旨在初探BMF基因在小尾寒羊卵泡发育过程中的生物学功能,为将来深入探索其调控机理提供理论依据。对小尾寒羊实施同期发情,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)及免疫荧光染色(IF)方法检测BMF基因及其编码蛋白在不同生理阶段卵巢中的表达量;随后分离不同直径的卵泡,分析目的基因在大、中、小卵泡中的表达差异。结果显示,BMF mRNA在撤栓后42 h卵巢中的表达量显著高于撤栓后18 h(P<0.05),其编码蛋白表达结果与mRNA基本一致;BMF蛋白主要表达于卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中;进一步分离卵泡,发现BMF基因及其编码蛋白表达量均在中卵泡中显著高于大卵泡和小卵泡(P<0.05)。以上结果表明,BMF基因可能参与卵巢周期性活动,在卵泡发育过程中发挥重要作用。

为了深入地讨论牦牛ANXA5基因序列的特点,阐述其组织及细胞表达特性,通过采集牦牛不同组织样品,如心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等,提取总RNA。采用PCR、生物信息学软件、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术对牦牛ANXA5基因进行克隆、序列分析及表达特性研究。结果显示,牦牛ANXA5基因CDS区长为966 bp,共编码321个氨基酸。与黄牛比较,发现共有6个碱基突变存在于牦牛ANXA5基因中。黄牛与牦牛的核苷酸和氨基酸同源性大于99%,与其他哺乳动物进行氨基酸同源性比较,结果也均在90%以上,说明ANXA5基因在长期进化中保守。在牦牛的肺组织中,ANXA5基因表达量最高,与其他组织差异极显著(P<0.01);在子宫和输卵管组织中表达量次之。ANXA5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中均有表达,且表达量随时间增长而逐渐升高。结果显示,培养72 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24,36 h颗粒细胞(P<0.01);培养48 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24 h颗粒细胞(P<0.01),显著高于培养36 h颗粒细胞(P<0.05),表明ANXA5在黄体化的颗粒细胞中表达量更高。然而,免疫组化结果显示,ANXA5的亚细胞定位于细胞质,在黄体细胞中表达较高。

利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用,首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定,获得了具有绿色荧光信号的阳性菌株并检测其荧光稳定性,命名为Sal-pPpagC-EGFP。接着在同等条件下对比荧光菌株和野生菌株(WT)的生长特性,通过小鼠感染试验检测EGFP基因的插入对荧光菌株毒力有无明显影响,以分析荧光菌株的生物学特性;应用荧光显微镜和间接免疫荧光法检测荧光菌株在猪肺泡巨噬细胞3D4/21吞噬溶酶体中的定位情况。结果显示,在不同时间点,EGFP标记的鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,且所带荧光不受抗性选择的影响,可稳定遗传。相同培养条件下,荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP生长曲线的变化趋势与野生株基本相同。另外,经过改良寇氏法计算出的LD₅₀与野生株相比无显著差异(P>0.05),说明EGFP基因的插入对荧光菌株毒力无明显影响。荧光菌株在感染猪肺泡巨噬细胞后,吞噬溶酶体内可观察到标记菌株,并随着时间增加菌株数量呈现增长趋势。表明荧光菌株除了具备发光特性外,其他生物学性状没有明显改变。

为探究HIF-1α在CoCl₂影响奶牛胎盘滋养层细胞迁移及侵袭变化中的作用,揭示奶牛胎盘在缺氧条件下的形成机制,从早期妊娠奶牛胎盘中分离纯化奶牛胎盘滋养层细胞(BTCs),用吉姆萨染色法观察细胞形态,免疫荧光法检测上皮细胞标志蛋白角蛋白7(CK7)、Thy/CD90蛋白表达,后将pCI-neo-hTERT质粒转染至BTCs,用qPCR和Western Blot法检测细胞TERT mRNA及蛋白表达,用CCK8法测定细胞增殖率,用ELISA法检测细胞分泌胎盘催乳素(PL)的能力,进一步利用siRNA沉默细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,ELISA法检测细胞分泌血管内皮生长因子(VEGFA)能力,通过划痕试验及Transwell检测细胞迁移及侵袭能力。结果显示,分离纯化的BTCs为典型上皮样细胞,存在一定数量的双核细胞,并表达上皮细胞标志蛋白CK7,未见Thy/CD90表达,转染后的细胞可稳定表达端粒酶(TERT)mRNA及蛋白,连续传代50代未见细胞老化现象,且增殖率显著高于原代BTCs(P<0.05),分泌PL能力较原代BTCs无显著差异(P>0.05)。经CoCl₂处理后发现,BTCs细胞活力随CoCl₂处理浓度及时间的增加而降低,HIF-1α mRNA及蛋白表达随CoCl₂浓度的增加而减少(P<0.05),400 μmol/L CoCl₂作用于BTCs 24 h建立缺氧模型,VEGFA分泌和迁移侵袭能力在BTCs缺氧状态下显著升高(P<0.05),而将HIF-1α基因沉默后显著降低了BTCs分泌VEGFA和迁移侵袭能力(P<0.05)。总之,通过外源性TERT基因转导建立了永生化的BTCs(Bovine trophoblast cells),永生化后的细胞具有与原代细胞相似的生物学特性,BTCs在缺氧条件下具有更强的VEGFA分泌能力及迁移侵袭能力,且与HIF-1α基因表达的上调有关。

旨在筛选西门塔尔牛与安格斯牛肾周脂肪的差异表达基因,分析2个品种牛血清指标差异,以期对肾周脂肪的脂质代谢和内分泌功能进行解析,为牛品种选育打下基础。选取相同月龄的西门塔尔牛和安格斯牛各3头,饲喂前采集空腹血液分离血清进行血清生化指标测定;屠宰后,采取相同大小的肾周脂肪,提取总RNA后进行转录组测序分析,使用DEGseq方法对各个样品的基因表达水平进行差异检测,对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析,并使用实时荧光定量PCR验证测序结果。结果表明,安格斯牛血清中白蛋白(ALB2)、尿素氮(UREAL)和葡萄糖(GLUC3)含量显著低于西门塔尔牛(P<0.05),甘油三酯(TRIGL)含量显著高于西门塔尔牛(P<0.05)。转录组结果显示,2个品种牛肾周脂肪间的差异表达基因为1 743,其中1 361个基因上调表达,382个基因下调表达。差异表达基因GO功能富集结果显示,差异基因显著富集到52个生物学功能,主要与细胞过程和细胞有关;KEGG富集结果显示,差异表达基因主要在Fat digestion and absorption、cAMP、PPAR和Rap1等信号通路显著富集,最终筛选出与脂质代谢相关的基因SCD5、APOA4、PTX3、OLR1和PRKCZ。通过实时荧光定量PCR测定差异基因的相对表达量,结果显示,测序结果和实时荧光定量PCR结果一致,说明测序结果可靠,研究获得的差异基因可作为肉牛品种培育的基础资料。

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点,以秦川牛为研究对象,利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列,利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征,以GAPDH为内参基因,采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示,秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸,CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性,且与瘤牛的同源性最高;CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白,主要由α-螺旋及不规则卷曲构成;亚细胞定位分析表明,CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体;蛋白互作分析表明,其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用,提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程;组织表达分析表明,CDS1基因在各个组织均有广泛表达,且在睾丸中表达量最高,在脑的表达水平也较高,二者均显著高于其他组织的表达水平,在心的表达量最低。

旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析;在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下,于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞,提取细胞总RNA,逆转录 PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因,确定ORFV113的动态转录水平;以ORFV-JS株基因组为模板,PCR扩增ORFV113基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV113重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞,通过Western Blotting 鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明,ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守,属于ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒,ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,大小为60~70 ku,比预测分子量大10~20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰;亚细胞定位研究表明,ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上,本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养,经电镜观察和IFA试验进行鉴定,通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增,SnapGene V4进行序列拼接和比对,利用DNAMAN V6对基因组末端5'UTR和3'UTR二级结构进行展示和比较,应用MEGA V7进行遗传进化分析,最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒,均鉴定为PPV1型毒株,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致,其中5'-UTR序列高度保守,呈Y型结构;而3'-UTR呈U型结构,个别碱基有所差异;VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示,突变株生长趋势相对较快,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。

