作为植物抵御多种逆境胁迫的重要调节因子,植物热激转录因子(Hsf)家族基因数目多,结构、特性和功能复杂多样。植物Hsf不仅通过直接转录调控热激蛋白和相关基因的表达,参与对多种逆境胁迫的响应和适应过程,还介导植物诸多生命活动过程。自20世纪80年代酵母Hsf被首先克隆以来,多个物种的Hsf家族被识别和研究,模式植物番茄和拟南芥Hsf研究比较早且相对深入,研究主要集中在HsfA族,B族研究较少,C族报道更少。随着全球气候变化,极端高温事件频发,已严重威胁小麦、玉米等粮食作物的产量和品质,深入研究作物耐热性机制从而挖掘功能基因、通过生物技术方法改良作物的耐热性,是抵抗高温逆境的关键。大田作物中Hsf家族数目大小不等,基因组复杂,研究起步晚。为此,植物生理与分子生物学研究室从2009年开始对作物Hsf家族基因进行研究,依据最新的基因组信息,确定了家族基因数目及核酸和蛋白质结构特性、明确了家族基因的时空表达特性及其对多种非生物逆境的响应规律。克隆获得多个基因并借助遗传转化和基因编辑技术创制转基因材料和突变体,对其耐热性以及抗逆性调控功能多层面进行了鉴定,并对下游调控机制进行了深入解析。研究不仅丰富了大田作物耐热性调控理论基础,也为作物耐热性研究和生物育种提供优异新种质。目前,关于Hsf的研究主要集中在功能鉴定和对下游基因的转录调控方面,其上游哪些组分通过何种方式介导Hsf参与耐热性调控方面的研究还缺乏证据,机制尚不清楚。基于本研究室多年来对小麦、玉米Hsf家族的研究结果,结合他人的相关研究报道,详述了近年来植物Hsf在抗逆性响应和适应过程中调控功能、机制及其主要研究进展,以期为深入阐明Hsf家族的作用及其调控网络提供理论依据,为耐热生物育种挖掘强效的基因资源和备选位点。

捕光叶绿素a/b结合蛋白在植物光合进程及非生物胁迫响应中发挥着重要的作用。为了研究陆地棉GhLhcb2A1基因特征、表达特性以及在低温和干旱响应中的功能,以冀棉262叶片cDNA为模板进行PCR扩增,获得了GhLhcb2A1基因的CDS全长,通过生物信息学分析了基因及其编码蛋白的基本特征,利用qRT-PCR技术检测了基因的组织表达特性以及低温和干旱响应表达模式,采用病毒诱导的基因沉默技术验证了GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中的功能。研究结果表明,GhLhcb2A1基因CDS全长为798 bp,编码265个氨基酸。GhLhcb2A1在叶片中高表达,在低温和干旱处理的叶片和根中显著上调表达,并在低温和干旱处理3 h的叶片中达到最大值,分别是对照叶片中的17.42,30.03倍,在低温处理6 h和干旱处理12 h的根中达到最大值,分别是对照根中的11.65,65.04倍。亚细胞定位结果表明,GhLhcb2A1蛋白在细胞叶绿体中表达。GhLhcb2A1基因沉默植株与对照植株相比,低温和干旱处理造成的植株失水干枯等表型更严重,叶片积累的丙二醛含量显著升高,脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性则显著降低,说明GhLhcb2A1基因沉默植株对低温和干旱胁迫的抵抗力降低。以上研究表明,GhLhcb2A1基因在低温和干旱响应中发挥正调控的作用。

大豆P34蛋白主要存在于种子中,其上游启动子很可能具有调控下游基因在种子中高表达的特性。为进一步研究大豆P34蛋白基因的组织表达模式及其启动子的调控活性,通过qRT-PCR方法检测大豆P34蛋白基因在大豆不同组织中的表达情况;克隆大豆P34蛋白基因5'端上游序列(GmP34P),生物信息学分析其转录起始位点和顺式元件;构建表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,检测转基因烟草中GUS的表达。结果表明,P34蛋白基因在大豆种子中的表达量极显著高于根、茎、叶和花的表达量;克隆获得GmP34P序列长度为1 380 bp,预测分析表明,该序列的转录起始位点为第1 342位上的碱基A,序列中含有多种与种子高表达相关的顺式作用元件,如RY element、Skn-1 motif、2S seed protbanapa等;获得含有GmP34P启动子驱动GUS基因的植物表达载体pCAM-GmP34P;通过潮霉素、PCR及RT-PCR筛选阳性转基因植株;对pCAM-GmP34P阳性转基因烟草植株,进行qRT-PCR检测,结果显示,相对于其他组织,GUS基因在转基因烟草种子中的表达量达到极显著差异;GUS组织化学染色结果显示,GmP34P启动子能够调控下游GUS基因在种子中高表达。

