对多毛番茄全基因组的Dicer-like(DCL)、Argonaute(AGO)和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)基因家族进行生物信息学和表达模式分析,为深入研究DCL、AGO和RDR基因家族在多毛番茄响应非生物胁迫和病毒感染过程中的功能提供参考。以拟南芥DCL、AGO和RDR基因为参考序列,利用本地Perl语言和Pfam、SMART等软件检索多毛番茄LA1777基因组并确定多毛番茄DCL、AGO和RDR基因家族成员。通过ExPASy、GSDS 2.0、MEGA、Tbtools、SWISS-MODEL等工具对多毛番茄DCL、AGO和RDR家族基因进行生物信息学分析。根据非生物胁迫、番茄褪绿病毒(ToCV)处理和实时荧光定量PCR技术分析该类基因的表达模式。从多毛番茄中鉴定得到7个ShDCL、15个ShAGO和6个ShRDR基因,分别分布在第5,7,6条染色体上,其编码的蛋白与其他植物DCL、AGO和RDR结构相似,均含有该家族特有的保守结构域。系统发育分析表明,这些基因被分为4个亚组,与普通番茄之间具有较高的结构和功能相似性。ShDCL2a、ShDCL2c、ShDCL3、ShDCL4、ShAGO1b、ShAGO3、ShAGO4b、ShAGO5、ShAGO7、ShAGO10a、ShAGO10b、ShRDR1、ShRDR2、ShRDR3a、ShRDR6a和ShRDR6b在多种非生物胁迫和ToCV感染后显著上调表达,推测这些基因在非生物胁迫和病毒侵染过程中发挥着重要作用。

为探讨西瓜钙依赖蛋白激酶(CDPK)在嫁接以及非生物胁迫环境下的功能,利用RT-PCR技术从西瓜嫁接苗中克隆了ClCDPK(Cla97C01G019720)基因,对其进行了生物信息学分析。进一步根据ClCDPK序列设计带有Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的特异引物,进行扩增,双酶切后与pCAMBIA1300连接,成功构建目标基因的表达载体pCAMBIA1300-35S-ClCDPK。利用 RT-qPCR 技术,测定ClCDPK在自根苗(ZG)与嫁接苗(JJ)分别遭受盐、干旱胁迫后的基因表达量。结果表明,ClCDPK基因ORF为1 647 bp,编码548个氨基酸。其蛋白存在STKc_CAMK和FRQ1功能结构域,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测该蛋白位于细胞核,对ClCDPK与其他6种植物的CDPK进行进化树分析发现,其与葫芦科甜瓜、南瓜的CDPK亲缘关系较近,蛋白序列同源比对超过92.64%,具有较高的同源性。RT-qPCR表达结果显示,ClCDPK在嫁接苗表达量显著高于自根苗,随着胁迫时间的持续,嫁接苗和自根苗的ClCDPK表达量先升后降,并且同一胁迫处理下,嫁接苗的ClCDPK表达量高于自根苗。试验表明,ClCDPK正响应盐和干旱胁迫,并且嫁接苗抵御胁迫的能力高于自根苗。推测ClCDPK是西瓜响应嫁接的关键因子之一,从而提高了西瓜嫁接苗的抗盐抗旱能力。

为研究不同冬播期下强冬性/春性甘蓝型油菜萌动种子和花期不遇的问题,以甘肃农业大学提供的2个强冬性甘蓝型油菜和2个春性甘蓝型油菜为材料,于2022年10月至2023年8月在甘肃农业大学试验田进行试验。于2022年10月11日进行冬性油菜秋播,于2022年12月10日开始每隔20 d进行冬性/春性油菜冬播,于2023年2月8日结束冬播。记录开花期,对各冬播播期下冬性/春性油菜萌动种子每隔20 d进行取样,测定其生理生化并对其春化基因(FLC、VRN2、FRI、FT)的表达特性进行分析。结果显示,冬播时冬性/春性甘蓝型油菜花期相差22~34 d;秋播(10月上旬)冬性油菜与春播(3月上旬)春性油菜花期相差4~7 d;秋播(10月11日)冬性油菜与冬播(12月10日、12月30日、1月19日、2月8日)的春性油菜开花时间接近,且花期重叠时间长达15~20 d。随着播期的推迟,冬播油菜萌动种子中FLC、FRI、FT基因相对表达量下调;VRN2基因相对表达量在春化前期下调,春化后期上调。萌动种子中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性,可溶性蛋白(SP)、赤霉素(GA3)、水杨酸(SA)含量在春化前期上升,春化后期下降;随着春化时间增加,油菜萌动种子丙二醛(MDA)、脱落酸(ABA)含量呈上升趋势。

