为了探索DUF760基因家族在水稻生长发育中的潜在功能,对水稻DUF760基因家族进行了全基因组鉴定、分类、启动子序列分析和表达谱分析。通过生物信息学技术在水稻和拟南芥中分别鉴定了6,8个DUF760家族成员。系统进化树分析将这些家族成员分成2个亚家族,二者在蛋白保守基序和基因结构上也存在一些特征差别。水稻DUF760家族基因启动子区域存在多个响应逆境胁迫和植物激素的顺式作用元件,ABRE(脱落酸响应)元件存在于家族所有成员的启动子序列中,OsDUF760-1启动子区域拥有9个脱落酸(ABA)相关的响应元件。在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平显著下调,而OsDUF760-3显著上调,二者在干旱胁迫处理水稻后的表达变化模式与ABA处理水稻后的表达变化模式一致,说明这2个基因可能通过ABA信号途径参与水稻干旱胁迫响应,并且扮演不同的角色。除对ABA和干旱胁迫处理具有较强响应外,水稻DUF760家族成员还对JA(茉莉素)、低温及稻瘟菌处理具有较强的响应表达变化。

播期和密度是影响玉米产量的2个关键因素。为明确不同玉米品种在黄淮海地区对夏播播期和密度的响应特征,以中农大788和科河699为试验材料,设置6月10日、17日、24日3个播期,以及67 500(A),75 000(B),82 500(C)株/hm² 3个播种密度,调查其生育进程、形态指标、产量及产量构成因素。结果表明,随着播期推迟,玉米吐丝前的生育进程加快,籽粒灌浆期延长,第3播期(6月24日)的籽粒无法正常成熟。晚播(第3播期)相较于早播(第1播期即6月10日),中农大788穗位高和科河699株高、穗位高均显著增加,2个品种茎粗均显著减小;2个品种空秆率和倒伏率均随播期推迟而增加;中农大788主要由于千粒质量降低,导致产量降低21.8%,科河699穗数、穗粒数、千粒质量均显著降低,导致减产41.3%。密度C较密度A,2个品种株高、穗位高、空秆率、倒伏率均显著增加,茎粗则显著减小。中农大788在密度B获得最大产量且显著高于密度A,分别为12 450,11 097 kg/hm²。随密度增加科河699空秆率增加,导致穗数并未显著增加,穗粒数减少,密度C较密度A产量显著降低,分别为7 548,9 464 kg/hm²。播期密度互作仅对倒伏率有极显著影响,对植株形态指标、空秆率、产量及产量构成因素影响不显著。综合来看,中农大788平均产量高于科河699,前者在晚播和高密条件下空秆和倒伏率低,产量更稳定。实际生产中,夏玉米应尽量早播,晚播可通过选择适宜的品种减少产量损失,选育耐密品种是增密增产的关键。

为探明糯小麦籽粒淀粉组分和理化特性对灌水的响应,在大田条件下,采用裂区设计,主区为2个糯小麦品种(临糯88,软质;晋麦99号,硬质),副区为3种灌水处理(S₁,越冬水;S₂,越冬水+拔节水;S₃,越冬水+拔节水+灌浆水),同时以不灌水作为CK,分析灌水对2个糯小麦籽粒产量、淀粉含量、淀粉组分、粒径分布、面粉糊化特性及品质的影响,并对其进行相关性分析。结果表明,随灌水次数增加2个糯小麦品种籽粒产量及其构成因素均提高,2 a平均S₃处理下较S₁和S₂处理下临糯88分别增产 63.59%和 9.02%,晋麦99号分别增产 64.15%和 6.95%;S₂处理下2个糯小麦品种淀粉含量均最高,临糯88、晋麦99号较CK分别提高1.75,5.54百分点;临糯88支链淀粉含量随灌水增加先升后降,S₂处理显著高于其他处理,晋麦99号支链淀粉含量随灌水增加而降低,S₁处理显著高于其他处理;淀粉直/支则与之相反。供试品种淀粉粒的粒径分布为1.0~45.7 μm,其数目分布呈单峰曲线变化,体积和表面积分布均呈双峰曲线变化,随灌水次数增加,B型淀粉粒数目先升后降,面粉糊化温度先降后升,峰值时间前移,但均以S₂灌水处理最显著;蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值均随灌水次数增加而降低。本试验条件下,灌越冬水+拔节水在稳产的同时,可提高临糯88的淀粉含量、B型淀粉体积比例,降低淀粉直/支比;灌越冬水+拔节水+灌浆水在高产的同时,可降低晋麦99号的淀粉直/支比,改善硬质糯小麦的糊化特性。灌水能有效调控糯小麦籽粒淀粉组分和粒度分布,从而改变了淀粉的理化性质。