WRKY是植物特有的一类转录因子,在非生物胁迫应答、种子休眠与发芽、生长发育等方面起重要作用。为揭示大豆WRKY转录因子家族中GmWRKY44基因的功能和潜在的分子机制,对大豆Williams 82中GmWRKY44基因进行了生物信息学分析及功能验证。结果表明,GmWRKY44基因CDS全长1 077 bp,编码358个氨基酸;结构预测与进化分析结果显示,其编码的蛋白质二级结构由23.46% α-螺旋、4.75% β-折叠、58.94%无规则卷曲和12.85%延伸链构成,三级结构与二级结构相统一;含一个保守的WRKY结构域,锌指结构为C₂H₂类型,属WRKY IIc亚家族;该基因是拟南芥AtWRKY71的同源基因,相似度为35.56%,两者具有相似的基因结构。RT-qPCR分析表明,GmWRKY44响应盐胁迫,表达量先下降后上升。在盐胁迫下,野生型(Col-0)和GmWRKY44过表达拟南芥株系的萌发率和根长均受到一定程度抑制,但GmWRKY44过表达株系明显优于Col-0。另外,在盐处理后,GmWRKY44过表达株系生长受抑制程度低于Col-0。生理指标分析发现,在盐胁迫下,GmWRKY44过表达株系的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于Col-0,而丙二醛(MDA)含量显著低于Col-0。以上表明,GmWRKY44过表达可以提高转基因拟南芥的耐盐性。

为了探索花生高油育种新途径,建立一种直接育成高油花生种质的新方法,采用离体诱变育种技术进行花生高油新种质创制。以吉花9号胚小叶为诱变试材,吉花9号和吉花54为对照试材,以博来霉素作为诱变剂。胚小叶消毒后放置在梯度诱变培养基中,筛选博来霉素诱变半致死浓度,体胚萌发成苗后以无菌花生苗作为砧木采用插接法进行无菌嫁接,嫁接成苗后移栽至田间。对2个已知调控花生脂肪合成基因WRI1进行生物信息学分析,并通过籽粒中WRI1基因表达和诱变植株粗脂肪含量相关性进行试验可行性验证。当博来霉素质量浓度在3 mg/L时,诱变效果最佳。吉花9号突变体IM13-3的粗脂肪含量高于吉花9号(CK₁,试材品种对照)和吉花54(CK₂,高油品种对照)。2个WRI1基因WRI1X2和WRI1X1分别编码366,357个氨基酸,都是不稳定亲水性蛋白。在籽粒中WRI1基因表达量与粗脂肪含量呈显著正相关。率先采用博来霉素作为花生离体诱变诱变剂,通过此离体诱变方法获得吉花9号高油突变体IM13-3,粗脂肪含量为56.64%。测定了高油突变体WRI1基因表达量,与对照品种存在显著差异。证明花生离体诱变方法育种方法可行性。

为探究甘蓝型油菜溶血磷脂酸酰基转移酶2(LPAT2)基因的功能,从甘蓝型油菜中PCR 同源克隆了BnaLPAT2的一个拷贝(A07),将其构建过表达载体p35S∷BnaLPAT2-A07和种子特异表达载体pNapin∷BnaLPAT2-A07,利用农杆菌介导法遗传转化甘蓝型油菜中双6号,通过转化植株的PCR检测,分别获得15株和11株转基因阳性植株。经实时荧光定量(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)检测,过表达T₃油菜多数组织中BnaLPAT2-A07基因的表达量较野生型均有显著提升;而种子特异性表达的T₃油菜各组织中BnaLPAT2-A07基因都集中在种子的发育与成熟期超强表达。索氏抽提法检测到由35S启动子或Napin启动子驱动的BnaLPAT2-A07转基因油菜种子中的含油量较野生型分别提升1.39,2.36百分点。气相色谱法检测转基因油菜的脂肪酸组分结果显示,亚麻酸的含量较野生型分别提升3.13,1.47百分点。研究结果表明,BnaLPAT2-A07基因具有促进甘蓝型油菜种子油脂合成的功能,但BnaLPAT2-A07对亚麻酸特异选择性功能还需进一步验证。

对甜瓜CmPIPs基因家族鉴定和表达模式分析,为进一步探究甜瓜CmPIPs基因家族功能及甜瓜遗传改良提供理论依据和支持。利用TBtools、MEME、MEGA X、Plant-CARE工具对CmPIPs进行生物信息学分析,利用GraphPad Prism 10软件对CmPIP2;7在甜瓜授粉后不同时期中果皮中的表达量以及CmPIPs各成员在不同组织和不同浓度的植物激素处理幼叶中的表达量进行可视化解析。结果显示,CmPIP2;7与CsPIP2;8亲缘关系最近;12个CmPIPs家族成员主要分布在1,3,4,5,9,10,11号染色体上;除CmPIP2;8有3个外显子区,其余成员均有4个外显子区;CmPIPs各成员的启动子区域有多个顺式作用元件,如生长素、赤霉素、脱落酸等激素应答元件;CmPIP2;7在甜瓜的快速生长期以及成熟期的表达量显著上调;CmPIPs各家族成员在甜瓜的不同组织中均有表达;生长素浓度为40.0 μmol/L时,CmPIP2;4表达量显著上调,CmPIP1;1、CmPIP2;1、CmPIP2;2和CmPIP2;3的表达量极显著下调;脱落酸浓度为0.4,4.0,40.0 μmol/L时,CmPIP1;1、CmPIP2;1、CmPIP2;3、CmPIP2;9表达量均显著下调;茉莉酸甲酯浓度为44.640 μmol/L时,CmPIP2;1和CmPIP2;5表达量显著下调,CmPIP2;2、CmPIP2;3、CmPIP2;7、CmPIP2;9表达量显著上调;乙烯利浓度为4.0 mmol/L时,CmPIPs各成员表达量均显著上调。明确了CmPIPs基因家族成员的基因结构、序列特征、进化关系以及共线性关系,对其表达模式进行了解析。