为探索TNNI1、TNNI3在麦洼牦牛横纹肌中的表达模式,选取不同年龄麦洼牦牛臀肌、心肌组织,观察其形态学变化,开展了不同年龄麦洼牦牛TNNI1基因在臀肌组织中的表达趋势及与肌纤维性状的关联分析,同时对TNNI1、TNNI3在心肌中的mRNA和蛋白差异表达及蛋白定位进行了相关性分析。结果表明,随着牦牛年龄增长,肌纤维直径及密度存在一定特征性变化,其中肌纤维直径随年龄的增长显著增加,肌纤维密度则发生相反的变化。成年牦牛TNNI1基因在臀肌组织中的mRNA表达水平显著高于犊牛及断奶犊牛,变化趋势具体为成年牛>犊牛>断奶犊牛;且臀肌中TNNI1 mRNA表达水平与肌纤维直径极显著正相关,与肌纤维密度显著负相关。TNNI1 在心肌中的mRNA表达水平随牦牛年龄的增大而降低,而TNNI3则表现为先升高后降低的趋势,且TNNI1在犊牛期mRNA表达水平最高,TNNI3则随年龄增长呈上调趋势。TNNI1、TNNI3蛋白在心肌组织中的表达量随牦牛年龄的增长逐渐减小,且TNNI3 mRNA表达量随牦牛年龄的增长逐渐降低,与蛋白表达趋势一致。TNNI1、TNNI3对不同年龄麦洼牦牛肌肉组织的生长发育具有显著调控作用,且在不同年龄牦牛肌肉组织中的表达水平存在差异。

旨在克隆牦牛驱动蛋白家族成员2A基因 (KIF2A),探究其在牦牛不同组织中的表达模式,以及在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达规律,以3~4岁健康、未妊娠母牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、子宫和卵巢组织(n=5)为研究材料,使用RT-PCR技术获得KIF2A基因的编码区序列(CDS),运用MEGA 7.0、SWISS-MODEL等软件分析其生物学特性。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测KIF2A在牦牛各组织中的表达水平;采用免疫组织化学技术分析KIF2A在牦牛不同直径卵泡中的表达模式及定位。将卵泡按照直径的大小分为3组:小(1.0~2.9 mm)、中(3.0~5.9 mm)、大(6.0~9.0 mm)卵泡;RT-qPCR检测KIF2A基因在不同发育时期卵泡中颗粒细胞、卵母细胞减数分裂3个关键时期的表达特性。结果显示,KIF2A基因序列长为1 964 bp,其中CDS为1 530 bp,编码509个氨基酸,KIF2A蛋白总体带负电,属于疏水性蛋白。KIF2A基因在牦牛各组织中广泛表达,牦牛KIF2A蛋白主要定位于颗粒细胞,且伴随着卵泡的生长发育其在不同直径大小卵泡颗粒细胞中mRNA表达量呈上升趋势。在牦牛卵母细胞成熟过程中,KIF2A基因的表达具有时序特征,其mRNA的表达量呈下降趋势,GⅤ期显著高于MⅠ期和MⅡ期。综上所述,KIF2A可能参与调控牦牛卵泡发育和卵母细胞的成熟过程。

旨在分析不同比例花椒籽替代部分玉米饲喂三元杂交育肥猪不同组织FABP2的差异表达,寻找肌内脂肪沉积的关键基因;同时克隆三元杂交育肥猪FABP2编码区序列,并用生物信息学方法对其进行分析。选取288头90日龄杜×长×大三元杂交育肥猪(33 kg),随机分为4组,每组4个重复,每个重复18头猪;对照组饲喂基础日粮,试验组分别用花椒籽代替饲粮中2.5%(试验Ⅰ组),5.0%(试验Ⅱ组),7.5%(试验Ⅲ组)的玉米,预试验7 d,正试期100 d。采用qRT-PCR检测试验组不同组织中FABP2的相对表达量,同时克隆三元杂交育肥猪FABP2编码区,利用生物信息学分析软件,预测FABP2蛋白理化性质、结构域和磷酸化激酶位点等。结果表明:FABP2在各组织中均有不同程度表达,其中空肠和肝脏中FABP2显著高表达。与对照组相比,各试验组心脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠和盲肠组织中FABP2显著下调表达;试验Ⅱ组和试验Ⅲ组脾脏和回肠组织中FABP2显著上调表达;试验Ⅰ组肝脏、结肠、直肠和背肌组织中FABP2显著上调表达,说明饲粮中添加花椒籽对三元杂交育肥猪FABP2基因的表达谱具有显著影响。成功克隆并鉴定出三元杂交育肥猪FABP2编码区全长(399 bp),编码132个氨基酸,存在2处错义突变;FABP2蛋白是一种酸性稳定的非分泌蛋白,二级结构主要由延伸链和无规则卷曲构成,含有一个Lipocalin-FABP2超家族保守结构域和3个无序化区域。

精子发生是一个复杂的过程,目前家禽的精子发生机制尚未彻底阐明。因此,鉴定调控种公鸡精子发生的候选基因,对于探究家禽的精子发生机制具有重要意义。对8只海兰褐公鸡的睾丸与附睾样本进行miRNA测序,筛选差异表达miRNA并对其进行靶基因预测和功能分析。结果表明,在睾丸和附睾样本中共检测到718个miRNA,其中109个miRNA差异表达。这些差异表达的miRNA中有40个在睾丸组织中显著上调,69个在附睾组织中显著上调。对差异表达miRNA进行靶基因预测并取交集,共得到11 077个靶基因,其中在睾丸组织中上调差异表达miRNA的靶基因有4 784个,在附睾组织中上调差异表达miRNA的靶基因有6 293个。对差异表达miRNA的靶基因进行功能分析,GO富集分析结果表明,睾丸和附睾中靶基因主要富集于细胞过程的负调节、细胞生物合成过程的调节、生物合成过程的调节等生物学过程。KEGG分析结果表明,与精子发生相关的靶基因显著富集于MAPK信号通路。本研究发现miR-31、miR-499、miR-375和miR-34c可能是调控鸡精子发生的候选基因。

利用生物信息学方法分析鸡ITGB1基因结构及其编码蛋白理化性质,结构位点及细胞定位等,旨在进一步探究该基因功能与潜在用途。同时从GenBank中下载鸡、鹅、鸭、火鸡、人、猪、兔、小鼠、大鼠、绵羊、黑猩猩11个物种的ITGB1基因CDS序列为材料,对该11个物种的ITGB1蛋白序列进行同源性和系统进化分析。结果表明,该基因CDS区长度为2 412 bp,共编码803个氨基酸,其相对分子质量为88 618.48,理论等电点为5.14;其是一个亲水性的稳定蛋白,有信号肽;蛋白二级结构上,含有162个α-螺旋, 459个无规则卷曲,182伸展条和一个跨膜结构。鸡ITGB1基因的编码蛋白经同源性比对,发现其与鹅、火鸡、鸭的ITGB1蛋白高度同源。利用生物信息学方法对ITGB1基因及其表达的蛋白进行研究,有助于理解该基因在鸡这一物种上的相关作用,为进一步开发利用鸡ITGB1基因进行禽业生产、禽病防控以及分子育种提供了参考依据。

旨在探究非洲猪瘟(ASFV)病毒感染猪肺泡巨噬细胞后在体内的作用方式。以感染ASFV的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的mRNAs和microRNAs测序数据为基础,利用生物信息学软件对数据进行处理,得到了一批差异表达基因;利用基因功能富集和对应蛋白互作解析生物学通路;再利用mRNAs和microRNAs的互作方式确认重要的靶标关系。结果表明:ASFV改变了PAMs中1 181个基因的表达量;主要调控宿主在能量代谢过程(如脂质分解、有机羟基化合物代谢、碳水化合物分解代谢、一元羧酸代谢),以及细胞周期过程(如有丝分裂细胞周期过程、细胞周期相变、细胞周期的正向调控);ASFV还引起了PAMs中25个microRNAs的差异表达,包括病毒相关的miR-27b-3p、miR-193a-3p、miR-132等;而miR-27b-3p作为表达丰度最高的差异microRNA,它与一些重要的差异基因(如PLK2、HSP90AA1等)存在着靶标关系,进而调控机体免疫和细胞周期相关通路。综上所述,ASFV感染PAMs后的作用方式包括破坏宿主在能量代谢和细胞周期方面的稳态,以及打破了机体microRNAs调节平衡;其中miR-27b-3p等小RNAs可以作为ASFV研究的靶向分子。

