多枝赖草基因组Mb级DNA制备和酶切方法的优化

doi:10.7668/hbnxb.2007.06.006

华北农学报 ›› 2007, Vol. 22 ›› Issue (6): 24-29. doi: 10.7668/hbnxb.2007.06.006

所属专题： 生物技术；

多枝赖草基因组Mb级DNA制备和酶切方法的优化

徐粤宇¹, 周玉雷², 赵茂林³, 王志平⁴, 王克武⁴, 张艳¹

1. 首都师范大学, 北京, 100037;
2. 甘肃农业大学, 甘肃, 兰州, 730070;
3. 北京市农林科学院, 北京, 100097;
4. 北京市土肥工作站, 北京, 100029

收稿日期:2007-03-28 出版日期:2007-12-28
通讯作者: 赵茂相(1965-), 男, 山西原平人, 研究员, 研究生导师, 主要从事小麦和多枝赖草分子细胞遗传学的研究
作者简介:徐粤宇(1976-), 男, 湖南湘潭人, 硕士, 主要从事多枝赖草和湘莲基因组文库、基因克隆、生物制药和生物信息学的研究
基金资助:
国家自然科学基金(3037090530571135); 北京市自然科学基金(5032009)

Optimized Method of Preparing and Digesting Megabase-size DNA of Leymus multicaulis Genomes

XU Yue-yu¹, ZHOU Yu-lei², ZHAO Mao-lin³, WANG Zhi-ping⁴, WANG Ke-wu⁴, ZHANG Yan¹

1. Capital Normal University, Beijing 100037, China;
2. Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;

3. Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097;
4. Beijing Soil and Fertilizer Station, Beijing 100029, China

Received:2007-03-28 Published:2007-12-28

摘要/Abstract

摘要： Mb级DNA的制备和酶切是构建YAC, PAC, BAC, BIBAC和TAC文库与大尺度物理图谱的基础。以浓度0.4%(m/m)NaCl人工模拟盐池中生长的多枝赖草再生叶为材料提取细胞核, 经钢丝细胞筛过滤, 多次回收滤渣和离心上清中的细胞核, 相差显微镜调浓度达10⁸个/mL后, 经LMP包埋, 蛋白酶K降解核蛋白, 脉冲电泳纯化回收后, 在LMP胶块中2 Mb以上DNA的浓度约为250 ng/μL。在胶中经Hind III部分酶切再用脉冲电泳回收不同大小范围的DNA, 电洗脱浓缩除盐后浓度约为25 ng/μL。用此方法得到的核DNA不但无细胞器DNA等的污染, 而且浓度高, 可直接用于各种人工染色体文库的构建。

关键词: 多枝赖草, Mb级DNA, 基因组文库, 脉冲交变电场电泳, 酶切

Abstract: Preparation and digestion of Megabase-size DNA with high quality is the basis for construction of genomic library with large DNA inserts such as yeast articial chromosome(YAC), bacterial artificial chromosome(BAC), binary BAC library(BIBAC), transformation-competent artificial chromosome(TAC), and for long-range physical mapping. This method of embedding the nuclei is optimized to prepare Megabase-size DNA of Leymus multacaulas genomes with high yield and purity. Generally, it includes isolation of purified nuclei by deferential centrifugation, embedment of the nuclei in 1ow-melting-point agarose pulgs, and digestion with proteinase K to release Megabase-size DNA.To purify the high molecular weight DNA with pulsed field gel electrophoresiscan avoid the contaninants of organellar and small molecular weight DNA.Selecting digested DNA fragments‘between 9-300 kb after partial digestion. It proves that the method is suitable for construction of genomic library of Leymus multicaulas.

Key words: Leymus multicaulis, Megabase-size DNA, Genomic library, Pulsed field gel electrophoresis, Digestion

中图分类号:

徐粤宇, 周玉雷, 赵茂林, 王志平, 王克武, 张艳. 多枝赖草基因组Mb级DNA制备和酶切方法的优化[J]. 华北农学报, 2007, 22(6): 24-29. doi: 10.7668/hbnxb.2007.06.006.

XU Yue-yu, ZHOU Yu-lei, ZHAO Mao-lin, WANG Zhi-ping, WANG Ke-wu, ZHANG Yan. Optimized Method of Preparing and Digesting Megabase-size DNA of Leymus multicaulis Genomes[J]. ACTA AGRICULTURAE BOREALI-SINICA, 2007, 22(6): 24-29. doi: 10.7668/hbnxb.2007.06.006.

http://www.hbnxb.net/CN/Y2007/V22/I6/24

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[1]	张艳, 赵茂林, 孙淼, 徐粤宇. 载有抗逆性基因的多枝赖草染色体连锁群的特定TAC克隆的鉴定[J]. 华北农学报, 2008, 23(5): 6-12.
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