ACA作为Ca²⁺-ATPase的亚家族成员之一,在维持植物细胞内Ca²⁺浓度平衡以及调节植物生长发育响应非生物胁迫等方面发挥着重要的作用。为进一步了解生菜ACA基因家族功能,运用生物信息学方法对生菜ACA基因家族成员进行鉴定与分析。结果表明:在生菜中共鉴定到17个ACA基因,命名为LsACA1~LsACA17;LsACA基因不均匀地分布在8条染色体上;亚细胞定位预测结果表明,LsACA蛋白全部定位于细胞质膜;LsACA基因家族成员之间的内含子数量差异较大(0~32个),LsACA蛋白共鉴定到15个保守结构域,氨基酸数量为21~50个;二级结构占比情况为:α-螺旋>无规则卷曲>延伸链>β-折叠;根据系统发育分析将LsACA蛋白分为5个亚家族Group Ⅰ~Group Ⅴ;根据共线性分析发现,6对基因存在片段复制,其共线性基因对的Ka/Ks均小于1,说明在进化中以纯化选择为主。通过qRT-PCR方法分析了LsACA基因家族成员在不同钙离子浓度处理下的表达模式,结果表明:与对照相比,低钙处理的钙敏感型品种宝石绿中有12个LsACA基因表达量极显著下调,而钙不敏感型品种耶罗有9个LsACA基因表达量极显著上调,1个LsACA基因表达量显著上调。研究鉴定了生菜ACA基因家族成员,并进行了生物学分析,揭示了LsACA基因家族成员的特征。

查尔酮合酶(CHS)是调控植物类黄酮通路早期生物合成的重要结构基因,在植物生长发育和逆境响应中发挥作用。前期通过表达量分析,在马铃薯CHS家族中筛选到花青素生物合成关键基因StCHS4和StCHS5。为进一步探究马铃薯StCHS4和StCHS5在类黄酮和花青素生物合成中的功能,首先利用在线网站分析StCHS4和StCHS5蛋白结构,之后以pRI101双元表达载体为基础,通过同源重组法构建35S∷StCHS4-GFP和35S∷StCHS5-GFP植物过表达载体,并将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株中。利用本氏烟草进行瞬时转化,明确StCHS4和StCHS5蛋白亚细胞定位情况。以红花烟草为试验材料,分别进行瞬时超表达和稳定遗传转化,分析StCHS4和StCHS5基因过表达后总类黄酮和总花青素的含量变化。结果表明:StCHS4和StCHS5蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,StCHS4为不稳定的亲水蛋白,StCHS5为稳定的亲水蛋白。StCHS4和StCHS5分别与辣椒CHS和番茄CHS1亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示,StCHS4和StCHS5蛋白均在细胞质和细胞膜中表达。烟草瞬时超表达中,StCHS4和StCHS5基因在注射3~5 d显著促进花青素累积。分别获得3个阳性烟草转基因株系,与野生型相比,转基因植株中StCHS4和StCHS5显著高表达,总类黄酮和总花青素含量均高于野生型。StCHS4-OE3和StCHS5-OE1转基因植株中的总类黄酮含量显著提升,StCHS5-OE1和StCHS5-OE2中花青素含量分别提高89%,131%。上述结果表明,StCHS4和StCHS5是马铃薯类黄酮通路中关键CHS基因,过表达可促进花青素与类黄酮生物合成。

DNA损伤会对植物的生长发育造成严重的影响,NBS1是参与损伤修复的重要基因,为研究NBS1与其可变剪切体NBS1-3之间的功能差异。根据NBS1和NBS1-3基因序列分别设计特异性引物,以野生型拟南芥叶片RNA反转录得到的cDNA第一链为模板,克隆NBS1和NBS1-3,对2个基因序列和蛋白质三维结构进行分析。同时,创制了NBS1、NBS1-3过表达株系,获得突变体nbs1纯合株系,并检测NBS1基因在NBS1及NBS1-3过表达植株的相对表达量。为进一步阐明NBS1与可变剪接体NBS1-3之间的功能差异,用0.6 mmol/L甲基黄酸甲酯(MMS)对野生型、nbs1突变体和过表达植株进行处理,观察损伤面积。定量检测结果显示,NBS1基因在NBS1及NBS1-3过表达植株的表达量均高于野生型。根尖PI染色结果表明,0.6 mmol/L MMS处理后,nbs1突变体植株相对损伤面积最大,而NBS1-3过表达植株相对损伤面积最小,其次依次为NBS1过表达植株和野生型。因此,在DNA损伤修复方面,NBS1-3可能比NBS1发挥更大的作用。

