利用RNAi研究棉花SSH文库上调表达EST的功能

doi:10.7668/hbnxb.2018.01.012

摘要/Abstract

摘要： 为了进一步研究棉花体细胞胚胎发生的分子机制，采用RNAi技术，利用棉花生物学国家重点实验室在表达载体pBI121的基础上成功改造的双元表达载体pCRI1210，构建了针对棉花胚性愈伤组织抑制性消减文库中上调表达的4个ESTs干涉载体pCRI210-EST （EST-418、EST-447、EST-496和EST-653）。以从中棉所24中筛选出的体细胞胚胎分化率较高的株系W10的无菌苗下胚轴切段为受体，利用农杆菌介导法转化pCRI1210-EST干涉载体，浸染后的下胚轴切段在愈伤组织诱导培养基上进行分化。利用半定量RT-PCR技术检测愈伤组织的cDNA。结果表明，转化4个ESTs干涉载体后的胚性愈伤组织中均检测到了载体骨架，证明干涉载体均成功整合进了基因组DNA中，而4个ESTs对应的cDNA的表达量均出现不同程度的下调，不同干涉载体转化的下胚轴出愈率呈现上升和下降2种结果。其中转化EST-418干涉载体的下胚轴出愈率与对照相比有所提高，转化EST-447、EST-496和EST-653干涉载体的下胚轴出愈率与对照相比出现不同程度的下降。因此推断，4个ESTs在愈伤组织分化过程中发挥着不同的作用。其中，EST-418在棉花体细胞胚胎发生过程中起抑制作用，而EST-447、EST-496和EST-653国外品种中在棉花体细胞胚胎发生过程中起促进作用，其结果为分离棉花体细胞胚胎发生相关基因提供了技术和理论支撑。

关键词: RNAi, SSH, EST, 愈伤组织

Abstract: In order to further study the molecular mechanism of cotton somatic embryogenesis, this research used the RNAi technology, the pCRI1210 binary expression vector to construct the interference vector of cotton embryogenic callus, based on the expression vector of pBI121 provided by the State Key Laboratory of Cotton Biology, constructed 4 up-regulated expression ESTs interference vectors pCRI1210-EST (EST-418, EST-447, EST-496 and EST-653) from cotton embryogenic callus suppression subtractive library. From the high differentiation rate strain of W10 of 24 sterile CCRI in somatic embryo in seedling hypocotyl as receptor, Agrobacterium mediated transformation of pCRI1210-EST interference vector, dip the hypocotyl segments after induction medium for callus differentiation. The cDNA of callus was detected by semi quantitative RT-PCR technique. The results showed that the conversion of 4 ESTs interference vector after the embryogenic callus were detected in the carrier frame, the interference vector were successfully integrated into the genome of DNA, whereas the expression of 4 ESTs corresponding cDNA showed different degrees of reduction, the transformation of different interference vector of hypocotyl callus increased and fall. The hypocotyl recovery rate of the transformed EST-418 interference vector increased compared with that of the control. The hypocotyl recovery rate of the EST-447, EST-496 and EST-653 interference vectors decreased to varying degrees compared with the control. Therefore, it is concluded that the 4 ESTs played a different role in the process of callus differentiation. The EST-418 inhibited the somatic embryogenesis of cotton, while EST-447, EST-496 and EST-653 played an important role in the process of somatic embryogenesis in cotton, which provided technical and theoretical support for the isolation of cotton somatic embryogenesis related genes.

Key words: RNAi, SSH, EST, Callus

中图分类号:

Q78
S562.03

尹国, 路正营, 李世云, 韩永亮, 张朝军, 李付广. 利用RNAi研究棉花SSH文库上调表达EST的功能[J]. 华北农学报, 2018, 33(1): 71-79. doi: 10.7668/hbnxb.2018.01.012.

YIN Guo, LU Zhengying, LI Shiyun, HAN Yongliang, ZHANG Chaojun, LI Fuguang. Using RNAi to Study the Function of Up Regulation of EST Expression in Cotton SSH Library[J]. ACTA AGRICULTURAE BOREALI-SINICA, 2018, 33(1): 71-79. doi: 10.7668/hbnxb.2018.01.012.