为了更好地保护和利用盆周山地猪这一遗传资源,利用猪50K SNP芯片,对盆周山地猪保种群内所含的152头健康种猪进行了SNP检测,利用Plink软件计算群体的多态性标记比例、期望杂合度、观测杂合度,SNeP(V1.1)软件计算有效群体含量;利用Plink软件构建状态同源(IBS)矩阵,Gamatrix(V2)软件构建基因组关系G矩阵;利用Mega X(V10.0)分析盆周山地猪保种群家系结构;利用Plink软件计算每个样本的连续性纯合片段(ROH)个数和长度,并计算基于ROH的近交系数。结果表明,整个盆周山地猪保种群体的多态性标记比例为0.660 1,有效群体含量为7.4头;群体期望杂合度为0.289 2、观测杂合度为0.294 7;群体平均IBS遗传距离为(0.234 1± 0.027 3),公猪的平均IBS距离为(0.228 0±0.033 5);现有群体大致可分为5个包含公猪的家系和1个不含公猪的家系,家系A和D的公猪数量相对较少;在盆周山地猪保种群中共发现ROH片段3 737个,含21~25个ROH的个体数量占比最多(32.24%),ROH长度在100~200 Mb的个体数量占比最多(42.11%),群体平均近交系数为0.085。综上所述,盆周山地猪保种群体遗传多样性较丰富,但部分个体间存在较大的近交风险,群体家系较少,个别家系内公猪个体数量少,存在血统流失风险。

松果体-下丘脑-垂体-甲状腺轴(PHPTA)对动物的繁殖活动有重要的调节作用。为探讨Kiss1/GPR54系统在甘加藏羊PHPT轴的表达及其对繁殖活动的调控,选取24只处于发情周期内健康未孕的甘加藏羊作试验组,6只处于非繁殖季节的甘加藏羊作对照组,运用酶联免疫吸附法检测其血浆Kisspeptin动态变化,用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学方法检测视神经、松果体、下丘脑、垂体和甲状腺组织中Kiss1、GPR54 mRNA及其蛋白的表达与分布。结果显示:血浆Kisspeptin分泌量在发情后期显著高于其他时期(P<0.05),繁殖季节内各时期分泌量均显著高于非繁殖季节(P<0.05)。Kiss1、GPR54 mRNA及其蛋白在视神经、PHPT轴组织中均有表达:视神经Kiss1、GPR54 mRNA相对表达量在发情前期显著高于其余时期;松果体在Kiss1 mRNA及其蛋白乏情期达到最大值,显著高于繁殖周期;下丘脑和甲状腺Kiss1、GPR54 mRNA相对表达量均在发情后期显著升高(P<0.05);垂体组织中二者mRNA的相对表达量在发情期显著高于其他时期。免疫组织化学检测结果显示:在视神经中,Kisspeptin与GPR54分别主要分布在神经胶质细胞核与胞质中;松果体细胞胞质中二者均呈强阳性表达;在下丘脑中,Kisspeptin表达在神经内分泌小细胞和神经胶质细胞中,GPR54表达在神经内分泌小细胞胞质中;在垂体组织中,Kisspeptin和GPR54主要表达在嗜碱性细胞的胞质中;而在甲状腺中,二者主要表达在滤泡细胞胞质中。甘加藏羊发情周期血浆Kisspeptin的动态变化及Kiss1、GPR54在各组织中的差异表达,表明Kiss1/GPR54系统参与调节了甘加藏羊的生殖生理活动。

旨在利用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪背最长肌组织样本进行mRNA测序和差异分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键基因,从而为猪肉品质研究提供新的参考信息。采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌组织样本,提取其RNA,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对mRNA进行测序,并对获得的reads进行比对、注释和差异表达分析,用NOISeq筛选出差异表达基因并进行相关生物学功能富集分析。结果表明,从2个猪种间共筛选出了664个差异表达基因,其中,364个基因在松辽黑猪中高表达,300个基因在长白猪中高表达。通过对差异表达基因进行生物学功能分析,筛选出LPIN1、FADS1、FADS2、PLIN2、PPARGC1A、PRKAG2和ACSL1等基因参与脂类代谢和肌肉发育相关的调控,相关通路为脂肪酸代谢、PPAR信号通路、AMPK信号通路、胰岛素信号通路和脂肪细胞因子信号通路等。

旨在分析滩羊与杜泊羊和小尾寒羊肉品质变化和肌肉内基因的表达情况,初步揭示它们肉质性状差异的分子机理,为其他绵羊品种选育与改良提供理论依据。通过对8月龄杜泊羊、滩羊和小尾寒羊的肉品质分析比较,并采用Illumina HiSeq^TM 4000平台对背最长肌组织进行转录组测序和分析,挖掘它们肉质性状差异的相关调控基因。结果显示:共筛选出820个差异表达基因,其中杜泊羊与滩羊之间99个,杜泊羊与小尾寒羊之间436个,滩羊与小尾寒羊之间552个。对差异基因进行GO功能富集分析结果显示,各比较组分别显著富集在224,517,657个GO条目中;KEGG通路富集分析表明,DEGs富集在cAMP、MAPK、AMPK、嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸和脂肪酸代谢以及糖酵解/异生等信号通路,进一步筛选出FOS、PLA2G4E、LPIN1、AMPD1、AMPD3、NT5C1A、GPI、PFKM和PKM等与肉品质调控和风味物质代谢有关的候选基因。对随机挑选的几个差异基因进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,与转录组测序结果表达趋势一致,说明测序结果可靠,研究获得的这些差异基因可作为宁夏优质肉羊新品种(系)培育的基础资料。

为筛选猪总产仔数和产活仔数性状关键SNP分子标记或候选基因,采用Illumina porcine 50K芯片对同一猪场186头加系大白猪能繁母猪开展了全基因组SNP扫描,后又对扫描结果进行了质量控制、Beagle填充和SNP基因型分型,结合这些试验猪的表型性状测定和群体结构分析结果,进行全基因组关联分析(GWAS)。群体结构分析结果表明,试验所用的加系大白猪样本未出现群体分层现象;在18对(36条)常染色体上一共得到36 867个有效SNP标记,用于试验猪的GWAS分析。GWAS结果表明,这些加系大白猪所有胎次总产仔数共显著关联到2个SNP,分别为seq-rs323899658和seq-rs329781338,其中seq-rs329781338 SNP又注释到3个基因,分别为SSBP1、WEE2和KIAA1147。产活仔数共显著关联到7个SNP,分别为seq-rs81238474、seq-rs321377412、seq-rs340736313、seq-rs80782154、seq-rs81244816、seq-rs81467772和seq-rs329781338,这7个SNP中有5个SNP有基因注释,共注释到22个基因,分别为EphA1、TAS2R60、FAM131B、CLCN1、CASP2、TMEM139、TRBV21OR9-2、PRSS2、TRBV19、TRBV24-1、U6、SSBP1、WEE2、KIAA1147、NKX2-8、ALKBH3、HSD17B12、U6、HOMER2、WHAMM、FSD2和SCARNA15。候选基因GO功能和KEGG通路分析结果表明,这些基因GO功能中最显著的生物学过程为多生物过程的调控、分子功能为非跨膜/跨膜蛋白酪氨酸激酶活性,KEGG通路为错配修复。结合GWAS和基因功能注释结果,WEE2和EphA1基因可作为提高加系大白猪总产仔数和产活仔数的关键候选基因。

胴体生长发育是影响山羊养殖效益的重要评价指标,旨在通过RNA-Seq技术挖掘不同性别贵州白山羊生长发育的关键候选基因,为贵州白山羊生长发育研究提供理论依据,以同等饲养水平条件下贵州白山羊为研究对象,测定2周龄不同性别贵州白山羊的屠宰性能指标,通过背最长肌转录组分析,筛选差异表达基因,分析相关基因的信号通路,最后通过RT-qPCR对筛选的基因进行验证。结果表明,测序得到的Raw reads进行过滤后,6个样本共得到78.99 Gb Clean Data,单个样本获得Clean reads 在83 030 104~95 739 024条,各样本与参考基因组的比对效率在93.75%~94.79%,共获得25 089个表达基因,筛选差异表达基因共获得1 077个差异基因,其中194个为新发现转录本基因,发现的差异基因中563个在公羊背最长肌中表达显著上调,514个表达显著下调。对获得的1 077个差异基因进行GO功能富集分析,其中587个为显著富集(Q-value≥0.05),主要分为三大类35个亚类。KEGG信号通路分析发现,这些差异基因共参与243条信号通路,其中参与PI3K/AKT信号通路相关的基因最为富集,共注释到32个基因,其中17个注释基因显著上调,1个显著下调,且在该通路中COL4A1和COL4A2基因编码蛋白共表达估值最高,ITGAV基因编码蛋白互作最为丰富。筛选出6个与贵州白山羊背最长肌生长发育相关的差异表达基因进行验证,其中FHL3、WFIKKN2、SOX6基因在公羊背最长肌中为上调基因,QSOX2、MYH2、LAP基因为下调基因,RT-qPCR结果显示,这6个候选基因的mRNA表达趋势与转录组测序结果一致,且差异均较为显著(P<0.05),表明测序结果可靠。基于RNA-Seq技术筛选出不同性别贵州白山羊背最长肌的差异表达基因1 077个,其中194个为新发掘转录本基因,筛选的差异表达基因及PI3K/AKT信号通路与贵州白山羊背最长肌生长发育相关。