为了解析绣球WRKY转录因子家族的成员特征及其在绣球叶斑病应答中的作用,利用生物信息学方法,对绣球无尽夏基因组中的WRKY家族成员进行全基因组鉴定,并系统分析了蛋白质理化特征、基因结构、系统进化、共线性和家族成员在多主棒孢菌侵染下的表达模式。结果表明:绣球全基因组中共鉴定到84个非冗余的HmWRKY成员,均属于亲水性蛋白,在绣球18条染色体上呈现不均匀分布,编码氨基酸112~1 046个;所有成员可分为3个亚组,即Group Ⅰ~Group Ⅲ,均含有WRKYGQK和C2H2组成的DNA结合域;HmWRKY成员的序列长度变化较大,从512 bp到40 338 bp,并且检测到8个存在共线性的基因对,Ka/Ks的比值均小于1,说明HmWRKY家族在进化中趋于纯化选择;同时,18个HmWRKY成员在绣球叶斑病菌侵染后表现出显著差异表达的特性,其中9个上调表达、9个下调表达。以上结果表明,HmWRKY基因在绣球响应叶斑病中可能具有重要作用。

为探究广藿香Trihelix家族基因PatASIL2的序列特征、亚细胞定位及表达模式,以广藿香转录组获得的ASIL2基因序列设计特异性引物,以广藿香cDNA为模板,克隆PatASIL2基因,随后对其进行生物信息学分析;构建PatASIL2-EGFP融合蛋白表达载体并转化拟南芥原生质体,检测PatASIL2的亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PatASIL2基因在广藿香不同组织、外源茉莉酸甲酯(MeJA)喷施及非生物胁迫(盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫)下的表达情况。结果显示,PatASIL2含长度为1 035 bp的开放阅读框,编码344个氨基酸。PatASIL2不具有跨膜结构和信号肽,属于不稳定的亲水蛋白,含有41个丝氨酸磷酸化位点和1个Myb_DNA-bind_4保守结构域。系统进化分析显示,PatASIL2归类到Trihelix转录因子家族的SIP1亚家族,与芝麻SiASIL2同源性较高。亚细胞定位结果表明,PatASIL2为细胞核定位蛋白。qRT-PCR结果表明,PatASIL2在广藿香的嫩叶、成熟叶、老叶、根和茎中都有表达,尤其在老叶中的表达量最高;在MeJA处理后,PatASIL2基因的表达量在12~24 h显著升高;盐胁迫下,PatASIL2基因的表达量在3~24 h显著升高;在干旱胁迫下,PatASIL2基因的表达量在24 h显著升高;在冷胁迫下,PatASIL2基因在12 h表达量显著升高。

土壤氮循环酶活性可作为表征土壤肥力水平和氮素转化的重要指标。为明确长期施肥对南方双季稻区稻田根际土壤氮循环酶活性的影响,依托长期(37 a)定位施肥试验田,系统分析了4种施肥处理(不施肥(CK)、单施化肥(MF)、秸秆还田+化肥(RF)和30%有机肥+70%化肥(OM))根际土壤氮循环相关酶活性以及其与土壤化学性质的相关性。结果表明:OM和RF处理较MF和CK处理显著增加了根际土壤全氮、有机碳、铵态氮、硝态氮和微生物量氮含量,提高了水稻产量。OM和RF处理根际土壤脲酶和亚硝酸还原酶活性均显著高于MF和CK处理;RF处理根际土壤羟胺还原酶活性最大,分别比CK、MF和OM处理增加了21.7%,13.0%,8.7%;OM处理根际土壤蛋白酶、固氮酶、硝酸还原酶和氧化亚氮还原酶活性最大,较MF处理分别显著增加了20.0%,26.1%,426.1%,26.7%;CK处理稻田根际土壤一氧化氮还原酶活性显著高于MF、RF和OM处理。相关性分析结果表明,根际土壤硝酸还原酶、固氮酶、氧化亚氮还原酶、脲酶、蛋白酶活性与土壤全氮、有机碳、铵态氮、硝态氮、微生物量氮含量以及水稻产量之间均呈极显著正相关,而根际土壤一氧化氮还原酶与土壤全氮、有机碳、铵态氮、硝态氮、微生物量氮含量和水稻产量之间均呈显著或极显著负相关,表明土壤化学特性、产量与根际土壤氮循环酶活性密切相关。冗余分析(RDA)表明,第一排序轴能解释根际土壤酶活性的93.34%,土壤硝态氮、全氮和有机碳含量是驱动根际土壤氮循环酶活性变化的关键因素。因此,长期采用有机物料(有机肥和秸秆)替代部分化肥通过改善土壤化学和生物学特性,促进土壤氮循环酶活性,达到培肥稻田土壤的效果。

