野大豆盐碱胁迫相关GsTIFY6B基因克隆及表达特性分析

阎文飞1,2,程凡升1,姜新强3,刘翠霞2,朱 丹2

(1.青岛农业大学 食品科学与工程学院,山东 青岛 266109;2.青岛农业大学 生命科学学院,山东 青岛 266109;3.青岛农业大学 园林与林学院,山东 青岛 266109)

摘要为研究野大豆TIFY家族基因在野大豆耐盐碱过程中的分子特性及表达特性,以极度耐盐碱野大豆G07256的cDNA为模板,结合前期转录组数据,采用同源克隆的方法,获得了GsTIFY6B基因,其全长CDS大小为1 047 bp。GsTIFY6B蛋白编码348个氨基酸,分子量为36.8 ku,等电点为9.12,是一个不稳定蛋白。系统进化树分析结果显示GsTIFY6B与大豆、绿豆、木豆和蔓花生的TIFY家族蛋白同源关系最近,含保守域TIFY和Jas。采用荧光定量PCR技术检测GsTIFY6B在野大豆不同部位以及盐碱胁迫和激素处理下的转录水平,结果表明,GsTIFY6B在根中相对表达量最高;在盐胁迫处理下,GsTIFY6B在野大豆根和叶中的表达量均表现出上调;在碱胁迫处理下,GsTIFY6B在野大豆叶和根中的表达量表现出先下调后上调表达,推测该基因可能参与野大豆盐碱胁迫防御反应;在ABA胁迫处理下,GsTIFY6B在野大豆的根中表现出下调表达,而在叶中6,12 h出现上调表达;在MeJA胁迫处理下,GsTIFY6B在根中先下调后上调表达,而在叶中表现出上调。研究表明,GsTIFY6B可能通过参与ABA和MeJA信号通路积极响应盐碱胁迫,对后期研究野大豆耐盐碱的分子机制提供了理论基础。

关键词野大豆;GsTIFY6B;基因克隆;盐碱胁迫

土壤盐碱化是影响农耕的突出问题,我国盐碱地面积大约为9 900万hm2[1],严重影响了我国粮食作物的产量和质量。盐碱胁迫会严重抑制植物的生长发育,其中,Na+可引发离子毒害,同时碱胁迫中的HCO3-和CO32-的存在会导致pH值升高,引起混合毒害作用[2]。野大豆(Glycine soja)是大豆(Glycine max)的野生近缘种,在我国分布最广,种类最多;自然条件下生长的野大豆在遗传方面未受到人为选择的影响,而且在长期的自然选择中形成了丰富的变异类型,具有优良的耐盐碱、抗病虫等性状,保留了很多丰富的功能蛋白资源。前期研究从吉林省白城市重度盐碱地采集野生大豆,经过耐盐碱分析挖掘到极耐盐碱野大豆G07256[3]。本研究以野大豆G07256为材料,深入挖掘耐盐碱蛋白,对于培育具有耐盐碱特性的大豆新品种,具有重要的现实意义。

关于植物耐盐碱分子机制的研究,近年来,越来越多的学者从生态学、遗传学、分子生物学、转录组学、蛋白组学等多个领域进行了多方面研究。Ge等[4]通过转录组测序和生物信息学手段构建了野大豆碳酸盐胁迫基因调控网络。Ji和Lin等[5-6]提出了SOS3/SCaBP8-SOS2-SOS1和SCaBP1-PKS5/24-AHA2盐碱胁迫信号传导通路。Sunkar等[7]和Phillips等[8]从miRNA和降解组方面进行了植物耐逆境的研究。关于野大豆的耐盐碱机制,前期研究发现,TIFY家族基因在野大豆中有34个[9],拟南芥中有18个[10],水稻中有20个[11]。该家族蛋白调控了多种植物特有的生命过程,如生长发育、对茉莉酸信号途径的应答等。朱丹等[12]发现,GsTIFY11b受盐和碱胁迫诱导表达,但超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性;Zhu等[13]发现GsTIFY10过度表达可以增强拟南芥对碳酸氢盐的耐受能力,同时在种子萌发、幼苗和成苗期,一些与碳酸盐胁迫相关Marker基因的表达量明显高于野生型植株;Hakata等[14]发现,超量表达水稻的一个TIFY基因能通过积累糖含量从而增加谷粒的大小。植物在应对不利环境时,形成了复杂的信号感知和转导系统。JA和ABA能调节植物的生长、发育和繁殖,并且还能在植物受到生物胁迫和非生物胁迫的条件下通过改变自身细胞内相关基因表达来介导植物的防御反应[15]。最近大量研究表明,TIFY家族的亚家族JAZ类蛋白能够负向调节茉莉酸信号通路中的关键转录激活因子MYC2、MYC3、MYC4、MYB21和bHLH017等[16-17]

