bp,可编码一条由176个氨基酸组成的无跨膜结构域且不稳定的碱性亲水性单体蛋白质。该蛋白质含有1个DEDD 核酸外切酶超家族结构域,与ISG15和MX2等10种蛋白质相互作用,主要在细胞质中发挥作用。此外,qRT-PCR结果表明,与对照组相比,ISG20基因及其相关的ISG15和MX2在孕酮(P4)联合干扰素-tau(IFN-τ)诱导的肉牛子宫内膜上皮细胞容受态形成中的表达量均显著上调。ISG20可能参与肉牛子宫内膜上皮细胞容受态的形成,并在早期妊娠等生物学过程中发挥作用。

为了研究牦牛DJ-1基因的结构及功能,为后续深入研究牦牛DJ-1基因的生物学功能提供了重要的理论依据。以美仁牦牛脂肪组织cDNA为模板,利用RT-PCR克隆牦牛DJ-1基因的编码区序列(CDS ),并且利用基因序列进行生物信息学分析,预测结构域及蛋白质理化性质等,再利用RT-qPCR技术进行组织表达分析。结果表明,美仁牦牛DJ-1基因的CDS区全长570 bp,共编码189个氨基酸;牦牛DJ-1结构域预测显示,在DJ-1氨基酸序列的29—168 位中有1个含有Pfam的PfpI结构域;通过对DJ-1蛋白结构和功能进行预测,结果显示,无跨膜结构且无信号肽区域,分子质量20.035 31 ku,原子总数2 870,理论等电点6.84,不稳定系数28.37,表示为稳定的蛋白质;脂肪系数101.11,总平均亲水系数-0.004,为亲水蛋白,共有11个磷酸化位点;同时,亚细胞定位预测结果表明,美仁牦牛DJ-1蛋白主要分布于细胞质和线粒体中,系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和欧洲牛亲缘关系最近,与北极狐和宽吻海牛亲缘关系最远;RT-qPCR结果表明,在成年美仁牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中均有所表达,在心脏组织和肌肉组织中表达水平最高,在肝脏和睾丸组织中表达水平最低。

旨在分析有角和无角欧拉羊群体RXFP2基因对犄角表型的调控作用及相关SNP分子标记,以期为欧拉羊的遗传改良、品种培育提供技术支持。通过采集青海省河南县健康成年欧拉羊母羊血液样品100份,其中有角、无角各50份,提取DNA,随机选取有角、无角样品各15份开展全基因组测序,随后采用多重PCR扩增全部血样验证RXFP2基因SNP。全基因组检测结果表明,包含RXFP2基因在内的欧拉羊10号染色体存在强选择信号,最强选择信号出现在RXFP2基因区段;多重PCR检测验证了全基因组重测序筛查到的4个编码区SNP的准确性,并检测到7个欧拉羊RXFP2基因内含子区域高频SNPs(29508704G>A、29509428A>C、29509766G>A、29512170G>A、29512176G>A、29514968T>A、29521377C>A);经统计检验,该7个SNP位点的基因型在犄角有无表型上表现出分离,纯合子基因型均100%表现为无角或有角,杂合子基因型89.66%表现为无角,10.34%表现为有角;突变等位基因频率小于野生等位基因频率,群体表现为哈代温伯格不平衡状态,受到人工选择强度大,但多态信息含量中等,选育改良潜力仍较大。综上,确认了RXFP2基因在欧拉羊群体中对犄角有无的强调控作用,并筛选出了欧拉羊RXFP2基因的7个犄角有无表型的分子标记,相关结果可作为欧拉羊无角性状群体的遗传改良的分子标记。