为了明确APOC3基因在山羊肌内脂肪细胞分化中的作用,采用RT-PCR技术克隆山羊APOC3基因序列,并通过在线软件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测山羊APOC3基因在各组织和不同分化阶段的肌内脂肪细胞中的表达规律;在利用双酶切法构建山羊APOC3过表达载体的基础上,利用油红O染色确定山羊APOC3基因过表达对肌内脂肪细胞脂滴聚集的影响,同时利用qPCR方法检测成脂分化标志基因mRNA的相对表达水平,进而明确其可能发挥作用的途径。结果表明,获得山羊APOC3的ORF区长294 bp,编码97个氨基酸,功能结构域区在第23-88个氨基酸处。山羊APOC3在心脏、肝脏、脾脏等14个组织中均有表达,且在肝脏中的表达量最高;山羊APOC3在诱导分化48 h表达量最高,极显著高于分化前;过表达山羊APOC3后肌内脂肪细胞中脂滴积聚增多,成脂分化标志基因SREBP1和CEBPβ的相对表达水平极显著上调,PPARγ的相对表达水平显著上调,而Pref-1相对表达水平显著下调。结果表明,山羊APOC3可能通过上调SREBP1、CEBPβ、PPARγ及下调Pref-1来发挥作用促进肌内脂肪细胞的分化。

为了探究施用有机肥对盐碱土壤脱盐效果的长期效应,以腐熟牛粪为改良材料,根据牛粪施用年限共设置4个处理,分别为:施用牛粪8,12,18 a,以未施用牛粪的作为对照。通过对土壤可溶性盐分组成、交换性盐基、有机质、容重、EC和pH值等指标的测定,定量化探讨牛粪对各个指标影响及其关系,阐明长期施用牛粪对盐碱土脱盐效果的影响。结果表明,长期施用牛粪显著降低了土壤HCO₃^-的含量,消除了CO₃^2-;降低了土壤容重,增加了土壤孔隙度和土壤有机质;降低了Na⁺含量,增加了土壤交换性Ca²⁺、可溶性K⁺和Mg²⁺含量。相关性分析表明:土壤ESP和pH值与交换性Na⁺、HCO₃^-和CO₃^2-含量呈显著正相关,土壤pH值与土壤有机质呈显著负相关关系。回归分析表明:影响钠吸附比的主要因素是可溶性Mg²⁺,其次是可溶性Na⁺,即:施用牛粪后,SAR的降低主要是由于可溶性Mg²⁺的增加和可溶性Na⁺的降低而引起的。相关性分析表明:牛粪的累积施用量与土壤pH值、EC、ESP和SAR等呈显著负相关。综上所述,每年施用牛粪导致了土壤pH值、碱化度、电导率和钠吸附比显著降低,这是由于土壤胶体上的Na⁺被游离的Ca²⁺替换,并且促进了土壤可溶性盐从土壤表层淋溶,降低了可溶性盐的含量,也使得可溶性盐的离子组成发生了变化。这些可能是每年施用有机肥导致土壤钙镁离子含量以及土壤孔隙度增加,土壤容重降低的结果。

脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)是脂肪水解过程中的主要限速酶,是调控细胞中甘油三酯和脂肪酸之间平衡的关键因子。为了分析奶山羊ATGL基因启动子的结构及转录调控机制,以奶山羊全血DNA为模板,通过PCR技术扩增出ATGL基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析;构建了5个不同长度的启动子缺失片段报告基因载体,通过转染奶山羊乳腺上皮细胞并检测其活性,确定其核心区域;分别用PPARG激动剂罗格列酮和SREBP1激动剂T0901317处理细胞,检测其对ATGL启动子活性的影响。结果表明,克隆得到奶山羊ATGL基因5'侧翼序列2 721 bp,包含转录起始位点上游2 024 bp。经在线软件分析发现,ATGL启动子含有真核生物启动子元件TATA-box和CpG岛;对转录因子结合位点预测发现,其上含有FOXO、SREBF1、PPARG、C/EBPα和E2F1等结合位点。启动子活性分析结果表明,ATGL启动子核心区域位于转录起始位点上游-256—+1位,且在-527—-256 位存在负调控元件。用罗格列酮和T0901317处理细胞后发现,二者均能显著上调ATGL启动子活性,且罗格列酮作用的区域为-527—-256 位,T0901317在-882—-527 位发挥作用,表明PPARG和SREBP1调控ATGL启动子活性。

为研究绵羊大肠杆菌性乳腺炎中乳腺成纤维细胞的损伤情况及TLR4的作用机制,通过体外培养获得原代绵羊乳腺成纤维细胞,大肠杆菌人工感染细胞建立大肠杆菌性乳腺炎细胞模型,分析大肠杆菌对细胞损伤的影响及TLR4在大肠杆菌性乳腺炎中的作用。采用酶消化法结合差速消化法获得原代绵羊乳腺成纤维细胞;MTT法检测细胞活力及TLR4阻断剂CLI-095的细胞毒性作用;乳酸脱氢酶法检测大肠杆菌对绵羊乳腺成纤维细胞的损伤情况并筛选最适MOI比值;qRT-PCR法检测caspase-3、TLR4的mRNA相对表达量及CLI-095的阻断效果;比色法检测细胞焦亡蛋白caspase-4,5 的酶活性;WB检测TLR4蛋白的相对表达量;平板活菌计数法检测CLI-095对大肠杆菌黏附绵羊乳腺成纤维细胞的影响。分离获得绵羊乳腺成纤维细胞,MTT测定结果显示,细胞活力良好;大肠杆菌以最适MOI=4:1感染绵羊乳腺成纤维细胞后,各时间段 LDH 释放量均显著升高;caspase-3 mRNA的相对表达量在感染1~3 h内显著上升,3 h后表达量显著下降;caspase-4,5 酶活性在感染1~3 h内升高,3 h后降低。TLR4的mRNA及蛋白表达量均显著上调,CLI-095可抑制大肠杆菌对细胞的黏附作用。大肠杆菌感染成纤维细胞后LDH释放量增加、caspase-3 基因表达上调、caspase-4,5酶活性升高,促进了绵羊乳腺成纤维细胞的损伤、凋亡及焦亡;大肠杆菌感染促进绵羊乳腺成纤维细胞内TLR4 mRNA及蛋白的表达;TLR4阻断剂CLI-095可能通过抑制 TLR4的表达抑制E.coli对细胞的黏附作用。

旨在研究低蛋白日粮对山羊胴体品质和肌肉氨基酸与脂肪酸组成以及肌源性调节因子基因表达的影响。选取24头生长期湘东黑山羊母羊,随机分为正常蛋白日粮组(CON组,CP:10.77%,n=12)与低蛋白日粮组(LP组,CP:5.52%,n =12),预试期25 d,正试期45 d。结果表明,LP组肌肉屠宰后24 h的肉色L^*值显著升高,而肌肉pH值和失水率等无显著差异;骨骼肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维比例无显著差异,仅LP组半腱肌肌纤维总平均横截面积呈现降低的趋势;LP组股外侧肌中缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸及总必需氨基酸的含量显著降低,异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、精氨酸和总氨基酸含量呈现下降趋势;半腱肌中谷氨酸的含量显著降低,苏氨酸和丝氨酸的含量呈现下降趋势; LP组半腱肌中二十碳二烯酸和二十二烯酸的含量显著降低;外侧肌中总多不饱和脂肪酸、油酸、花生四烯酸的含量显著降低;背最长肌中油酸的含量显著降低; LP组半腱肌 MYOD基因表达显著下调。综上表明,饲喂低蛋白日粮不影响肌纤维类型的转化与横截面积;日粮蛋白质缺乏会降低骨骼肌中氨基酸的沉积,同时减少肌肉多不饱和脂肪酸的沉积,影响山羊肌肉风味。