为探明间作、轮作对连作花生生长、产量及品质的影响,为花生高产栽培提供理论依据,于2022—2023年在河南科技大学试验农场,分别在连作2 a花生和连作11 a花生的基础上,以继续连作花生为对照(分别记为CCP1、CCP2),研究甘薯-花生轮作体系(PSP)和玉米-花生间作、轮作体系(PMP)对花生光合特性、根系特点、干物质积累与分配和产量的影响。结果表明,在花生的结荚期(PSS)和饱果成熟期(PMS),PSP中轮作花生(SRP)较CCP1分别显著提高叶面积指数(LAI)35.08%~53.68%和24.32%~33.52%;PSS和荚果膨大期(PBS),SPAD值增幅为11.93%~18.55%和5.95%~9.63%。PMP中轮作花生(MRP)较CCP2,LAI在PSS和PMS分别提高了46.81%~57.96%和27.00%~61.78%;MRP和间作花生(MIP)较CCP2,SPAD值在PSS、PBS分别提高了3.32%~3.69%,7.50%~8.64%和5.47%~18.37%,15.73%~31.11%。在PSS和PBS,SRP与CCP1相比,净光合速率增幅分别达23.68%~41.31%和26.52%~32.55%,MRP与CCP2相比分别提高了12.77%~17.81%和16.88%~62.07%,均显著增加根长与根尖数,促进PMS花生单株干物质积累及向荚果的分配,产量分别提高了31.42%~47.36%和54.12%~75.09%;MIP与CCP2相比,受玉米遮阴影响,降低花生的LAI、净光合速率、根长、根尖数,并降低了干物质积累量及产量。同时,轮作后提高了花生果仁的油酸含量和油亚比,其中SRP较CCP1的增幅分别为1.63~1.65百分点和6.59%~10.52%,MRP较CCP2的增幅分别为1.95~2.82百分点和9.75%~14.16%。综上,甘薯-花生轮作和玉米-花生轮作较连作花生均能提高花生产量,原因在于其能促进花生根系生长,延缓叶片衰老,提高光合速率,尤其是生育后期的光合速率,从而促进干物质的积累及向荚果的分配,此外还能在一定程度上改善花生品质。

为了探究硅改性生物炭(MSC)对酸性土壤化学特性、有机碳组分、硅化学形态及有效性和番茄生长的影响,以入侵植物为原料制备生物炭,研究硅改性生物炭对酸性土壤碳、硅化学形态转化及有效性的影响,评估其对番茄植株生长、土壤酶活性的影响。结果表明,硅改性生物炭显著提升土壤pH值、CEC(阳离子交换量)、EC(电导率)、速效磷和速效钾含量,同时提高土壤水溶性钠和铁的含量,以及增强过氧化氢酶和蔗糖酶的活性,从而提高土壤质量。生物炭改性与未改性均显著增加土壤碳不同组分的含量;与未改性生物炭相比,硅改性生物炭显著增加土壤微生物生物量碳(21.9%)和水溶性有机碳(898.3%)的含量。硅改性生物炭增加土壤有效硅、水溶性硅、游离态硅、活性硅、铁锰结合态硅和无定形硅含量,增幅分别为362.6%,158.9%,18.1%,34.9%,193.8%,74.1%。与此同时,生物炭处理促进番茄植株生长和硅素养分吸收,其中改性生物炭效果更为明显,植株干物质积累、硅含量与吸收量分别增加82.0%,98.9%,261.5%。综上所述,硅改性生物炭显著影响土壤的碳、硅化学形态及转化,增加土壤的有效性和酶活性,从而促进了作物的养分吸收和生长,显示出其在农业生产中具有良好的应用潜力。

研究水肥一体化下不同施磷量对玉米光合特性、荧光参数及产量的影响,为宁夏地区玉米磷肥高效施用提供理论依据和技术支撑。试验于2019—2020年在宁夏银川平吉堡农场开展,设6个磷素水平,依次为0,60,120,180,240,300 kg/hm²,分别记为P0、P1、P2、P3、P4、P5。分析不同磷肥处理下春玉米叶片光合特性和荧光参数的变化规律及其与产量之间的相互关系。2 a 大喇叭口期,P3较其他处理,叶面积指数(LAI)分别提高了4.21%~12.78%,4.68%~15.60%。磷肥用量在180 kg/hm²时对促进玉米叶面积指数和光合势(LAD)效果最优。2 a全生育期内,相较于不施磷肥处理,P3处理下LAD显著提高14.42%。玉米光合特性对施磷强度的响应不同,随着施磷强度的升高,净光合速率(Pn)均在抽雄期后达到最大值,2 a中的R1期,相较于不施磷肥处理,P3处理下Pn显著提高10.68%。玉米花后(R1)叶片胞间CO₂浓度(Ci)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)与Pn均呈显著正相关,决定系数(R²)分别为0.926 5,0.889 9,0.832 0。施磷可以提高玉米光系统Ⅱ综合性能指数(PI),2 a中于R1期,PI有最大峰值,相较于其他处理,P3处理下PI分别提高了1.12%~8.50%,8.47%~15.40%。施磷量为180 kg/hm²产量最大,相较于不施磷处理,2 a产量平均提高17.27%。根据产量拟合方程分析表明,施磷量在179.34 kg/hm²时玉米产量达到最大值13 823.84 kg/hm²。Pearson相关性分析表明,适当的叶面积指数(LAI)会显著影响玉米后期产量,光合参数对玉米产量建成均产生极显著影响;主成分分析表明,P3处理对玉米产量优化效果综合得分最高。磷肥的合理运筹能够有效地保证较高的SPAD值、PSⅡ反应中心的活性,提高玉米对光能的捕获与利用,促进光合作用,从而提高玉米的产量。