为研究PPARA对绵羊肌内脂肪(IMF)沉积的影响及作用机制,寻找绵羊肌内脂肪沉积相关分子标记,以小尾寒羊(STH)和萨寒杂交(STH×SFK)F₁群体为研究对象,通过测定其肉品质,利用H&E染色和油红O染色比较2个绵羊群体背最长肌组织学结构及脂滴分布;利用qRT-PCR和WB技术检测PPARA mRNA水平和蛋白水平在不同群体间的表达差异,并分析PPARA基因与肌内脂肪的相关性;Sanger测序技术检测PPARA基因SNP位点以评估其作为绵羊肌内脂肪沉积相关遗传标记的可能性。结果表明:小尾寒羊剪切力和失水率极显著高于萨寒杂交,但是pH值极显著低于萨寒杂交,大理石花纹评分小尾寒羊低于萨寒杂交群体;组织学染色显示,小尾寒羊肌纤维较粗,排列紧密,肌内脂肪在肌纤维间隙集中分布;萨寒杂交肌纤维较细且结构松散,肌内脂肪在肌细胞间及肌纤维间隙均匀、广泛分布,含量更高;PPARA mRNA表达量小尾寒羊群体显著高于萨寒杂交群体,PPARA蛋白表达量小尾寒羊群体极显著高于萨寒杂交群体;相关性分析显示,PPARA基因表达量与绵羊脂滴面积比及pH值呈极显著负相关,与剪切力和失水率呈极显著正相关,与大理石花纹评分弱相关;Sanger测序结果分析显示,2个绵羊群体PPARA基因第2内含子T49885C、T50007C、G50013A、G50835A、G50942A及G51154C位置上发生碱基突变,但小尾寒羊群体未检测到C49885T突变。SNP遗传多样性分析显示,SNP位点群体纯合度均大于杂合度,在群体中处于中低度多态;除G50835A突变偏离了Hardy-Weinberg平衡,其余SNPs均符合Hardy-Weinberg平衡,遗传基础稳定。研究认为,PPARA基因对绵羊肌内脂肪沉积具有重要影响,可作为绵羊肌内脂肪性状选择的潜在分子遗传标记。

旨在探讨二磷酸甘油酸变位酶(BPGM)对鸡成肌细胞生长发育的影响。对宁夏大学动物科技学院张娟课题组前期转录组学和蛋白组学数据进行联合分析,筛选出可能影响生长发育的差异表达基因,探究其对成肌细胞增殖、凋亡和相关标志基因表达水平的影响,并对糖酵解通路上下游基因的表达进行定量分析。ELISA检测肌苷酸(IMP)含量;比色法检测腺苷三磷酸(ATP)含量,深入揭示关键候选基因对静原鸡肌肉发育和肉质风味的重要作用。结果表明,静原鸡胸肌与腿肌间共鉴定到差异表达基因/蛋白139个,其中在转录组和蛋白组同时上调的差异基因/蛋白75个,在转录组和蛋白组同时下调的差异基因/蛋白45个,在转录组上调蛋白组下调的差异基因/蛋白13个,在蛋白组上调转录组下调的差异基因/蛋白6个;从糖酵解/糖异生通路筛选出7个差异表达基因,分别是BPGM、磷酸甘油酸激酶1基因(PGK1)、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(GPI)、磷酸甘油酸变位酶基因(PGAM1)、乳酸脱氢酶A基因(LDHA)、乳酸脱氢酶B基因(LDHB)、磷酸丙糖异构酶1基因(TPI1),结合KEGG通路富集分析和蛋白网络互作分析筛选出差异表达基因BPGM。BPGM在静原鸡母鸡组织中均有表达,在胸肌中的表达量最高,且在成肌细胞分化过程中呈上调趋势。用分离培养的原代成肌细胞进行细胞转染,干扰BPGM抑制了成肌细胞的增殖而促进细胞凋亡,并调控糖酵解通路上下游基因的表达,同时抑制了IMP和ATP的生物合成。综上所述,下调BPGM可以抑制成肌细胞的生长发育及IMP和ATP的生物合成。