研究施氮量对不同烟草品种上部叶生长发育及碳氮代谢的影响,为生产优质上部烟叶提供参考。采用双因素裂区试验,研究了不同施氮水平(37.5,75.0,112.5 kg/hm²)NC89、云烟87品种上部叶农艺性状、光合特性、叶片组织结构、碳氮代谢关键酶活性及化学成分等指标。随着施氮量的增加,两品种上部叶叶长、叶宽、叶面积、单叶干质量均显著增加,移栽后115 d,高氮处理的NC89和云烟87的叶面积分别比低氮处理显著提高了63.10%,68.43%。增加施氮量提高了NC89叶绿素含量,高氮处理的叶绿素含量比低氮处理高6.67%~37.50%;增加施氮量显著提高了云烟87的净光合速率,移栽后70,80 d尤为显著。移栽后85~115 d栅栏组织、海绵组织、叶片厚度均随施氮量增加而显著增大,低氮和中氮处理的栅栏组织、海绵组织厚度在移栽后95~115 d趋于稳定,而高氮处理仍分别提高了9.82%~14.08%和10.72%~13.72%。随着施氮量的增加,两品种叶片碳含量和C/N显著降低,氮含量显著增加;两品种转化酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、谷氨酸合成酶活性升高,高氮处理降低了云烟87淀粉酶活性,提高了NC89淀粉酶活性,移栽后115 d,高氮处理的云烟87比中氮处理显著降低了27.53%,高氮处理的NC89比低氮和中氮处理分别显著提高了33.86%,21.74%。云烟87谷氨酰胺合成酶活性随施氮量增加显著增加,NC89则无规律变化,差异不显著。增加施氮量降低了烤后叶片还原糖和总糖含量,提高了烟碱和总氮含量。同一施氮水平下,云烟87烟碱、总氮、钾含量高于NC89,还原糖、总糖含量(除低氮水平外)及糖碱比、氮碱比低于NC89。不同烟草品种上部叶对施氮量的响应不同,增加施氮量能够促进NC89上部叶片生长发育和碳代谢,降低糖碱比、氮碱比,提高化学成分协调性,但会造成云烟87氮代谢旺盛,难以适时向碳积累代谢转变,延缓叶片衰老,造成云烟87贪青晚熟。

为了明确氮肥减量后移对黄淮海平原麦-玉两熟体系生产力的调控效应,于2020年6月至2023年6月在山东省农业科学院济南济阳试验基地设置夏玉米、冬小麦周年氮肥试验,分析了传统农户处理(F₄₀₀,周年施氮400 kg/hm²)、周年减氮10%(FN)、周年减氮20%(FH)、周年减氮30%(FL)4种氮肥处理对麦-玉两熟体系籽粒产量、地上部氮素积累特性、氮肥利用效率、收获后0~200 cm 土层土壤硝态氮积累特性的影响,为进一步优化黄淮海平原施氮制度提供依据。结果表明,氮肥后移提高了氮肥减量条件下夏玉米、冬小麦和周年总产,与F₄₀₀和FN处理相比,FL处理3 a均值分别显著提高9.2%~18.1%,13.5%~20.5%,11.1%~19.1%。氮肥后移量改善了麦-玉两熟体系各生育阶段地上部植株氮素积累强度,促进了地上部植株氮素的积累,3 a均值夏玉米季吐丝和成熟期植株氮素积累量FL较F₄₀₀、FN、FH分别显著提高5.7%~12.3%,5.0%~12.8%,籽粒氮素积累量显著提高8.2%~17.2%;冬小麦季,拔节、开花和成熟期FL与FH处理连续3 a地上部氮素积累量显著高于F₄₀₀和FN处理,3 a均值分别提高23.4%~28.1%,20.7%~26.3%,12.6%~20.8%,籽粒氮素积累量FL较F₄₀₀、FN和FH处理分别显著提高16.4%,15.0%和5.8%。优化施氮制度能够改善麦-玉两熟体系氮肥利用效率,其中,夏玉米和冬小麦氮肥吸收效率3 a均值FL较F₄₀₀、FN、FH处理分别显著提高4.8%~57.7%,32.0%~72.4%;氮肥偏生产力夏玉米FL较F₄₀₀和FN处理分别显著提高68.8%,40.4%,冬小麦季FL较F₄₀₀、FN和FH显著提高38.4%~71.8%。4种施氮处理下夏玉米、冬小麦收获后0~40 cm土层均具有较高的土壤硝态氮富集,其中夏玉米3 a均值分别占0~200 cm土层总积累量的40.0%,38.9%,44.9%,42.5%,冬小麦分别占37.3%,36.9%,46.7%,38.3%;随着种植年限的增加,夏玉米和冬小麦收获后传统农户处理(F₄₀₀)和周年减氮10%(FN)处理0~200 cm土层土壤硝态氮较试验起始时均出现了累积效应,而FL和FH施氮处理下实现了土壤硝态氮残留的相对平衡。可见,周年减氮 30%处理下通过增加氮肥后移量,改善了植株氮素积累特性,实现了夏玉米、冬小麦籽粒产量和氮素利用效率的协同提高,是实现黄淮海平原麦-玉两熟体系籽粒高产、氮肥高效和环境友好的较优施氮制度。