旨在获得CIDEB、CIDEC基因的CDS,检测该家族基因在山羊不同组织中的表达量,预测其互作蛋白,为进一步揭示CIDE家族基因在脂代谢中的调控网络提供参考。主要利用RT-PCR克隆获得山羊CIDEB、CIDEC基因序列并利用在线工具分析CIDE家族蛋白的生物学特性,并预测其互作蛋白。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了CIDE家族基因在山羊不同组织中的表达水平,并检测各互作蛋白在其表达水平最高的组织中的表达量,利用SPSS分析其表达量之间的相关性。克隆获得了CIDEB基因CDS区660 bp,共编码219个氨基酸,CIDEC基因CDS区714 bp,编码237个氨基酸。进化树分析显示,山羊CIDEA、CIDEB、CIDEC均与绵羊亲缘关系最近。RT-qPCR检测发现CIDEA、CIDEB、CIDEC基因分别在山羊瘤胃、肝脏、小肠中表达量最高。CIDEA与DFFB和ELOVL3在瘤胃中的表达量具有极显著相关性(P<0.01),与DIO2、TMEM26、PRDM16、PLIN1具有显著相关性(P<0.05)。CIDEB与DFFA和SDR39U1在肝脏中的表达量具有显著相关性(P<0.05)。CIDEC与PLIN2、GPLD1、ADIPOQ在小肠中的表达量具有显著相关性(P<0.05)。通过分析发现了与CIDE家族表达量具有相关性的基因,可为进一步揭示CIDE基因在脂质代谢中的作用及其调控网络提供理论基础,且CIDE家族蛋白均为脂滴相关蛋白,也可为进一步研究精确的脂滴形成机制提供参考。

旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上,成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞,Western Blot 鉴定ORFV118蛋白表达的正确性;流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响;RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平,并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示,成功扩增ORFV118基因,全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平;可抑制细胞的凋亡作用,且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平;对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用,而对IL-6和TNF-α呈促进作用。

为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响,利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h后采集精神沉郁的雏鸡脾脏检测组织载菌量并制作病理切片。选取缺失株Δhcp2b及野生株AE17感染脾脏组织进行转录组学测序,采用Real-time PCR进行测序结果鉴定;而后对差异表达基因进行GO分析、KEGG通路富集分析。结果显示,野生株AE17、缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b在脾脏组织载菌量差异不明显。组织切片观察发现,野生株AE17和缺失株Δhcp2b脾脏均出现组织间隙扩大,有充血现象出现。转录组学分析发现,缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏后,诱导了脾脏基因mRNA的差异表达,筛选到515个差异表达基因(330个基因下调表达,185个基因上调表达)。Real-time PCR结果发现,Δhcp2b感染雏鸡后,脾脏中IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因mRNA表达量下调,与测序结果变化趋势一致。GO分析发现,感染24 h雏鸡脾脏差异基因富集在膜、膜的组成、细胞外间隙部分等条目。KEGG分析发现,脾脏差异基因显著富集在内质网蛋白质加工过程的信号通路中。hcp2b基因对APEC在定植脾脏无影响,hcp2b通过影响机体免疫器官中脾脏的内质网蛋白质加工过程的信号通路来参与致病过程。

为了提高枯草芽孢杆菌SX3411菌株羊毛硫细菌素Subtilomycin前体基因subA表达产物的抗原性，采用化学合成的方法合成了SubA的3次重复串联体3×subA基因，构建了该基因的原核表达载体并转入大肠杆菌中。结果表明，3×subA基因在大肠杆菌中获得了融合表达。利用SDS-PAGE纯化大肠杆菌中融合表达的3×SubA，免疫家兔后制备抗体anti-3×SubA，该抗体经检测有较高的滴度。通过Western Blotting杂交，检测了Subtilomycin前体多肽SubA的胞内表达特性。结果表明，枯草芽孢杆菌SX3411在30℃培养的条件下进行不同时间取样检测，枯草芽孢杆菌3411约在培养的第10，12小时胞内有较多的SubA表达。综上所述，通过串联表达Subtilomycin前体基因subA所获得的融合表达产物3×SubA具有较好的抗原性，以此获得的抗体anti-3×SubA完全可以用于枯草芽孢杆菌SX3411中Subtilomycin前体检测和分析。

为获得牦牛CTGF基因的CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能，并研究该基因在肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌等组织中的mRNA表达水平。以类乌齐牦牛为研究对象，采取RT-PCR方法获得类乌齐牦牛CTGF基因CDS序列，荧光定量PCR（qPCR）方法检测该基因在其5个组织中的mRNA表达水平。结果显示：牦牛CTGF基因含2个CpG岛，开放阅读框长度为1 050 bp（登录号：MT968972），可编码349个氨基酸，CTGF编码蛋白存在信号肽，为水溶性不稳定的表面蛋白，共存在21个磷酸化位点和7个糖基化位点，在内质网和微体（过氧物酶体）中分布较多，有3个完整的保守功能结构域。荧光定量结果显示，CTGF基因在类乌齐牦牛肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌组织中均有表达，且在肝脏中表达水平最高。旨在为CTGF基因在调控牦牛肌肉生长发育方面提供参考数据。

胰岛素样生长因子结合蛋白与动物的生长发育有密切的联系。为了探讨IGFBP-3基因作为绵羊屠宰性状候选基因的可能性，采用单链构象多态性结合测序方法检测592只甘肃高山细毛羊IGFBP-3基因的变异特征，并分析核苷酸变异与屠宰性状的相关性。结果表明，绵羊IGFBP-3第4外显子区检测到1个单核苷酸变异位点（g.87 A>C），A和B 2个等位基因（等位基因频率：56.76%，43.24%），表现为AA、AB和BB 3种基因型（基因型频率：29.73%，54.05%，16.22%），并且所研究的群体在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。相关性结果表明，甘肃高山细毛羊IGFBP-3基因g.87 A>C处的变异对宰前活质量、热胴体质量有极显著影响（P<0.01）；对眼肌面积、GR值、嫩度有显著影响（P<0.05）。表明等位基因B的绵羊群体具有更高的屠宰率，可以作为甘肃高山细毛羊屠宰性状选育的分子标记用于生产实践中。

旨在探究影响荣昌猪和长白猪机体先天免疫功能的候选基因。以新生荣昌猪、长白猪胸腺为研究对象，利用RNA-seq分析荣昌猪、长白猪胸腺组织中的差异表达基因，同时对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，并通过qRT-PCR验证RNA-seq结果的准确性。结果表明：在新生荣昌猪和长白猪胸腺中，差异倍数在2倍以上的基因共421个，其中，荣昌猪相对长白猪上调的有231个，下调的有190个。GO富集分析发现，这些差异表达基因主要富集在清道夫受体活性、G蛋白偶联受体结合、T细胞活化、细胞分泌调节、胞吐作用调节、SNARE复合物组装调节等生物学过程。KEGG通路分析发现，这些差异表达基因主要参与细胞因子-细胞因子受体互作、cAMP信号、代谢（磷脂酶D、半胱氨酸和蛋氨酸）及一些疾病（非洲锥形病、癌症）相关信号通路。6个差异表达基因的RT-qPCR结果表明，此次RNA-seq的结果准确可靠。综合差异表达基因、GO和KEGG信号通路结果发现，TMSB15A和STAB2、SAA1和HP分别是荣昌猪和长白猪胸腺先天免疫的候选基因。

旨在克隆延边牛解偶联蛋白-1（UCP1） CDS区序列，利用RT-PCR技术和基因克隆获得延边牛UCP1基因，与其他物种进行同源性比对及构建系统进化树，利用生物信息学方法预测UCP1编码蛋白质的理化性质、潜在的磷酸化位点等性质，利用实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qPCR）方法检测UCP1基因在延边牛不同组织的表达丰度。结果显示，延边牛UCP1基因的CDS区全长749 bp，编码249个氨基酸。同源性比对发现延边牛UCP1基因与印度牛同源性为99.47%，系统进化树表明，延边牛与印度牛的亲缘关系最近，和南美羊驼亲缘关系最远。UCP1蛋白缺乏稳定性，脂溶系数是91.53，网状红细胞于体外的半衰期是30 h，总平均亲水性等于0.212，预测其具备一定亲水性。二级结构由α-螺旋（54.03%）、延伸链（12.90%）、无规卷曲（27.42%）和β-转角（5.65%）构成的混合型蛋白。磷酸化位点和糖基化位点分析结果表明，UCP1共有21个磷酸位点，4个潜在的O-糖基化位点，3个N-糖基化潜在位点。UCP1基因的编码产物无跨膜螺旋（TMHs）结构，跨膜螺旋氨基酸残基数量的预测值为19.008 57，蛋白质前60个氨基酸的跨膜螺旋数预测值为10.980 09，位于膜细胞质侧的总概率为22.995%且属于非分泌蛋白。经实时荧光定量PCR （RT-PCR）可知，延边牛脂肪与小肠内UCP1基因表达水平相对较高，而在肌肉、心脏中的表达水平较低。该试验结果可为进一步研究该基因的功能提供借鉴。