为了探究lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖分化的影响,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测lncRNA2099在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和背脂及离体培养的前体脂肪细胞增殖和分化阶段的表达水平;利用核质分离技术确定lncRNA2099在脂肪细胞中的表达位置;构建真核表达载体pcDNA3.1-lncRNA2099,采用qRT-PCR技术检测在脂肪细胞内过表达该lncRNA后对脂肪细胞增殖、分化相关标志基因表达的影响。结果显示:lncRNA2099存在明显组织表达特异性,且在肾脏和背脂中高表达,在背肌中不表达;lncRNA2099在猪前脂肪细胞增殖阶段12 h表达量最高,随后逐渐降低。在分化阶段第2 天表达量最高,随后逐渐降低。核质定位结果表明,lncRNA2099在细胞核与细胞质中均有表达;在脂肪细胞内过表达lncRNA2099后,增殖标志基因P21与成脂分化标志基因LPL表达量极显著升高。lncRNA2099可能作为转录调节因子抑制猪前脂肪细胞增殖、促进成脂分化。

旨在通过对布莱凯特黑牛大小睾丸转录组数据进行分析,挖掘影响睾丸生殖功能的关键候选基因,探究睾丸大小对牛生殖功能维持的分子机制。采集12月龄布莱凯特黑牛睾丸,根据质量、长径和短径将其分为2组(大小睾丸组各3头)进行高通量转录组测序;以|log₂(Fold Change)|≥1且P-value≤0.01为阈值筛选差异基因,对差异基因进行GO和KEGG功能富集分析,筛选出影响睾丸生殖功能的关键基因;对其进行CDS区克隆测序,并运用qRT-PCR、Western Blot、免疫组化等方法进行进一步研究。结果显示,差异表达基因共353个,其中114个基因在小睾丸中表达上调,239个基因表达下调。GO功能注释表明,差异基因参与代谢、发育、生殖等过程;KEGG富集分析显示,差异基因主要富集在Wnt信号传导、PI3K-Akt信号通路等与睾丸生殖功能相关的途径。最终筛选出睾丸生殖功能基因CCN4进行进一步研究。qRT-PCR和Western Blot结果显示,CCN4基因和蛋白在大睾丸中表达量显著低于小睾丸。免疫组化结果显示,CCN4蛋白主要在精细胞外的区域(特别是支持细胞)中表达,且大睾丸中的相对表达量显著低于小睾丸,推测其高表达会抑制支持细胞发育,从而影响睾丸生殖功能。综上,研究结果可为深入开展牛睾丸大小对生殖功能影响的分子机制研究提供基础资料。

旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先,用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量,染色并分析细胞凋亡与坏死情况,筛选ZEN添加的合适剂量;接着,试剂盒检测ZEN对MAC-T细胞中活性氧(ROS)以及线粒体膜电位的影响;最后,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,分析ZEN对MAC-T细胞增殖、凋亡、氧化应激和乳脂合成相关基因表达的影响。结果表明,低剂量ZEN(0.01~1.00 μmol/L)有促进MAC-T生长的趋势,而高剂量ZEN(5.00~10.00 μmol/L)显著降低MAC-T细胞数量;0.10 μmol/L ZEN对MAC-T中ROS和线粒体数量无明显影响,但10.00 μmol/L ZEN显著增加了MAC-T中ROS水平,降低了线粒体数量;RT-qPCR结果表明,0.10 μmol/L ZEN显著促进增殖基因(CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4)和抗凋亡基因(BCL-2)表达,但同时提高了凋亡基因(CAS-3、BAX)表达量;10.00 μmol/L ZEN显著抑制增殖基因(PCNA、CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4、AIFM2)和抗凋亡基因(BCL-2)表达,但显著促进凋亡基因(CAS-3、BAX)表达;值得注意的是,0.10 μmol/L ZEN显著促进了乳脂合成相关基因(PPARγ、FASN、JAK-2),但10.00 μmol/L ZEN显著抑制了这些基因表达。上述结果提示,不同浓度ZEN对MAC-T细胞的作用存在差异:0.10 μmol/L ZEN可以促进MAC-T细胞生长和乳脂合成相关基因表达的同时,也会诱导凋亡基因表达;10.00 μmol/L ZEN会诱导MAC-T细胞氧化应激、降低线粒体数量,抑制增殖、抗氧化、抗凋亡和乳脂合成相关基因表达,同时促进凋亡基因表达,导致细胞死亡。