http://www.hbnxb.net/CN/Y2018/V33/I1/71

参考文献

[1] 张朝军,李付广,张玲.植物体细胞胚胎发生机理的研究进展[J].棉花学报,2008,20(2):141-147.
[2] 张朝军,范术丽,武芝霞,等.棉花大田植株叶柄组织培养体系的建立[J].西北植物学报,2011,31(6):1257-1263.
[3] 焦改丽,孟钊红,杨晓黎,等.光学显微及扫描电镜冷台观察陆地棉胚胎发育[J].山西农业科学,2013,41(11):1180-1182,1196.
[4] 王志才,木合热皮亚·艾尔肯,廖茂森,等.影响棉花体细胞胚胎发生和植株再生的关键因素分析[J].新疆农业科学,2011,48(1):39-44.
[5] 王彦霞,王省芬,马峙英.影响棉花幼胚(珠)离体培养及植株建成的因素分析[J].华北农学报,2006,21(S):37-40.
[6] 张朝军,王晔,王玉芬,等.棉花叶柄分化率主基因+多基因混合遗传分析[J].棉花学报,2012,24(1):3-9.
[7] 张朝军,王晔,王玉芬,等.大田棉花真叶叶柄组织培养特性研究[J].棉花学报,2011,23(6):587-591.
[8] 武秀明.陆地棉体细胞胚胎分化过程中特异表达基因的研究[D].北京:中国农业科学院,2008.
[9] 黄冰艳,苗利娟,张新友,等. ahFAD2 基因RNA干扰体的删除筛选标记载体构建及其遗传转化[J].华北农学报,2008,23(5):13-16.
[10] 田莉莉,牛良.GFLV CP 基因RNAi载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果[J].华北农学报,2014,29(S1):1-5.
[11] 王钟.玉米黄质环氧化酶基因的转基因RNA干涉[D].雅安:四川农业大学,2013.
[12] 尹富仕,曾洪梅,张雨良,等.棉铃虫HaHR3 基因的克隆及其植物RNA干扰载体的构建[J].棉花学报,2010,22(2):157-162.
[13] 宋春丽,马俊莲,唐霞,等.RNA干扰技术抑制草莓FaEtr2 基因表达的研究[J].华北农学报,2014,29(1):28-30.
[14] 龚磊,王舰,杨永智.RNA干涉转基因马铃薯对卷叶病毒抗性的研究[J].湖北农业科学,2016,55(8):1994-1997.
[15] 王彦霞,刘正杰,马峙英,等.RNA干涉技术与棉花高油育种[J].棉花学报,2011,23(2):178-183.
[16] 田迪,刘早利,陈亚红,等.水稻细胞色素P450基因家族成员CYP81A6 基因RNAi载体构建[J].分子植物育种,2016,14(2):370-373.
[17] 王更先,司马杨虎,张升祥,等.RNA干扰沉默BmDHS 基因对家蚕生长发育的影响研究初探[J].华北农学报,2011,26(2):13-16.
[18] 包崇来,杜黎明,胡天华,等.紫红线茄转基因体系优化及SmARF8 基因RNA干涉表达载体的遗传转化[J].园艺学报,2014,41(6):1105-1114.
[19] 李磊.RNA干涉抗矮花叶病转基因玉米株系后代鉴定[D].雅安:四川农业大学,2013.
[20] 龚磊.RNA干涉转基因马铃薯抗卷叶病毒(PLRV)抗病性研究[D].西宁:青海大学,2013.
[21] 王金彦,潘丽娟,杨庆利,等.花生EST-SSR分子标记的开发[J].华北农学报,2009,24(S):42-45.
[22] 任建东,李凤珍,许媛君,等.基于EST-SSR分子标记的青海高原以礼草属主要物种的遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报,2016,17(4):663-670.
[23] 周萌,李友勇,孙雪梅,等.基于EST-SSR标记的云南大茶树遗传多样性分析[J].华北农学报,2013,28(S):91-96.
[24] 胡宏霞,穆国俊,侯名语,等.河北省花生地方品种基于EST-SSR的遗传多样性及性状-标记相关分析[J].植物遗传资源学报,2013,14(6):1118-1123,1129.
[25] 包文风,王吉明,尚建立,等.基于公共数据库的西瓜EST-SSR信息分析与标记开发[J].华北农学报,2011,26(2):85-89.
[26] 盖树鹏,穆平,张风,等.休眠解除过程中牡丹花芽均一化酵母杂交文库的构建[J].植物遗传资源学报,2012,13(3):497-501.
[27] 蔡健,祝旋,谢实龙,等.利用EST-SSR标记和形态性状检测31个芍药品种的遗多样性[J].华北农学报,2016,31(S):92-96.
[28] 刘佳杰,林清芳,李连国,等.蒙古沙冬青冷冻胁迫SMART cDNA文库的构建及序列分析[J].植物遗传资源学报,2011,12(5):770-774.
[29] 程文翰.棉花(Gossypium hirsutum L.)体细胞胚胎发生的生理及分子机制研究[D].石河子:石河子大学,2016.
[30] 程文翰,朱华国,李鹏飞,等.棉花多胺HPLC的测定方法优化及其在体细胞胚胎发生过程中的变化规律[J].棉花学报,2014,26(2):138-144.
[31] 张云超,杨细燕,何良荣,等.鲁棉6号体细胞胚胎发生过程及植株再生[J].华中农业大学学报,2014,33(2):22-27.
[32] 丁喜莲,曲延英,李琼,等.六个海岛棉品系体细胞胚胎发生及再生体系的研究[J].生物技术通报,2016,32(1):97-102.
[33] 李雪姣,张耿,顾爱侠,等.芸薹属作物EST-SNP的发掘与分析[J].植物遗传资源学报,2010,11(6):772-776.
[34] 郭九峰,孙国琴,乔慧蕾.水分胁迫柠条锦鸡儿叶片均一化全长cDNA文库的构建及EST分析[J].华北农学报,2012,27(3):67-71.
[35] 徐洪伟,杜丰平,张鑫,等.体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶(SERK)的生物信息学分析[J].吉林师范大学学报:自然科学版,2016,37(1):101-104,107.
[36] 郭家雁,张霞,丁喜莲,等.不同处理诱导新海16号体细胞胚胎同步化发生[J].棉花学报,2017,29(4):385-392.

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