Hoxa5是HOX家族中的一员，在生长发育与肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，但其在反刍动物中的研究较少。为了获得山羊Hoxa5基因序列，明确其表达特征，知悉其在山羊不同组织的表达水平，利用RT-PCR技术，从简州大耳羊的皮下脂肪组织中克隆得到Hoxa5基因序列，用生物信息学的方法分析其生物学特性，用实时荧光定量PCR技术检测Hoxa5基因在简州大耳羊心、肝、脾、肺、肾、背、股、臂等10个组织中的表达情况。结果表明：山羊Hoxa5基因的开放阅读框为813 bp，共编码270个氨基酸。Hoxa5相对分子质量为29.283 ku，等电点为9.42，无信号肽和跨膜结构域，该蛋白属于非分泌蛋白；Hoxa5蛋白的二级结构预测发现，Hoxa5蛋白中无规卷曲含量最高，其次是α螺旋，β转角占总氨基酸数相对较少；氨基酸同源性比对结果显示，简州大耳羊与绵羊、牛、马、猪、黑鼠、豚鼠、小鼠及人的Hoxa5氨基酸序列相似性依次为100.00%，99.63%，99.26%，99.26%，98.89%，98.89%，98.89%和98.15%，说明该基因在不同的物种间具有较高的保守性；实时荧光定量PCR结果显示，Hoxa5基因在山羊的组织中差异表达，在肾脏中表达量最高；构建pEGFP-Hoxa5融合载体转染山羊皮下脂肪细胞后的荧光定位显示该基因主要定位于细胞核中。研究表明，山羊Hoxa5基因在皮下脂肪细胞分化过程上调且蛋白定位于细胞核中，推测该基因可能作为转录因子调控山羊皮下脂肪细胞分化。

以牦牛为试验对象，旨在克隆牦牛增强子结合蛋白α基因（CEBPα），预测其蛋白结构和功能，同时分离得到牦牛脂肪细胞，并检测CEBPα在牦牛不同组织中的表达及牦牛脂肪细胞诱导分化过程中的表达。采集成年牦牛（4岁）的心、肝、脾、肾、胃、小肠、皮下脂肪、内脏脂肪和肌肉组织，利用PCR技术获得CEBPα基因序列，得到其CDS序列；生物信息学的方法预测该基因的序列同源性及蛋白结构；通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR）检测CEBPα在牦牛不同组织的表达；通过胶原酶消化法，分离得到牦牛前体脂肪细胞；qRT-PCR检测CEBPα在诱导分化0，3，6，9 d的表达模式。结果表明，牦牛CEBPα基因的CDS序列长度为645 bp，编码214个氨基酸；牦牛CEBPα基因与普通牛的同源性相对较高，核酸同源性为99.73%，氨基酸同源性为99.19%；构建系统进化树的结果显示，牦牛与普通牛和绵羊的相似性较高；CEBPα蛋白为具有跨膜结构、发生磷酸化/去磷酸化的不稳定亲水性蛋白，蛋白质的二级结构以α螺旋（27.10%）和无规则卷曲（67.29%）为主；qRT-PCR结果显示，CEBPα基因在牦牛皮下脂肪组织中表达最高，在肾、脾和内脏脂肪组织中低表达； CEBPα在牦牛脂肪细胞诱导分化过程中表达量逐渐升高。本试验克隆获得了CEBPα的CDS区序列，确定了其在牦牛各个组织中的表达量并明确了该基因在牦牛脂肪细胞诱导分化过程中的表达模式，为揭示CEBPα基因在牦牛脂肪组织和脂肪细胞中的功能提供基础数据。

为了探讨外源钙对提高羊草耐受性的作用，以内蒙古呼和浩特市和林格尔县的羊草种子为试验材料，采用无菌培养方法，研究了补加不同浓度CaCl₂对盐、碱、渗透、低温4种非生物胁迫下羊草幼苗生长及生理特性的影响。结果表明：150 mmol/L NaCl胁迫时羊草幼苗的生长受到显著抑制，当补加1 mmol/L CaCl₂后羊草种子发芽率显著提高，幼苗的根长、叶长与鲜质量增加。pH值8.5、300 mmol/L Mannitol胁迫时羊草幼苗的生长均会受到显著抑制，当补加1~20 mmol/L CaCl₂后未能有效缓解碱胁迫、渗透胁迫对羊草幼苗生长的影响。4℃胁迫时羊草幼苗的生长受到显著抑制，当补加20 mmol/L CaCl₂后羊草幼苗叶长、鲜质量增加，叶中丙二醛含量下降，超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶活性增强，还原型抗坏血酸含量增加。综上所述，补加外源CaCl₂可以提高羊草幼苗的抗盐和抗低温能力，但是对抗碱和抗渗透胁迫能力没有改善。

旨在探究DNA损伤诱导转录本3（DDIT3）基因序列特征及其在母牦牛组织表达特性。以母牦牛为研究对象，利用RT-PCR技术克隆牦牛DDIT3基因，利用生物信息学软件分析DDIT3蛋白的结构和功能，并利用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测DDIT3基因在牦牛不同组织及不同生理阶段的生殖器官和卵母细胞中的表达特征。结果显示：牦牛DDIT3基因CDS区全长507 bp，共编码168个氨基酸；核苷酸序列比对发现，牦牛与野牛同源性最高，为99.71%，与其他物种的同源性均在88%以上，说明DDIT3基因在进化过程中表现出高度保守性；牦牛DDIT3基因在卵巢中的表达量极显著高于心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、子宫和输卵管（P <0.01）；在卵巢中，妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期、黄体期和胎儿期（P <0.05），黄体期的表达量显著高于胎牛期（P <0.05）；在子宫中，妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期和胎牛期（P <0.05）； DDIT3在各时期输卵管中表达水平差异不显著；M Ⅱ期卵母细胞中DDIT3基因的表达水平显著高于GV期和M Ⅰ期（P <0.05），M Ⅱ颗粒细胞DDIT3基因的表达量也显著高于GV期和M Ⅰ期（P <0.05），GV期、M Ⅰ期的卵母细胞和颗粒细胞DDIT3表达量差异不显著。综上，牦牛DDIT3基因可能在维持母牦牛卵巢机能与妊娠以及卵泡发育与成熟过程中发挥重要的调控作用。

旨在探究bta-miR-133a参与肉牛调控背最长肌发育的分子机制。通过采集布莱凯特黑牛和鲁西黄牛的背最长肌进行sRNA建库，数据筛选与肉牛骨骼肌发育相关的bta-miR-133a，采用生物信息学分析软件鉴定其保守性并预测其靶基因，对其靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证；选取C2C12细胞进行功能验证，过表达和敲除bta-miR-133a，48 h后2%马血清诱导观察肌管分化过程，CCK-8检测细胞增殖率，实时荧光定量PCR检测细胞增殖分化标记基因PCNA、CCND1、Myh1、Myod1以及靶基因的表达量。结果表明，bta-miR-133a的成熟序列在各物种间高度保守，靶基因预测为PAX7 ，经双荧光素酶报告试验验证，bta-miR-133a与PAX7存在靶标关系。GO富集和KEGG通路分析结果显示，预测靶基因显著富集于肌动蛋白细胞骨架组织的调节、经典Wnt信号通路的负调控、肌动蛋白丝结合等GO条目中和MAPK、Ras、FoxO等与肌肉发育相关的信号通路中。过表达bta-miR-133a促进肌管分化（P <0.01），在72 h，降低细胞的增殖率（P <0.01），抑制靶基因PAX7的表达（P <0.01）；敲除bta-miR-133a则抑制肌管分化（P <0.01），在72 h时，增加细胞的增殖率（P <0.05），促进靶基因PAX7表达（P <0.01）。在细胞增殖方面，过表达bta-miR-133a降低其标记基因PCNA、CCND1的表达量（P <0.05），敲除组则相反；在细胞分化方面，过表达bta-miR-133a增加其标记基因Myh1、Myod1的表达量（P <0.01），敲除组则相反。综上表明，bta-miR-133a可能通过靶向负调控PAX7的表达抑制成肌细胞增殖、促进其分化而参与背最长肌的发育过程。