杜泊羊的毛囊具有周期性生长发育的特点,一般分为生长期、退行期、休止期3个时期。旨在探索经前期研究筛选出的与毛囊生长期和休止期相关的关键lncRNAs作为ceRNA的调控机制。选用饲养条件相同、体质量体尺相近,年龄大约2周岁的具有极端脱毛表型的杜泊母羊(S组)和不脱毛杜泊母羊(N组)各10只作为试验对象,经表型观测选择其中表型最好的5只脱毛羊与3只不脱毛羊用于转录组测序。通过靶向预测、表达模式分析以及GO和KEGG富集分析等生物信息学分析方法构建关键lncRNAs的ceRNA调控网络,进一步研究关键lncRNAs的调控机制。经lncRNA-miRNA及miRNA-mRNA靶向预测分析共筛选到262个mRNAs,其中有135个与相应lncRNAs表达模式一致(19个A模式(Anagen,生长期高表达),116个T模式(Telogen,休止期高表达))。将这135个mRNAs进行GO和KEGG富集分析发现,一些与毛囊发育相关的基因,如CTNNB1、FGF22、FGF5、FZD3、JAK3、Lpar6、NGFR、PAK1、EIF4E及Wnt10b富集于与毛囊发育相关的Rap1、MAPK、Wnt、PI3K-Akt、Ras、mTOR、Jak-STAT及Hippo等信号通路中。最终构建了由10个lncRNAs、11个miRNAs及10个mRNAs组成的ceRNA调控网络。对随机挑选的几个差异表达lncRNAs和差异表达基因进行qRT-PCR验证,结果显示与转录组测序结果表达趋势基本一致,说明测序结果可靠。研究获得的这10个lncRNAs与其靶向调控的miRNAs及mRNAs可作为绵羊毛囊发育的重点研究对象。

旨在从基因水平分析LncRNA对公母滩羊肌肉发育的影响,因肌肉的生长发育是养殖业经济效益的重要指标,而骨骼肌的发育与产肉性能显著相关。为初步揭示影响肌肉发育差异的分子机理,从而进行转录组测序分析,筛选与绵羊肌肉发育相关的LncRNA。通过对公母滩羊各3 头(8月龄)的背最长肌组织进行全转录组测序(RNA-seq)和分析,从而筛选出可能与滩羊肌肉发育相关的LncRNA。结果显示:鉴定到的8 513个LncRNAs中共筛选出45个组间差异表达LncRNAs,其中18个上调,27个下调。预测DELncRNA的co_location靶基因并进行GO功能富集分析结果显示:靶基因显著富集在268个GO条目中,其中有促生长激素分泌细胞分化、典型的Wnt受体信号通路参与对细胞凋亡过程的负向调节、对生长激素分泌的正向调节、cAMP介导的信号传递等条目;KEGG通路富集分析结果表明,DEGs富集在AMPK、NF-KB、PI3K-AKT、MAPK、cAMP、FOXO等信号通路,进一步筛选出TCONS_00017263、TCONS_00147966、TCONS_00163484、TCONS_00079802、TCONS_00079803这5个可能参与肌肉发育相关的LncRNA。对随机挑选的6个DELs进行实时荧光定量PCR验证,其结果的表达趋势与转录组测序结果趋势一致,进一步验证了测序结果的准确性。研究获得的这些DELncRNA可能造成了滩羊公母肌肉生长发育上的差异,同时这些相关LncRNA为调控肌肉发育提供了更多信息,并为今后宁夏地区不同性别滩羊肉用性能的分子育种提供了科学依据。