为探究有机肥对胡麻生理生长和根际细菌群落的影响,探索旱地胡麻的绿色高产栽培技术,基于大田试验,以坝选三号为材料,研究4个不同施肥处理(T0:不施;T1:低量牛粪;T2:中量牛粪;T3:高量牛粪)对胡麻生理生长、氮素利用、干物质积累的影响,解析根际细菌群落多样性、群落组成、共现网络和代谢途径变化,探讨驱动细菌群落差异的环境因素。结果表明,T3处理胡麻产量较高,与对照相比,该施肥条件下株高、单株有效蒴果数、千粒质量和氮肥利用效率指标也最高,这是施用有机肥后产量稳定的生理基础。胡麻根际土壤细菌的多样性和丰富度受有机肥施用的显著影响,根际细菌菌群结构也存在显著差异。胡麻根际细菌的菌群结构受有机质、全氮、速效钾的影响,不同处理胡麻根际细菌均具有相同的优势菌群,但各优势菌群的相对丰度存在较大差异。胡麻根际以变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和拟杆菌门为优势菌门。变形菌门和放线菌门随着有机肥施用量的增加而增加,放线菌门随有机肥施用量的增加而降低。WGCNA分析鉴定15个共表达模块,其中Red和Pink模块与有机质(OM)显著正相关。有机肥的施用增加了细菌网的复杂度,结合WGCNA分析鉴定出7个关键OTUs。综上,有机肥的施用促进了胡麻的生长,改变了胡麻根际土壤的细菌群落结构和网络复杂度。

为探究提升豫南黄褐土地力的良好施肥模式,研究了黄褐土上不同施肥处理下小麦-玉米轮作系统的稳产高产特征及其与土壤养分的关系。基于2012年开始的长期定位试验,设置不施肥(CK)、施用化肥(NPK)、化肥配施粪肥(NPKM)和化肥配施秸秆(NPKS)共4个处理,采集成熟期植株、土壤样品,测定作物产量与土壤有机碳、碱解氮、有效磷、速效钾养分含量。结果表明,与CK处理相比,各施肥处理作物产量均显著提高,小麦季产量提高53.70%~64.50%,玉米季产量提高44.54%~58.31%,其中NPKM处理的产量最高(小麦8 162.61 kg/hm²、玉米8 836.33 kg/hm²),NPKS处理与NPKM处理无显著差异;NPKM处理的产量可持续性指数(SYI)最高,其小麦季和玉米季SYI值分别为0.84,0.82;作物产量及其SYI值均表现为NPKM>NPKS>NPK>CK,表明化肥配施有机物料可显著提高作物产量及其可持续性。同时,不同施肥处理均可不同程度提高土壤养分含量,其中NPKM处理提升效果最为显著;分析作物产量与土壤养分关系发现,作物产量与土壤有机碳(SOC)、碱解氮以及有效磷含量呈极显著正相关,其中与SOC相关性最为显著;随着SOC含量提升,作物SYI值呈现先升高后稳定的趋势,其拐点为15.15 g/kg。综上,化肥配施粪肥可显著提高作物产量和土壤养分,并维持较高的作物产量可持续性,是实现黄褐土生态区土壤-作物系统可持续生产的推荐施肥模式。

明确不同施氮水平对内蒙古中西部地区玉米田土壤有机氮组分及氮素利用效率的影响,为农田土壤氮素科学管理和现代农业高效可持续发展提供参考。共设置6个施氮水平,分别为N0(0 kg/hm²)、N8(120 kg/hm²)、N12(180 kg/hm²)、N16(240 kg/hm²)、N20(300 kg/hm²)、N24(360 kg/hm²),分析在玉米田播前和收获后不同土层下各施氮水平对土壤全氮、颗粒有机氮、轻组有机氮和重组有机氮含量动态变化规律以及玉米产量、氮素利用效率的影响。结果表明,随土层加深同一施氮水平下,土壤全氮、颗粒有机氮、轻组有机氮和重组有机氮含量呈下降趋势。同一土层下播前土壤全氮含量随施氮水平升高呈上升趋势;收获后N16、N20和N24处理土壤全氮含量显著高于N0、N8和N12处理。播前0~10 cm,10~20 cm,20~40 cm土层N16处理土壤颗粒有机氮含量均最高,分别为0.14,0.13,0.09 g/kg;收获后10~20 cm,20~40 cm,40~60 cm土层最高,分别为0.19,0.10,0.09 g/kg。N16处理土壤轻组有机氮含量增加量最高,为37.27%;N24处理土壤重组有机氮含量增加量最高,为7.35%,其次是N16处理,为6.84%。N16处理玉米生物产量最高,为31 443.50 kg/hm²;玉米经济产量最高,为18 526.47 kg/hm²;氮素利用效率指标随着氮肥施用水平升高而降低,N16处理下氮收获指数最高,为79.20%。综上,240 kg/hm²为内蒙古中西部地区较适宜的氮肥施用水平,在该水平下土壤氮素管理和作物产量较佳。