为了建立一种高效、灵敏的猪链球菌（SS）检测方法，针对SS的谷氨酸脱氢酶基因（gdh）合成特异性引物，通过优化退火温度与引物浓度，经特异性、敏感性、重复性以及临床样品检测，建立了SS的纳米PCR检测方法。特异性试验结果显示，该方法仅能从SS的基因组序列中扩增得到687 bp的特异性序列，与猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌无交叉反应，且能同时识别1、2、7和9型4个目前流行的SS主要血清型，满足临床上多血清型SS感染检测的需要；敏感性试验结果显示，该方法对SS的最低检测下限为10 cfu/mL，与普通PCR方法相比，灵敏度提高了100倍；重复性试验表明，该方法检测效果稳定，重复性较好。用该方法和普通PCR对临床上收集的44份疑似SS感染样品进行检测，阳性率分别为72.7%（32/44），54.5%（24/44），表明该纳米PCR方法具有灵敏度高，特异性好等优点。综上，本研究建立的SS纳米PCR检测方法，能够准确、高效检测SS，为猪链球菌病的临床诊断和流行病学调查提供了技术支持。

为鉴定牦牛水通道蛋白7（AQP7）基因，分析其在不同组织中的表达水平及蛋白定位，采用RT-PCR方法克隆九龙牦牛AQP7基因，并进行生物信息学分析，采用RT-qPCR方法检测AQP7基因在九龙牦牛8种不同组织中的表达量，并用免疫组织化学染色方法对AQP7蛋白进行组织表达及定位分析。结果表明，九龙牦牛AQP7基因CDS区序列长度为993 bp，编码330个氨基酸，生物信息学分析发现，AQP7为稳定的疏水性蛋白。进化树结果显示，九龙牦牛AQP7基因与黄牛的亲缘关系最近，同源性为99.7%。AQP7基因在九龙牦牛心脏和肌肉表达量较高，极显著高于肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和瘤胃（P <0.01）。免疫组化结果显示，AQP7蛋白主要分布在九龙牦牛心脏和肌肉的肌细胞以及肾脏近曲小管中，且在心脏、肌肉和肾脏中的表达显著高于肝脏、脾脏、肺脏、小肠和瘤胃（P <0.05）。结果为深入研究AQP7基因在牦牛低氧适应性中的生理功能和能量代谢机制提供了基础数据。

旨在克隆牦牛诱导细胞凋亡DNA片段化45样效应因子A（CIDEA）基因序列、分析其生物学特性及检测CIDEA基因在牦牛不同组织及脂肪细胞分化中的表达模式。以金川牦牛皮下脂肪组织的cDNA为模板，采用PCR技术克隆CIDEA基因的CDS序列（Coding sequence），对CDS区进行相关的生物信息学分析；设计特异引物，检测该基因在金川牦牛肺脏、心脏、肾脏、脂肪等组织的表达情况；同时分离原代前体脂肪细胞，分析CIDEA基因在脂肪细胞分化过程中的表达趋势。结果表明，金川牦牛CIDEA基因的序列长度为696 bp，其中CDS序列为684 bp，编码227个氨基酸；金川牦牛CIDEA基因与普通牛的同源性最高，核苷酸序列同源性为94.14%，氨基酸序列同源性为99.54%，与鸡的同源性最低，核苷酸序列同源性仅为63.38%，氨基酸序列同源性仅为59.05%，利用MEGA 5.0软件构建进化树显示金川牦牛与牛的亲缘关系最近，与鸡的亲缘关系最远。蛋白理化性质分析结果表明，CIDEA蛋白是一个不稳定的碱性亲水蛋白，不存在跨膜结构与信号肽；二级结构预测显示CIDEA蛋白中α螺旋占33.92%，无规则卷曲占51.98%。实时荧光定量PCR结果表明，CIDEA基因在金川牦牛脂肪组织中表达量最高，肺脏中表达量最低；在金川牦牛脂肪细胞分化过程中呈现上升的趋势。由此可推测金川牦牛CIDEA基因可能参与牦牛脂肪细胞分化与脂肪沉积。

ATP6V0A4基因编码V-ATP酶的一个亚基，与H⁺转运相关，是遗传性远端肾小管性酸中毒的致病基因。在前期研究中发现，民猪在遭受冷应激后其背脂中ATP6V0A4基因的转录水平发生了显著上升（P<0.05）。为了分析ATP6V0A4基因在转录水平的调控机制，构建了一系列长度不同的含有该基因5'端启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，转染PK15细胞并检测双荧光素酶的相对活性。根据检测结果，利用重叠PCR技术定点靶序列，预判可能存在的转录调控因子。结果发现，该基因启动子区的-1 504~-1 bp片段具有转录活性，通过2轮启动子截短试验后判定-265~-1 bp区域内存在正调控元件，-581~-265 bp区域内存在负调控元件。定向缺失-205~-190 bp，-120~-110 bp小片段后，确定-205~-190 bp区域内存在调控该基因转录的正调控元件结合位点，通过在线软件预测后发现E2F3、SP2、EGR1、E2F6、CTCFL、E2F1、SP1和ETF可能是该基因的正调控转录因子。首次克隆了猪的ATP6V0A4基因的启动子区域并进行了转录因子结合位点的筛选与鉴定，为后续研究其在冷应激状态下的转录调控奠定了基础。

旨在克隆牦牛HDAC2（Histone deacetylase 2）基因，预测分析HDAC2蛋白的结构和特性，并检测HDAC2的mRNA在牦牛不同组织以及不同发育阶段睾丸中的表达。将牦牛按年龄划分为幼年组（0.5～1岁）、成年组（4～5岁）及老年组（7～9岁），采集成年组牦牛肝脏、肾脏、肺、胃、脾脏、脑、心脏和卵巢组织以及3个时期的牦牛睾丸组织，利用反转录PCR （RT-PCR）技术克隆获得牦牛HDAC2的基因序列，使用生物信息学的方法预测该基因的序列同源性以及其编码蛋白质的氨基酸序列和结构；通过实时荧光定量PCR检测HDAC2的mRNA在牦牛不同组织中的表达，通过RT-PCR检测HDAC2的mRNA在牦牛不同发育阶段睾丸中的表达，利用色素原位杂交技术检测HDAC2 mRNA在成年牦牛睾丸中的定位。结果表明，HDAC2基因的开放阅读框包含1 467个碱基，编码488个氨基酸，其基因序列在哺乳动物中高度保守。结构预测表明，HDAC2是一个脂溶性疏水蛋白，具有一个组蛋白去乙酰化酶结构域。该基因的mRNA在卵巢和睾丸中的表达较高。HDAC2的mRNA在幼年期牦牛睾丸中的表达显著高于其他时期，在牦牛睾丸中HDAC2的mRNA定位在除精细胞之外的各类细胞中。克隆得到牦牛HDAC2基因序列并明确了该基因在睾丸中的时序表达模式，对于深入探讨HDAC2在牦牛睾丸发育及精子发生中发挥的作用提供了一定的试验数据。

养殖废弃物（羊粪）的无害化处理是发展现代绿色生产的重要环节。以高温无害化处理的羊粪、松土促根剂、常规化肥进行不同配置，探讨其潮土区土壤单施及配施松土促根剂和发酵羊粪（化肥（CK）、化肥+松土促根剂（T1）、化肥+发酵羊粪（T2）、化肥+发酵羊粪+松土促根剂（T3））对土壤理化性状、朝天椒农艺性状、产量、品质的影响。结果表明，与化肥（CK）相比，施用松土促根剂、发酵羊粪可以改善土壤理化性质，促进朝天椒生长发育，提高产量及品质。其中，化肥+发酵羊粪+松土促根剂（T3）处理效果最好，与化肥（CK）相比，该处理土壤有机质、碱解氮、有效磷、速效钾含量分别显著提高24.08%，18.08%，14.80%，15.56%，土壤粉粒显著提高9.05%，朝天椒株高、茎粗、有效分枝数分别显著提高25.71%，20.69%，28.81%，单株结果数、单果鲜质量及干质量分别提高29.05%，17.04%，18.94%，鲜椒显著增产37.75%，干椒显著增产39.43%，朝天椒果实Vc、还原糖含量分别显著提高19.91%，20.77%，但对硝酸盐和游离氨基酸含量无显著影响。综合考虑，松土促根剂、发酵羊粪与化肥配施（T3）对改良土壤、提高朝天椒品质及增产效果最好。