为选育优质抗稻瘟病保持系软华B,以携带稻瘟病抗性基因Pi46和Pi2的优质籼稻H281作为供体亲本、以软华B为轮回亲本,利用分子标记辅助选择(MAS)技术结合系谱选育法,聚合2个外源基因以改良保持系软华B。对性状稳定的改良株系进行稻瘟病抗性鉴定、稻米品质分析等。通过回交及多代自交,并结合分子标记检测,获得以软华B为遗传背景且含有2个纯合目标基因的BC₁F₆群体2个、BC₂F₅群体2个、BC₃F₄群体2个。田间自然诱发鉴定结果表明,不同回交世代改良材料在自然病圃均抗稻瘟病;育性鉴定结果显示,回交世代对不育系的不育度为52.7%~100.0%;农艺性状考查及米质分析表明,改良株系基本保留了软华B的主要农艺性状和稻米品质特性。SNP基因芯片分析结果显示,BC₁F₆的背景回复率为74.42%~77.77%,BC₂F₅的背景回复率为86.42%~87.75%,BC₃F₄的背景回复率为92.27%~92.59%。利用连续回交、自交和分子标记辅助选择等技术可有效聚合多个抗性基因,获得抗稻瘟病的新保持系,快速实现保持系软华B的分子改良,为选育抗病、优质的杂交稻组合提供良好的亲本材料。

为了挖掘雄性不育种质资源,鉴定雄性育性基因,为玉米雄性不育化制种提供基础材料。以玉米雄性不育突变体x50为试验材料,研究突变体雄性不育表型,构建x50与自交系Mo17的F₁和F₂群体,确定突变体x50雄性不育性状的遗传模式。以F₂群体为材料,应用图位克隆技术定位雄性育性基因X50,通过基因等位性测验确定候选基因。结果显示,与野生型相比,雄性不育突变体x50花药不能从颖壳露出,花药体积较小且萎蔫,无成熟花粉粒形成。F₁群体植株均表现为雄性可育,F₂群体植株出现雄性育性分离,可育植株与不育植株分离比例符合3∶1,说明突变体x50不育性状受1对隐性核基因控制。通过图位克隆方法将雄性育性基因X50定位于玉米第2染色体分子标记2-4901与2-4963之间,物理区间为237.42~241.39 Mb。定位区间内候选基因分析发现,区间存在玉米雄性不育基因ZmMs33。以ms33纯合突变体ms33-6029和ms33-6052分别与x50杂合型+/x50杂交,杂交后代可育植株与不育植株分离比例符合1∶1,表明x50是ZmMs33基因一个等位突变体。玉米雄性不育突变体x50的鉴定为玉米杂交种子生产和ZmMs33基因功能研究提供了种质材料。

为了揭示南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄PTI免疫的分子机理,以番茄品种新金丰1号 MiPDCD6超表达苗为试验材料,以番茄品种新金丰1号组培苗为对照,通过转录组测序技术分别对番茄MiPDCD6超表达苗和对照苗进行转录组测序。 以番茄栽培品种Heinz 1706基因组作为参考基因组进行对比,利用FPKM法计算基因表达量,设定参数(|log₂ FC|>1且P<0.05)筛选差异表达基因。利用Gene Ontology(GO)数据库进行差异表达基因GO功能富集分析,统计每个GO term中的差异表达基因数目,计算出基因富集的显著性,找出富集显著的功能条目。利用KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway富集分析,超几何分布检验方法计算每个Pathway中差异表达基因富集的显著性。以FDR和基因数量来衡量KEGG的富集程度。结合基因差异表达分析和功能富集分析,研究MiPDCD6蛋白对番茄PTI免疫相关通路基因的影响。结果发现:在超表达MiPDCD6番茄植株中,与野生型番茄相比,MiPDCD6过表达番茄植株中有2 366个差异表达基因(DEGs),其中1 354个上调基因,1 012个下调基因。 这些DEGs中,通过GO和KEGG注释,植物激素信号转导(sly04075)、植物-病原互作(sly04626)、植物MAPK信号通路(sly04016)和丙环素生物合成(sly00940)等KEGG通路中富集到大量的差异表达基因。SA生物合成途径包括ICS和PAL,MiPDCD6过表达番茄植株中SA合成通路PAL1和PAL-like基因以及SA信号转导途径TGA9、TGA10-like和PR1a2基因均显著下调,表明MiPDCD6基因可能抑制SA合成,从而抑制植物PTI免疫。