为挖掘枸杞棉蚜对杀虫剂吡虫啉产生抗药性的候选基因,以枸杞棉蚜对吡虫啉的室内抗药性品系和相对敏感性品系为材料,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术获得2个品系的转录组数据,通过NCBI数据库进行基因注释,在转录水平上对2个品系的差异基因GO功能及KEGG代谢途径等生物信息学进行分析,采用qRT-PCR技术检测其中8个候选差异基因(CYP6a2、CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CYP4c1、AChE2、CarE和ALP3)的相对表达情况,并分析了抗药性相关基因的进化关系。经测序及序列拼接,共获得70 101条Unigene(单基因簇),平均长度为654.37 bp,在NR、GO和KEGG数据库中分别注释到29 131,27 861,2 993条Unigene。通过对两品系的差异基因进行NR注释分析,共发现289个差异基因,其中,22个可能与抗药性相关,包括9个解毒酶系基因(CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CYP4c1和ALP3各1个,CYP6a2和CarE各2个),8个表皮蛋白基因(CP)及其前体(Cuticular protein precursor,CPP),1个靶标酶系基因(Alkaline phosphatase,AChE2),2个转录因子基因(WRKY1、LZTFL1,Leucine zipper transcription factor-like protein 1 gene),1个胰脂肪酶相关蛋白2基因(PLRP2)和1个多抗相关蛋白基因(Multidrug resistance-associated protein,MRP)。定量结果表明,差异基因CYP6a2、CYP6a13、CYP6k1、CYP6j1、CarE和ALP3在抗药性品系的表达量均显著高于敏感性品系。对抗药性相关重要基因CYP、GST、ALP和CP构建系统进化树,通过分析基因的遗传关系,发现枸杞棉蚜与大豆蚜、豌豆蚜的亲缘关系相对较近。获得了枸杞棉蚜对吡虫啉的抗药性与敏感性品系转录组的整体表达模式,筛选到抗药性相关差异表达基因,发现2个品系中87.50%的候选差异基因在转录水平和mRNA水平的表达量变化一致。

通过克隆尖孢镰刀菌亚麻专化型FolSid1基因,确定该基因在镰刀菌中的生物学功能以及蛋白定位。通过与尖孢镰刀菌近缘菌同源比对,克隆得到FolSid1的基因序列,基于同源重组原理,使用Split Marker法构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒,通过PEG介导法转入野生型原生质体中,获得基因敲除突变体(ΔFolSid1),对突变菌株做表型鉴定和致病力分析,分析该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。构建含有FolSid1基因的绿色荧光表达载体pZESH1,对FolSid1-EGFP融合蛋白进行亚细胞定位。结果表明,FolSid1基因序列全长5 392 bp,含有3个内含子。与野生型和外插入突变体相比,尽管敲除突变体ΔFolSid1分生孢子形态和大小没有不同,但产量显著下降;形态学观察发现,敲除突变体的生长速度明显减慢;亚麻试验显示,缺失突变体的致病力明显降低;基因的亚细胞定位试验显示,FolSid1蛋白主要定位于菌丝细胞的细胞膜上。FolSid1基因能够调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的菌丝营养生长、分生孢子发生且对亚麻具有致病性。

为了深入探究lncRNA TCONS_00143126在E.coli型奶牛乳腺炎中的表达模式及其生物学功能,采用奶牛乳腺上皮细胞的cDNA为模板,运用PCR克隆及测序技术来确认lncRNA TCONS_00143126的存在,并进行lncRNA的亚细胞定位分析、预测可能靶向的miRNA及靶基因,并通过KEGG通路富集分析探讨其在奶牛乳腺炎中的潜在作用机制。此外,采用LPS诱导bMECs以构建奶牛乳腺炎体外模型,并通过RT-qPCR技术检测lncRNA TCONS_00143126在LPS诱导bMECs 6,12,24 h的表达情况。结果表明,lncRNA TCONS_00143126是真实存在的,在LPS诱导的bMECs中的表达量显著上调,且主要分布于细胞核中。靶基因预测及KEGG富集分析结果显示,lncRNA TCONS_00143126可能通过靶向的miRNA(bta-miR-133a、bta-miR-193a-5p和bta-miR-375等)和靶基因(IFNE、SLC2A10、MEX3B)来调节JAK-STAT、mTOR和MAPK等炎症信号通路,进而在奶牛乳腺上皮细胞炎症中发挥作用。

茴香胺5(ANO5)是一种定位于肌膜和肌浆网的多通道膜蛋白,主要在肌膜修复和磷脂争夺中起作用,ANO5基因突变会导致颌骨发育不全以及各种肌肉疾病。为了探讨绵羊ANO5基因的单核苷酸多态性与脂肪沉积性状的关联性,选择健康且系谱清晰的1 005只湖羊公羔群体为研究对象,采用PCR扩增技术和KASPar分型技术对试验群体ANO5基因位点多态性进行检测,并与脂肪沉积性状进行关联分析,并利用qPCR分析ANO5基因在不同组织中的表达水平。结果表明,绵羊ANO5基因在湖羊多种组织中广泛表达,与其他组织相比,ANO5基因在心脏组织中的表达量最高。在绵羊ANO5基因第10内含子中检测到了g.58010 C>T多态位点的3种基因型CC、CT和TT。描述性统计结果表明,肾周脂肪质量与其他脂肪质量的差异最大,变异程度最高。相关分析结果表明,脂肪沉积相关性状与生长性状、饲料效率性状均呈正相关。关联分析结果表明,该多态位点与湖羊肾周脂肪质量及其相关性状呈显著关联。其中,CC基因型个体的肾周脂肪质量及其相对质量均显著低于TT基因型个体。综上所述,绵羊ANO5基因g.58010 C>T突变位点可作为湖羊肾周脂肪沉积性状的候选分子标记。