旨在克隆牦牛Sirtuin7（SIRT7）基因，预测其蛋白结构和功能，并检测其mRNA在牦牛各组织和不同发情时期卵巢中的表达。采集成年牦牛（3~5岁）的肝脏、乳腺、大肠、肾等组织及处于卵泡期、红体期、黄体期的卵巢。提取各组织的总RNA，并通过反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）扩增获得牦牛SIRT7的基因序列。通过不同的生物信息学软件比对SIRT7基因的序列同源性、构建系统进化树以及预测牦牛SIRT7所编码蛋白的结构和功能。采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法检测SIRT7 mRNA在牦牛各组织和不同发情时期卵巢中的表达。结果显示，牦牛SIRT7基因的开放阅读框（Open reading frame，ORF）大小为1 203 bp，编码400个氨基酸。牦牛SIRT7基因的核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊的同源性较高。SIRT7蛋白为亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋（47.4%）、β-折叠（29.7%）、β-转角（15.7%）及无规卷曲（7.2%）组成。磷酸化和糖基化分析结果表明，SIRT7蛋白有38个磷酸化位点，24个O-糖基化位点。荧光定量结果为，SIRT7 mRNA在牦牛的肾中表达最高。在牦牛卵巢中，卵泡期、红体期、黄体期SIRT7 mRNA的表达量呈持续升高的趋势，其中黄体期表达量最高。为揭示SIRT7在牦牛生长发育，尤其是卵巢发育过程中的调控作用提供一定的基础数据。

旨在获得山羊Kruppel样因子6（Kruppel-like factor 6，KLF6） CDS序列，明确其组织及在皮下脂肪细胞分化过程中的表达模式。利用RT-PCR技术克隆山羊KLF6基因序列，利用生物学软件及在线网站对获得的KLF6基因进行序列分析。利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）技术检测KLF6在山羊各组织中的表达丰度及成脂诱导分化不同阶段皮下脂肪细胞中的表达水平。结果显示，获得山羊KLF6基因全长序列1 233 bp，其中包括CDS区957 bp，编码318个氨基酸残基，与牛和绵羊的亲缘关系最近。KLF6基因在山羊各个组织中都有广泛表达，且在脂肪组织中高表达，极显著高于其他组织（P<0.01）。KLF6在诱导分化60 h的山羊皮下脂肪细胞中的表达量极显著高于在前体脂肪细胞中的表达水平（P<0.01）。获得山羊KLF6基因序列并明确其分子特征，发现其在脂肪组织中存在高表达，且在分化后表达水平显著高于分化前的表达水平，为最终揭示KLF6调控山羊脂肪细胞分化提供重要数据。

旨在探讨磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基β（Phosphoinositide-3 kinase，PI3K，catalytic subunit beta，PIK3CB/P110β）基因序列特征，比较分析其在牦牛不同发育阶段卵泡中的表达规律。通过RT-PCR技术从牦牛卵巢组织中克隆获得PIK3CB基因序列并对其进行生物信息学分析；采用RT-qPCR方法检测PIK3CB基因在牦牛不同组织中的表达水平；将采集的牦牛卵泡根据直径大小分为大（≥7 mm）、中（3.0~6.9 mm）、小（≤2.9 mm）3组，分别收集各组卵泡中的壁颗粒细胞及卵母细胞提取总RNA，采用RT-qPCR方法检测PIK3CB mRNA在各级别卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中的相对表达量。结果显示：克隆获得牦牛PIK3CB基因CDS区长3 213 bp，共编码1 070个氨基酸。蛋白质分析显示，PIK3CB蛋白为亲水酸性蛋白，无跨膜结构无信号肽，二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。PIK3CB核苷酸同源性及遗传进化树分析显示，牦牛与野牦牛和黄牛亲缘关系最近。PIK3CB基因在牦牛心脏、脾脏、肾脏、肌肉、肝脏、肺脏、子宫、胃、小肠、卵巢组织中均有表达，尤其在脾脏、子宫和卵巢组织中表达量显著高于其他组织（P<0.05）。RT-qPCR结果显示，PIK3CB基因在卵泡发育过程中均有表达，其中在各级别卵泡壁颗粒细胞中，mRNA表达量随着卵泡发育进程呈现上升趋势，且大、中级别卵泡中的表达量极显著高于小卵泡组（P<0.01）；但是卵母细胞中mRNA表达量差异不显著（P>0.05）。结果提示，mRNA基因参与了牦牛卵泡发育调控，是PI3K信号通路在调节颗粒细胞的功能中不可或缺的催化亚基之一，具体调控机制有待进一步研究。本研究为深入探讨PI3K-AKT信号通路在卵巢发育中的调控机理提供基础资料。

为鉴定牦牛水通道蛋白8（Aquaporin，AQP8）基因，并分析其在不同组织及不同生长阶段肝脏中的表达差异，探讨AQP8蛋白的表达分布差异。采用RT-PCR技术克隆牦牛AQP8基因的CDS序列并进行生物信息学分析，利用qRT-PCR技术检测AQP8在成年牦牛8种组织和不同年龄段肝脏中的表达水平，采用免疫组织化学方法分析AQP8蛋白在不同年龄肝脏中的分布和表达。结果表明，AQP8基因的开放阅读框为792 bp，编码263个氨基酸，系统进化树分析显示，麦洼牦牛与野牦牛的亲缘关系最近，蛋白具有AQPs特有的MIP稳定结构域。AQP8在成年牦牛肝脏中的mRNA相对表达量最高，且显著高于心脏、脾脏和肾脏等组织（P<0.05），幼年时期（15月）肝脏中的AQP8表达量显著高于胎儿时期（1 d）和成年时期（5岁）（P<0.05）。免疫组化结果表明，AQP8蛋白在幼年肝脏组织中的表达量最高（P<0.05）。研究结果为深入探究牦牛AQP8在生长过程中作用机制提供基础依据，对高寒低氧环境中动物的适应性机制研究具有借鉴意义。

旨在克隆牦牛水通道蛋白2基因（Aquaporin 2，AQP2），并检测其在牦牛不同组织及其雄性生殖道发育过程中的表达模式，为探索AQP2在牦牛雄性生殖中的作用机制提供可靠数据。以牦牛为研究对象，利用RT-PCR技术获取牦牛AQP2 cDNA序列，使用生物信息学软件分析其功能和结构。利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测AQP2在牦牛肾、睾丸、附睾、脾脏、脑、肺脏、心脏和肝脏组织中的表达模式以及不同发育时期雄性生殖道中的表达规律。结果显示，得到AQP2基因CDS序列，长816 bp，共编码271个氨基酸，并发现牦牛AQP2基因与黄牛、水牛和山羊的同源性较高，AQP2在睾丸和肾中高表达，显著高于其他组织（P<0.05）。免疫组化结果发现，AQP2仅在曲细精管的圆形精子细胞中表达，而精原细胞、精母细胞、长形精子细胞、间质细胞及支持细胞均未见其表达。qRT-PCR结果显示，在牦牛雄性生殖道中，输精管中的AQP2表达量最高（P<0.05），且AQP2 mRNA在睾丸和输精管中的表达水平随年龄增长逐渐升高（P<0.05），而在前列腺中其表达水平随年龄增加稍有降低，但差异不显著（P>0.05）。以上结果表明，AQP2在遗传进化上高度保守，在睾丸和肾组织中高表达，参与精子成熟及运输过程，可能是通过调节水重吸收和液体形成来完成。

为了探究p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路是否参与雌二醇（E₂）对奶牛子宫内膜上皮细胞中COX-2的表达及PGF_2α分泌的调节，通过体外培养妊娠早期奶牛子宫内膜上皮细胞，并添加E₂单独或联合p38 MAPK抑制剂SB203580和PI3K抑制剂LY294002处理奶牛子宫内膜上皮细胞。通过Western Blot、qRT-PCR检测COX-2基因和蛋白的表达，ELISA技术检测PGF_2α的水平变化。结果显示：E₂促进了妊娠早期奶牛子宫内膜上皮细胞中COX-2的表达和PGF_2α的分泌；与此同时，E₂激活了p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路，添加SB203580和LY294002则抑制了E₂对COX-2表达及PGF_2α分泌的促进作用。说明E₂通过激活p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路促进了COX-2的表达及PGF_2α的分泌。