为明确Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子基因VDAG_04814对大丽轮枝菌的生长发育及致病过程中的作用。利用聚乙二醇介导的同源重组构建VDAG_04814基因敲除突变体。将野生型菌株和突变体菌株分别接种至添加过氧化氢、氯化钠、氯化钾、山梨醇、十二烷基硫酸钠、刚果红的PDA培养基以及铺有无菌玻璃纸的培养基,分析其抗氧化胁迫、盐胁迫、渗透胁迫、细胞壁细胞膜完整性胁迫的水平和菌株穿透能力;测定其致病力,检测马铃薯植株中真菌生物量。经潮霉素筛选和PCR验证,正确的敲除转化子可扩增到上下游各1 500 bp及敲除片段序列全长4 500 bp的DNA条带。ΔVDAG_04814菌株生长速度缓慢、黑色素形成能力降低;在添加过氧化氢、氯化钠、氯化钾的氧化胁迫和盐胁迫培养基上,ΔVDAG_04814相较于野生型菌株受到的抑制率更高;在添加山梨醇的渗透胁迫培养基上,ΔVDAG_04814的生长抑制率显著低于野生型菌株;在添加十二烷基硫酸钠、刚果红的细胞壁细胞膜完整性胁迫培养基中生长并没有受到抑制;在铺有无菌玻璃纸培养基上,ΔVDAG_04814没有菌落长出,而野生型菌株有正常形态的菌落长出;致病力测定表明,ΔVDAG_04814菌株的致萎程度较野生型菌株显著下降,致萎指数为47.22~55.56。综合上述结果,VDAG_04814基因能够调控大丽轮枝菌的生长发育、抗胁迫能力、穿透能力以及对马铃薯的致病力,可为马铃薯黄萎病的防控提供新靶点。

探究内蒙古自治区通辽市牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染毒株主要基因型,为BVDV流行病学及防控提供参考依据。试验前期在内蒙古通辽市某牛场采集腹泻犊牛粪便样品经PCR检测,将BVDV阳性的粪便样品处理后接种到牛肾细胞(MDBK)中进行分离,通过RT-PCR、间接免疫荧光染色对分离株进行鉴定,并对其基因组全长进行测序,根据5'UTR 、N^pro和E2基因序列进行遗传进化分析和基因分型鉴定。结果表明,试验成功分离到一株BVDV毒株,将其命名为NM-21,接种NM-21的MDBK未产生细胞病变,说明该毒株为非细胞病变型(NCP),RT-PCR、间接免疫荧光染色鉴定均为阳性,病毒滴度为10^-3 TCID₅₀/mL。基于基因组全长序列、5'UTR 、N^pro和E2基因序列的同源性和遗传进化分析,分离株NM-21与中国内蒙古自治区毒株NM2103(GenBank登录号ON337882.1)核苷酸同源性最高,为BVDV-1c亚型。

由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的高度接触性胃肠道传染病对我国养猪业造成巨大的经济损失。为建立PEDV抗体检测方法及N蛋白的功能研究奠定基础,通过噬菌体展示技术针对PEDV N蛋白进行筛选获得其特异性的纳米抗体(Nb)。利用前期制备的N蛋白免疫羊驼,采集其外周血并分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增重链抗体重链可变区(VHH),插入pCANTAB5E-ccdb载体,电转化至ER2738感受态细胞,构建VHH噬菌体展示文库;随后,以PEDV N蛋白作为靶向蛋白,对文库进行4轮淘选获得阳性噬菌体,将其克隆至pET-30a 载体,表达纯化后通过间接ELISA、Western Blot鉴定Nb的结合力和特异性。结果显示,羊驼经5次免疫后,抗体效价达到1∶25 600。构建的噬菌体展示文库库容为4.72×10⁸,丰度为4.3×10¹⁰ cfu/mL,阳性率为93.75%。经过4轮筛选,获得16株氨基酸序列不同的Nb,随后验证了Nb45与PEDV N蛋白具有良好特异性和结合能力。研究筛选获得了PEDV N蛋白特异性Nb,为PEDV检测方法的建立和基础研究提供生物材料。