为探究HIF-1α在CoCl₂影响奶牛胎盘滋养层细胞迁移及侵袭变化中的作用,揭示奶牛胎盘在缺氧条件下的形成机制,从早期妊娠奶牛胎盘中分离纯化奶牛胎盘滋养层细胞(BTCs),用吉姆萨染色法观察细胞形态,免疫荧光法检测上皮细胞标志蛋白角蛋白7(CK7)、Thy/CD90蛋白表达,后将pCI-neo-hTERT质粒转染至BTCs,用qPCR和Western Blot法检测细胞TERT mRNA及蛋白表达,用CCK8法测定细胞增殖率,用ELISA法检测细胞分泌胎盘催乳素(PL)的能力,进一步利用siRNA沉默细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,ELISA法检测细胞分泌血管内皮生长因子(VEGFA)能力,通过划痕试验及Transwell检测细胞迁移及侵袭能力。结果显示,分离纯化的BTCs为典型上皮样细胞,存在一定数量的双核细胞,并表达上皮细胞标志蛋白CK7,未见Thy/CD90表达,转染后的细胞可稳定表达端粒酶(TERT)mRNA及蛋白,连续传代50代未见细胞老化现象,且增殖率显著高于原代BTCs(P<0.05),分泌PL能力较原代BTCs无显著差异(P>0.05)。经CoCl₂处理后发现,BTCs细胞活力随CoCl₂处理浓度及时间的增加而降低,HIF-1α mRNA及蛋白表达随CoCl₂浓度的增加而减少(P<0.05),400 μmol/L CoCl₂作用于BTCs 24 h建立缺氧模型,VEGFA分泌和迁移侵袭能力在BTCs缺氧状态下显著升高(P<0.05),而将HIF-1α基因沉默后显著降低了BTCs分泌VEGFA和迁移侵袭能力(P<0.05)。总之,通过外源性TERT基因转导建立了永生化的BTCs(Bovine trophoblast cells),永生化后的细胞具有与原代细胞相似的生物学特性,BTCs在缺氧条件下具有更强的VEGFA分泌能力及迁移侵袭能力,且与HIF-1α基因表达的上调有关。

旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析;在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下,于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞,提取细胞总RNA,逆转录 PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因,确定ORFV113的动态转录水平;以ORFV-JS株基因组为模板,PCR扩增ORFV113基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV113重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞,通过Western Blotting 鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明,ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守,属于ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒,ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,大小为60~70 ku,比预测分子量大10~20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰;亚细胞定位研究表明,ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上,本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。

WRKY转录因子是植物非生物胁迫反应中的重要调节子。荞麦耐贫瘠,磷利用率较高。为了探究WRKY基因在荞麦磷饥饿反应中可能的调节作用,以苦荞麦为材料,采用逆转录PCR方法,从低磷处理的根RNA样品中获得了FtWRKY6基因的编码序列。FtWRKY6 cDNA长1 572 bp,编码524个氨基酸,含有2个典型的WRKY保守结构域,锌指类型为C₂H₂,归属于第Ⅰ类WRKY,与绿茶CsWRKY24在氨基酸水平上的同一性较高(55.5%)。拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,FtWRKY6定位于细胞核中;酵母单杂交试验表明,FtWRKY6具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,在根中FtWRKY6的表达受低磷和3种重要的低磷反应相关激素—吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)显著诱导。上述结果提示,FtWRKY6具有转录因子的基本结构与生化特征,在根中可能通过IAA、GA、CTK信号通路的交互作用介导苦荞麦在低磷条件下的响应过程。

赤霉素途径是植物开花调控中的一条重要途径。为了解赤霉素途径相关基因在萝卜开花调控中的作用,利用生物信息学方法对萝卜赤霉素生物合成和信号转导相关基因的结构、理化性质、染色体分布、启动子顺式作用元件和组织特异性表达进行了分析,并对不同开花期萝卜材料中这些基因的表达水平进行了实时荧光定量 PCR检测。结果表明,萝卜基因组含有46个赤霉素生物合成和信号转导相关基因,CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2分别有2,1,2,2,9,5,12,1,1,4,3,4个,它们不均匀分布于9条染色体上,其编码蛋白质分子质量为21.32~127.80 ku,等电点为4.72~9.04;基因结构和保守结构域分析发现,这46个基因的外显子数为1~21个不等,且一些保守基序为大部分基因所共有。启动子顺式作用元件分析表明,这46个基因的启动子含有与光、赤霉素、生长素、ABA、SA、低温、干旱等响应的顺式作用元件。利用萝卜基因表达数据库分析发现,这46个基因在不同组织和不同发育时期的表达量不同;实时荧光定量PCR检测表明,这些基因在早开花材料心里美萝卜和晚开花材料野萝卜中的表达量有明显差异,暗示其可能与萝卜的生殖生长有较密切的关系。

为明确杜梨赤霉素受体(GID1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现,PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_35S-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株。

为了探究陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1在棉花黄萎病反应中的生物学功能,为棉花黄萎病抗性基因挖掘及抗病育种奠定基础,通过转录组筛选,克隆获得一个细胞色素P450基因GhP450-94C1,利用生物信息学的方法分析该基因的理化性质,通过荧光定量PCR技术分析GhP450-94C1在黄萎病侵染下的表达模式,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步探究其在棉花抗黄萎病反应中的生物学功能。结果表明,克隆获得一个陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1,其开放阅读框(ORF)为1 503 bp,编码一个含500个氨基酸的酸性、亲水、不稳定的跨膜蛋白,分子式为C₂₅₉₇H₄₀₂₅N₆₉₁O₇₂₅S₂₂,分子质量为57.23 ku,定位于内质网膜,含有一个P450结构域;有86.45%的概率存在信号肽;二级结构预测显示,该蛋白含有24个α-螺旋和8个β-折叠;该基因响应黄萎病菌侵染,抑制其表达后植株对黄萎病菌的敏感性增强。初步证明GhP450-94C1是棉花黄萎病抗性反应的一个正向调控因子。