牛肉大理石花纹特征是由多基因调控的重要肉质性状,是衡量高档牛肉品质的条件之一。LncRNA是一种重要的非编码RNA,在调节脂肪沉积的相关生物学过程中发挥重要作用。为了解lncRNA在肉牛不同大理石花纹表型中的潜在生物学作用,采集高(A5)、低(A1)2种极端等级大理石花纹的杂交和牛背最长肌组织,利用高通量测序方法检测与肉质大理石花纹相关的差异lncRNA,预测差异lncRNA反式作用靶基因,并对其进行功能富集分析。结果表明,在2个等级大理石花纹牛肉组织中共筛选出45个显著差异lncRNA,其中在高等级大理石花纹组织中分别有21,24个显著上调及下调的lncRNA,包括MSTRG.9509.3、ENSBTAT00000077612、ENSBTAT00000072841等与脂肪沉积相关的lncRNA。对反式作用靶基因的功能富集分析表明,预测靶基因显著富集到脂多糖结合、脂肪分解等脂肪沉积相关的生物学过程。差异lncRNA可能通过反式作用靶向脂肪沉积相关基因(FABP4、PLIN1、LIPE等)参与调节肉牛大理石花纹表型特征。检测到的牛肉大理石花纹相关差异lncRNA、预测靶基因及其富集通路将为拓展对非编码RNA生物学功能的认识及其与牛肉大理石花纹特征的关系奠定基础,也为农业家畜的优质性状解析与新品种培育提供参考。

利用蛋白质组学的方法对娟犏牛奶与牦牛奶乳清和乳脂球膜(MFGM)相同蛋白进行分析,而娟犏牛产奶量高于牦牛,若娟犏牛奶的功能与牦牛奶相近,将提高当地牧民的经济水平。通过离心法分离乳清与乳脂,分别提取蛋白;通过串联质量标签(TMT)技术,进行蛋白质定性与定量分析得到相同蛋白;对相同蛋白进行GO功能注释、KEGG代谢通路、蛋白互作等生物信息学分析。结果表明,利用标记定量蛋白质组学技术在娟犏牛奶与牦牛奶中共鉴定到651种乳清蛋白和990种MFGM蛋白,筛选出298种乳清相同蛋白,283种MFGM相同蛋白。GO注释分析发现,鉴定的娟犏牛奶与牦牛奶乳清相同蛋白主要参与的生物过程是内肽酶活性的负调控、免疫应答和免疫球蛋白产生,MFGM相同蛋白参与的生物过程主要是内肽酶活性的负调控和补体激活,经典途径乳清与MFGM相同蛋白定位的细胞成分主要是胞外间隙和胞外区,参与的分子功能主要是三磷酸鸟苷(GTP)酶活性、GTP结合。KEGG富集分析发现,娟犏牛奶与牦牛奶乳清与MFGM相同蛋白主要富集的途径包括补体和凝血级联反应、吞噬体和内质网中的蛋白加工。娟犏牛奶和牦牛奶中丰度较高的蛋白显示出其在免疫和促进营养吸收等方面表现优异,然而,娟犏牛产奶量高于牦牛,这将增加当地牧民的经济收入,也为人们提供更多有价值的高原奶制品。

在乳制品的开发过程中,乳蛋白是评估牛乳营养价值的重要指标。饲料配方优化是当下实现奶牛生产提质增效的重点工作之一。目前,饲喂过瘤胃氨基酸虽是提高奶牛乳蛋白合成最直接且高效的途径,但多数研究仅限于单一的限制性氨基酸,忽略了对氨基酸营养平衡体系的认识。在奶牛机体内,氨基酸营养作为乳蛋白合成的底物与信号物质,影响着乳腺对血液氨基酸的吸收与利用,但其分子代谢机制尚不明晰。本研究主要从氨基酸对奶牛乳腺蛋白合成的影响及调控两方面进行分析,首先概述了乳蛋白合成的基本途径,必需氨基酸、非必需氨基酸、组合必需氨基酸对乳蛋白产量及浓度的影响;其次详细介绍了必需氨基酸与组合必需氨基酸的供给对奶牛采食量、血液氨基酸浓度、血流量、乳腺细胞的影响,同时在细胞分子角度讨论了乳腺细胞培养所需氨基酸的最优添加剂量,以及必需氨基酸对氨基酸转运载体和信号通路的特异性调节。综上,通过对奶牛乳腺蛋白合成影响因素和分子调控机制的探讨,有助于优化饲料中理想的氨基酸配比与科学的生产模式,为氨基酸营养提高乳蛋白合成的相关研究提供理论参考。