本研究以野大豆G07256为研究材料,结合前期数据研究克隆得到GsTIFY6B基因;采用生物信息学的方法对该基因的进化树、保守结构域、氨基酸序列和基本理化性质进行了分析;利用荧光定量检测了GsTIFY6B在野大豆不同组织、盐碱胁迫和MeJA、ABA处理下转录水平变化。从而为探讨GsTIFY6B参与非生物胁迫功能和应答机制,耐盐碱功能蛋白的挖掘以及耐盐碱大豆品种的分子育种和盐碱地的改良提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料处理

将饱满的、无病害的野大豆G07256种子浸没于浓H2SO4中处理8~10 min以去除泥膜,倒净浓H2SO4,用无菌水冲洗3~4遍后接种于1/2 MS固体培养基上(pH值5.8),25 ℃暗培养,萌动后置于光下。当幼苗长至21 d时,分别取大豆幼苗的根、茎、叶、子叶各3份,液氮速冻,然后放-80 ℃冰箱保存。

待幼苗长至21 d时,分别在100 mmol/L NaCl溶液、50 mmol/L NaHCO3溶液(pH值8.5)、100 μmol/L ABA、50 μmol/L MeJA条件下处理0,1,3,6,12 h后,迅速剪取幼嫩的叶片和根,置于-80 ℃保存。

1.2 RNA提取和cDNA合成

以1.1中野大豆的根、茎、叶、子叶为植物材料,采用Eastep® Super总RNA提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)提取总RNA,检测RNA浓度及质量。cDNA反转录采用GoScriptTm Reverse Transcription System试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司),将反转录产物稀释5倍后-20 ℃保存备用。

1.3 GsTIFY6B基因克隆

以大豆基因组序列为参考设计目的基因全长序列扩增的特异引物,用PrimeSTARTM HS DNA Polymerase,以野大豆总cDNA为模板和基因特异引物进行PCR扩增。PCR反应的体系为:10 μL 5×PrimeSTARTM HS PCR Buffer,4 μL dNTP mix(2.5 mmol/L each),2 μL 5′ PCR Primer(10 μmol/L),2 μL 3′ PCR Primer(10 μmol/L),1 μL稀释5倍的cDNA模板,0.5 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase,PCR-Grade H2O补足体积(总体积50 μL)。PCR反应的条件为:94 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 70 s,35个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保存。

将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,利用Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)回收目的条带,并与pMD19-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂在有氨苄青霉素的LB平板上,挑取单菌落鉴定,根据菌落PCR结果,将鉴定出的阳性克隆交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1. 4 GsTIFY6B生物信息学分析

利用DNAMANV6分析野大豆GsTIFY6B氨基酸序列;采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线软件预测野大豆GsTIFY6B的分子量、理论等电点、分子式、稳定性和脂肪指数。利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在线软件预测野大豆GsTIFY6B的亲疏水性;利用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件分析野大豆GsTIFY6B的跨膜结构;利用(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测野大豆GsTIFY6B的二级结构;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)预测野大豆GsTIFY6B的三级结构。利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下载与野大豆GsTIFY6B的同源性较高的氨基酸序列,用MEGA 5软件对野大豆GsTIFY6B氨基酸序列及其同源性较高的氨基酸序列进行氨基酸比对,采用NJ(Neighbor-joining)法构建野大豆GsTIFY6B的系统进化树;利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme-chip)分析GsTIFY6B的保守结构域。

1.5 GsTIFY6B基因表达特性

设计野大豆GsTIFY6B基因的定量引物RT-GsTIFY6B-F(5′-ATACCTGTTACCACGCCTCATT-3′)、RT-GsTIFY6B-R(5′-GCAGAAGGCGCAGATGGTC-3′),内参基因Q-Gsgapdh-F(5′-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3′)、Q-Gsgapdh-R(5′-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3′)。利用荧光定量PCR分析GsTIFY6B基因在野大豆根、茎、叶、子叶等不同组织中的表达特异性[18];以及在100 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaHCO3、100 μmol/L ABA、50 μmol/L MeJA处理下在野大豆根和叶中的表达特异性。