为探究钙依赖蛋白激酶(CDPK)在小麦生长和逆境应答中的作用,从普通小麦中克隆了TaCDPK17基因,并对其进行了序列结构、表达模式和抗逆功能初步分析。结果表明,TaCDPK17基因编码区长1 701 bp,编码566个氨基酸,具有CDPK家族的典型结构特征,包括1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和4个EF手型结构域。对TaCDPK17与其他12种植物的CDPK17进行进化树分析表明,TaCDPK17与禾本科作物,特别是节节麦、大麦的CDPK17序列有较高同源性。TaCDPK17基因启动子区域富含与激素调控、光照响应,以及非生物应答胁迫相关的顺式调控元件,其中,脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)和茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA)数量较多。基于实时荧光定量PCR的表达分析结果显示,TaCDPK17受100 μmol/L ABA、100 μmol/L茉莉酸甲酯、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl诱导后,表达量有不同程度升高。在2 μmol/L ABA和100 mmol/L NaCl胁迫处理条件下,过表达TaCDPK17的拟南芥种子萌发率显著高于野生型对照。同时,过表达TaCDPK17缓解了ABA或渗透胁迫处理对幼苗根生长的抑制作用。在气孔关闭过程中,过表达TaCDPK17的转基因植物对ABA更敏感,与野生型植物相比,表现出更强的气孔关闭趋势。这些结果表明,TaCDPK17在小麦逆境胁迫和激素信号应答中发挥着重要作用。

EXORDIUM(EXO)基因在拟南芥中被确定为油菜素内酯(BR)响应基因,通过介导细胞扩张促进植物生长。为探究EXO基因在甘蓝型油菜中的功能以及在花期不同组织中的表达规律,以甘蓝型油菜中双6号为材料,克隆EXO基因的编码区序列命名为BnEXO,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量技术对BnEXO基因在甘蓝型油菜花期根、茎、叶、花瓣、花蕾和角果皮中的相对表达量进行测定。结果表明,BnEXO基因的CDS序列为945 bp,BnEXO为稳定亲水性非跨膜蛋白,属于分泌蛋白,在细胞外表达,蛋白的二级结构以无规则卷曲为主。不同组织中的表达分析结果表明,BnEXO基因在不同组织中的表达量由高到低依次为花瓣、角果皮、花蕾、茎、根、叶,在花瓣中的表达量最高。此外,以拟南芥中8个EXO基因家族成员的蛋白序列为基础,鉴定到20个甘蓝型油菜EXO基因(BnaEXO),11个白菜EXO基因(BraEXO)和11个甘蓝EXO基因(BoEXO)。大多数基因家族成员编码蛋白质为稳定性蛋白,定位在细胞外,长度为271~411个氨基酸,等电点预测为5.76~9.60,分子质量为28.76~46.21 ku。系统发育分析将EXO基因分为EXOA、EXOB、EXOC、EXOD和EXOE共5个亚组,EXOB亚组中成员最少。基因结构分析表明,大多数成员只含有1个外显子,没有内含子,EXO基因家族成员序列具有高度的保守性。甘蓝型油菜中成员的启动子区域顺式元件分析结果表明,BnaEXO基因在植物的生长发育及逆境胁迫中发挥重要作用。

植物的生长和生产面临各种生物和非生物胁迫,其中盐胁迫严重影响植物的正常生长发育、品质和产量形成。植物在长期的演化过程中,进化出了适应盐胁迫的形态结构、生理生化反应和遗传基础。在形态结构上,耐盐植物的叶片具有蜡质层、气孔密度低于盐敏感植物,另外具有泌盐或者阻断功能的盐腺、毛状体、盐囊泡、凯氏带等结构;在生理活动调节方面,一方面耐盐植物具有高的酶促和非酶促抗氧化物质,如SOD、CAT、酚类物质等,另一方面耐盐植物具有较高的渗透调节物质含量,或者在盐胁迫下可以合成渗透调节物质,包括有机物质可溶性蛋白和糖以及无机盐离子等;在分子机理方面,SOS途径是研究得最为清晰的离子调控途径,通过SOS1、SOS2和SOS3协同作用维持细胞内Na⁺/K⁺平衡;此外,植物激素及碳代谢途径在植物耐盐过程中亦具有重要作用。本研究通过综述植物耐盐研究进展,探讨耐盐植物在形态结构、生理基础、遗传分子基础和转基因手段在响应盐胁迫的潜在研究重点和方向,有助于研究人员快速找到切入点,逐步完善植物的耐盐机理体系,加快耐盐植物的高效利用。