旨在初步分析猪CRYBB2的启动子活性以及转录调控元件。利用生物信息学分析、PCR扩增、基因克隆、细胞转染、双荧光素酶活性分析等方法,获得了CRYBB2启动子区域的序列特征,构建了不同片段长度的CRYBB2启动子区的双荧光素酶报告基因载体并分析了其荧光素酶活性,进而确定了CRYBB2的核心启动子区域以及关键的调控区域,最后还预测了关键调控区域的转录因子及其结合位点。结果表明,CRYBB2候选启动子区可能包含4个核心启动子以及1个CpG岛,-52~-3 bp可能为CRYBB2基因的核心启动子区域,-505~-19 bp为CRYBB2基因启动子的关键调控区域,且发挥正向调节作用,而-2 060~-505 bp不存在任何对CRYBB2基因启动子活性有影响的调控元件;CRYBB2启动子的关键调控区域包含多个潜在的转录因子结合位点,如TBP、NFIA、FOXP1、NKX2-8、KLF4、Tcf3、Crx、SNAI3、Rfx1和CREB1等。为进一步研究猪CRYBB2的表达机制奠定了基础。

旨在通过测定Prdm9基因锌指域序列,探索四川3个黑绵羊群体间的亲缘关系。采集黑绵羊群体抗凝全血,提取基因组DNA,用PCR特异扩增Prdm9基因锌指域,进一步通过克隆测序以分析遗传多样性。结果显示,黑绵羊中鉴定出存在9种锌指,锌指间存在1~5个氨基酸差异,共构成5种Prdm9锌指域,分别定义为不同的等位基因(A、B、C、D和E),其中A~D包含8个锌指,这是试验黑绵羊Prdm9锌指域的主要类型,E包含9个锌指且仅发现于盐源黑绵羊中,其等位基因频率仅为0.050。这些等位基因形成6种基因型,包括AA、AC、BB、BD、CC和EE,在布拖黑绵羊和普格黑绵羊中均检测到4种基因型,而盐源黑绵羊中有6种,且BB和EE仅在该群体中观察到。Prdm9的等位基因频率和PIC值在3个黑绵羊群体中存在不同程度差异,有较丰富的遗传多态性,其中盐源黑绵羊相对最丰富。3个黑绵羊群体Prdm9锌指域的等位基因频率分布均极显著偏离哈代-温伯格平衡 (P<0.01),提示它们在育种中受到较大的人工选择影响。综上所述,黑绵羊群体中Prdm9有较丰富的遗传多样性,3个群体间亲缘关系均较近。

为了研究细菌素协同益生菌不同添加组合对肉鸡生长性能、屠宰性能、肠道组织形态及肠道菌群的影响。选取一日龄爱拔益加(AA)肉公雏300只,随机分为5个组,每组6个重复,每个重复10只,A组(对照组)饲喂基础饲粮,B组(细菌素50+益生菌50)在基础饲粮中添加细菌素2.57 mL/kg、益生菌0.84 g/kg,C组(细菌素100+益生菌100)在基础饲粮中添加细菌素5.13 mL/kg、益生菌1.68 g/kg,D组(细菌素150+益生菌150)在基础饲粮中添加细菌素7.7 mL/kg、益生菌2.52 g/kg,E组(抗生素50)在基础饲粮中添加金霉素50 mg/kg。试验分为第1阶段(1~21日龄)和第2阶段(22~42日龄),试验期为42 d。结果发现,在22~42日龄和1~42日龄,D组平均日增质量显著高于A组(P<0.05),料质量比显著降低(P<0.05)。D组心脏质量显著高于A组(P<0.05),C组肝脏质量显著高于A组(P<0.05)。与A组相比,C、D、E组十二指肠绒毛高度显著提高(P<0.05)。与A组相比,D组厚壁菌门相对丰度有所提高,拟杆菌门相对丰度有所降低,C、D、E组变形菌门相对丰度均高于B组。在属水平上,D组瘤胃球菌属相对丰度显著高于其他组(P<0.05)。饲粮中细菌素协同益生菌的添加提高了白羽肉鸡生长性能、改善了肉鸡肠道菌群结构、促进了肠道的健康发育、提高了肉鸡心脏、肝脏质量,以D组(细菌素150+益生菌150组)添加水平为宜。