旨在比较分析国内地方猪种八眉猪和引入猪种大白猪两品种猪泌乳期的乳成分、血清生化指标及泌乳相关基因Leptin、LF的表达水平。选取健康状况良好,体况基本一致,胎次、配种期和分娩期接近(3 d内)的纯种八眉猪和大白猪各6头,于八眉猪和大白猪分娩(即泌乳第1天)、泌乳第7,14,21,28天,分别采集八眉猪和大白猪乳汁50 mL,血清及全血样本各2 mL,用于测定乳汁营养成分和血清中碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等指标,及Leptin、LF基因的表达情况。结果表明,泌乳第1天除了乳脂(Fat)外,八眉猪初乳中酪蛋白(CS)、总蛋白(TP)、总固形物(TS)、非脂乳固体(SNF)、乳糖(L)、游离脂肪酸(FFA)含量和酸度(Acidity)均极显著高于大白猪;八眉猪泌乳第21天的CS、TP、Fat、TS、SNF和L含量极显著低于大白猪。两猪种血清生化指标在泌乳期呈现不同的变化趋势,八眉猪在泌乳第1天,ALT、AST、GLB、BUN以及TG含量显著高于大白猪,而ALP、ALB含量显著低于大白猪。泌乳第1天,Leptin基因和LF基因在八眉猪和大白猪之间差异不显著,但自第7天起,大白猪Leptin基因表达量均极显著高于八眉猪,八眉猪LF基因表达水平均极显著高于大白猪。总的来说,2种猪的乳营养成分随泌乳期的延长呈下降趋势,Leptin基因和LF基因的表达量很有可能与2种猪的产奶量和乳品质有关,有待进一步验证。

旨在基于组学数据筛选与康乐黄鸡8周龄体质量性状相关的重要候选基因,为康乐黄鸡生长性状的分子标记辅助育种提供理论基础,为完善地方鸡种分子选育方法、加快品种选育进展提供关键的基础数据。以434只康乐黄鸡为研究对象,测定8~22周龄体质量,采用基因芯片技术对康乐黄鸡8周龄体质量性状进行全基因组关联分析,筛选显著关联SNP位点。寻找位于每个显著SNP周围2 Mb区域内的候选基因,对候选基因进行GO和KEGG功能分析。结合前期转录组测序数据、文献数据,筛选与康乐黄鸡8周龄体质量性状相关的关键候选基因。共检测到2个显著关联SNPs,分别位于2号染色体(131 485 613 bp)和4号染色体(60 413 848 bp),筛选到118个候选基因。基因功能注释结果表明,视黄酸代谢过程为最显著富集的生物学过程,脂肪酸降解、酪氨酸代谢和药物代谢-细胞色素P450等12个通路为显著性富集通路。初步确定基因OXR1、RSPO2、EIF3E、TRHR、BMPR1B、ADH1C、MTTP、LAMTOR3、PPP3CA、PDLIM3可作为康乐黄鸡8周龄体质量性状的关键候选基因。研究初步确定了2个与康乐黄鸡8周龄体质量性状显著关联的SNP位点,以及10个关键候选基因。

为探究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(AMA1)对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的免疫保护效果,将AMA1基因扩增产物连接到表达载体pET-32a(+)上构建重组质粒pET-32a(+)-AMA1,并转入大肠杆菌BL21(DE3)来表达重组蛋白。将108只雏鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复6羽,包括不免疫不攻虫组(阴性组)、不免疫攻虫组(阳性组)、弗氏佐剂对照组及12.5,25.0,50.0 μg rEtAMA1免疫组,分别于14,21日龄肌肉注射不同浓度的重组蛋白,28日龄口服感染5×10⁴个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,35日龄处死试验鸡,以体增质量、盲肠病变评分、卵囊产量、免疫器官指数、细胞因子及抗体水平来评价重组AMA1蛋白的免疫保护效果。结果显示,各组间的平均增质量差异不显著;25.0 μg及50.0 μg rEtAMA1组的盲肠病变计分较阳性组分别显著降低了53%和41%;12.5,25.0,50.0 μg rEtAMA1组的克粪便卵囊数量(OPG)分别较阳性组显著减少16%,27%,54%;50.0 μg rEtAMA1组的法氏囊指数较阳性组显著提高27%;25.0,50.0 μg rEtAMA1组的胸腺指数均显著高于阳性组,分别增加了25%,22%;各组的脾脏指数无显著差异;在二免后7 d,12.5 μg和25.0 μg rEtAMA1组的细胞因子IL-2和IFN-γ含量均显著高于阴性组,50.0 μg rEtAMA1组血清总IgG含量较阴性组显著增加47%,且二免后含量明显高于首免后。综上,重组AMA1蛋白能够减轻盲肠病变,减少球虫卵囊产量和促进免疫器官发育,提高血清细胞因子和抗体水平,对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡具有一定的免疫保护效果。