旨在了解牦牛铁蛋白轻链(FTL)基因的结构与功能,以及在不同年龄段8个组织中的表达规律。以成年(36月龄)美仁牦牛肝脏组织cDNA为模板,克隆FTL基因的编码区序列,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术检测FTL基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、脂肪、睾丸中的相对表达量。结果表明,美仁牦牛FTL基因的CDS区为528 bp,共编码175个氨基酸,与野牦牛和牛的亲缘关系最近(99.8%);FTL蛋白为稳定亲水性分泌蛋白,不存在信号肽和跨膜结构,主要分布在细胞质中,蛋白的二级结构以α-螺旋为主,主要与FTH1、SCARA5、NCOA4等蛋白存在相互作用。qRT-PCR结果显示, FTL基因在成年牛的表达量依次为肝脏、肾脏、睾丸,脾脏、肺脏、脂肪、背最长肌、心脏,在7日龄犊牛的脂肪和背最长肌组织中表达最高,成年牛中肝脏组织表达量最高;通过2个阶段比对发现,脂肪、背最长肌和心脏组织的表达量随美仁牦牛年龄的增长呈下降趋势,而肺脏、脾脏、睾丸、肾脏和肝脏组织的表达量随年龄的增长而升高。

旨在通过mtDNA ND1探究6个西藏特色牦牛群体的遗传多样性、系统进化及亲缘关系,为西藏牦牛的遗传多样性、历史演化以及遗传资源保护与利用等提供理论依据。利用PCR和直接测序法分别测定了西藏帕里牦牛、嘉黎牦牛、工布江达牦牛、斯布牦牛、江达牦牛、类乌齐牦牛6个群体共95头个体ND1基因蛋白质编码区(CDS)序列,利用DNAMAN、DNASP 5.1、Mega 7.0、Arlequin 3.5.2等软件分析其序列多态性、单倍型多样性、遗传距离等,并构建单倍型网络图及系统发育树。结果表明,西藏牦牛群体ND1基因CDS区序列长度均为956 bp,共检测获得78个变异位点和16种单倍型,平均单倍型多样性(Hd)及核苷酸多样性(Pi)分别为0.670和0.004 21,Tajima's D均为负值;根据群体遗传差异的分子方差分析可知,西藏牦牛群体内的变异程度大于群体间变异;斯布牦牛与嘉黎牦牛之间的分化程度较大,其余大部分群体间的分化程度为中等或较弱。此外,通过聚类分析发现,类乌齐牦牛单独聚为一类,而嘉黎牦牛、工布江达牦牛、斯布牦牛、江达牦牛先聚为一类,然后再与帕里牦牛聚为一大类;16种单倍型可分为2个聚类簇,说明西藏牦牛可能存在2个母系起源;与其他牛种进行聚类分析,发现家牦牛、爪哇野牛和普通牛可能是西藏牦牛的混合母系起源。西藏牦牛遗传多样性十分丰富,其中类乌齐牦牛遗传多样性最丰富,6个牦牛群体存在2个母系起源。

旨在研究不同NDF水平开食料对羔羊生长轴及十二指肠生长相关基因表达的影响,以期为羔羊开食料适宜NDF水平提供参考。选用36只湖羊公羔,随机分为15%和25% NDF水平组。56日龄时,每组选择6只羔羊屠宰,称量组织器官质量,并测定相关基因的表达量。结果表明:不同NDF水平开食料对组织器官的质量和指数均无显著影响(P>0.05);NDF水平15%组羔羊下丘脑生长激素释放激素(GHRH)、肝脏胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、十二指肠IGF-1和十二指肠胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)表达量均显著高于25%组(P<0.05);NDF水平25%组垂体生长激素(GH)和十二指肠生长激素受体(GHR)表达量极显著高于15%组(P<0.01);羔羊平均日增质量与下丘脑GHRH表达量极显著负相关(P<0.01)、与肝脏GHR、十二指肠IGF-1表达量显著负相关(P<0.05),与垂体GH、十二指肠GHR表达量显著正相关(P<0.05);垂体GH与肝脏GHR、IGF-1、十二指肠IGF-1、IGF-1R表达量显著或极显著负相关(P<0.05或P<0.01),与十二指肠GHR表达量极显著正相关(P<0.01);肝脏GHR与肝脏IGF-1、十二指肠IGF-1表达量极显著正相关(P<0.01),与十二指肠GHR表达量极显著负相关(P<0.01)。综上所述,与15%水平组相比,饲喂25% NDF水平开食料更能提高羔羊生长轴GH-GHR水平相关基因的表达。

旨在通过对崇仁麻鸡背部皮肤毛囊组织的转录组学分析,筛选关键的差异表达基因和信号通路,探讨鸡皮肤毛囊性状的分子调控机制。采用TRIzol法提取皮肤毛囊组织总RNA,通过Illumina平台进行转录组高通量测序(RNA-Seq)。最后采用实时荧光定量的方法对转录组测序进行验证。研究结果如下:共筛选出了3 856个差异表达基因,在公鸡(BGB vs YGB)比较组合中筛选出了971个差异表达基因,其中274个表达上调,697个表达下调。在母鸡(BMB vs YMB)比较组合中筛选出了3 529个差异表达基因,其中1 477个 上调,2 052个下调。在公鸡、母鸡共同的差异表达基因中筛选出了3个与皮肤毛囊性状有关的高表达基因KRT75、KRT6A和KRT14。在GO功能显著富集中,BGB vs YGB比较组合富集到了516个GO term,BMB vs YMB比较组合富集到了1 020个GO term,基因主要集中参与细胞黏附等活动。显著富集了多条KEGG通路,在BGB vs YGB比较组合中富集了8条显著的KEGG通路,在BMB vs YMB比较组合中富集了20条显著的KEGG通路,筛选出了3条关键通路Wnt信号传导途径、神经活性配体-受体调控通路和TGF-β调控通路。荧光定量结果显示,随机选取的5个差异基因在皮肤毛囊中的表达与RNA-Seq走向趋势一致。综上所述,筛选的KRT75、KRT6A、KRT14基因可能影响鸡皮肤毛囊性状;神经活性配体-受体调控通路、Wnt信号通路和TGF-β信号通路均是调控鸡皮肤毛囊性状的重要通路。

旨在获得C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪血清炎症因子含量、脾脏病理变化及转录组表达谱特征,为其防治提供参考。选择健康状况良好、体质量相近的7日龄二元仔猪6头,随机分为2组,即对照组(CS)和处理组(TS)。TS组每头仔猪每天灌服1 mL菌液(1×10⁹ cfu/mL),连续5 d,CS组仔猪灌服不含菌液的培养液,感染后0,1,3,5 d采集血液分离血清,用ELISA方法检测IL-8、IFN-α和IFN-γ含量。试验结束后屠宰仔猪采集脾脏,进行HE染色和RNA-Seq测序,对测序获得的差异表达基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,并采用RT-qPCR检测仔猪感染C型产气荚膜梭菌过程中关键差异表达基因的表达量。结果表明:TS组仔猪脾脏出现明显炎症,中性粒细胞浸润,伴有变性及坏死的实质细胞;第3,5天CS组血清中IL-8、IFN-α和IFN-γ含量极显著低于(P<0.01)TS组;TS组与CS组间有1 079个差异表达基因,上调583个,下调496个;差异表达基因富集的GO功能主要有细胞对β干扰素的反应、细胞对DNA损伤刺激的反应、炎症反应的负调控等,富集的KEGG信号通路主要有肺结核、乙型肝炎、B细胞受体等;抵抗C型产气荚膜梭菌感染的候选基因(如JAK3、TLR3、ILF2、CXXC1等)RNA-Seq结果与RT-qPCR结果一致。以上结果表明,JAK3、TLR3等基因通过关键信号通路可能在仔猪脾脏抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中发挥了重要功能。