2 结果与分析

2.1 GsTIFY6B基因克隆

根据公布的大豆基因组序列,设计GsTIFY6B同源克隆引物,以野大豆根和叶的cDNA为模板,经高保真PCR扩增后得到GsTIFY6B基因全长,经连T-载体测序后,获得野大豆GsTIFY6B的CDS全长序列1 047 bp,将其翻译成氨基酸序列,共编码348个氨基酸(图1)。

图1 GsTIFY6B 碱基序列和氨基酸序列
Fig.1 The base sequence and amino
acid sequence of GsTIFY 6B

2.2 GsTIFY6B进化树分析与保守结构域预测

将野大豆GsTIFY6B的氨基酸序列放到NCBI中进行比对,下载了12个与GsTIFY6B氨基酸序列同源性相对较高的蛋白序列构建进化树,由图2可以看出,GsTIFY6B与大豆GmTIFY6B(KHN16562.1)同源性最近,与绿豆VrTIFY6B(XP 014510328.1)、木豆CcTIFY6B(KYP61540.1)、蔓花生AdTIFY6A(XP 015957233.1)等豆科植物也有较高的同源性。通过在线软件MEME分析了这些蛋白的保守结构域,发现所有这些与GsTIFY6B同源性较高的蛋白都有3个共同的保守结构域:N端保守区、TIFY结构域和Jas结构域(图3)。

图2 GsTIFY6B进化树分析
Fig.2 Phylogenetic tree analysis of GsTIFY6B

图3 GsTIFY6B的保守结构域分析
Fig.3 Conserved domains analysis of GsTIFY6B

2.3 GsTIFY6B蛋白理化性质分析和蛋白结构预测

用ProtParam在线软件对GsTIFY6B氨基酸序列进行分析,发现GsTIFY6B蛋白分子量为36.8 ku,等电点为9.12,分子式为C1617H2597N447O504S14,不稳定系数为41.89,是一个不稳定蛋白,与之前下载的12个GsTIFY6B同源关系较近的蛋白进行分析,发现均为不稳定蛋白。脂肪族氨基酸指数是衡量蛋白质稳定性的指标,GsTIFY6B脂肪指数为77.33,与同源关系较近蛋白相比最大,其稳定性最高(表1)。对GsTIFY6B蛋白进行亲疏水性预测发现,该蛋白亲水性氨基酸均匀地分布在整个肽链中,且多于疏水性氨基酸,因此,为亲水性蛋白(图4-A)。对GsTIFY6B蛋白有无跨膜性进行分析,发现所有氨基酸均在膜外,且无跨膜结构(图4-B)。对GsTIFY6B蛋白二级结构进行预测,发现α-螺旋占23.56%,β-折叠占10.06%,延伸链占17.24%,无规卷曲占49.14%(图4-C)。采用SWISS-MODEL构建GsTIFY6B蛋白质三级结构,发现其结构比较简单,主要由α螺旋和无规则卷曲组成,与二级结构预测结果一致(图4-D)。

2.4 GsTIFY6B基因在野大豆不同组织中的表达特性分析

荧光定量PCR结果显示,GsTIFY6B基因在野大豆的根、茎、叶、子叶中均有表达,且在根中相对表达量最高,约为在子叶中的6倍(图5);在子叶、茎、叶中的相对表达量相差不大,说明GsTIFY6B在野大豆的不同组织中表现出表达特异性。张晋玉等[19]研究发现,GmZHD1在大豆的种子、叶片和花中表达较高,但在花中表达最高。本研究发现,在野大豆根中表达量最高,说明GsTIFY6B主要参与野大豆根中的代谢活动,可能与其吸收营养物质有关。

表1 GsTIFY6B及相近氨基酸的基本理化性质
Tab.1 The basic physical and chemical properties of GsTIFY6B and near amino acids

A.亲疏水性预测;B.跨膜结构预测;C.二级结构预测;D.三级结构预测。
A.Hydrophilicity and hydrophobicity prediction;B.Transmembrane structure prediction;C.Secondary structure prediction;D.Tertiary structure prediction.

图4 GsTIFY6B的亲疏水性跨膜结构、二级、三级结构预测
Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity,transmembrane structure,secondary and tertiary structure prediction of GsTIFY6B

图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图6-7同。
Bars with different lowercase letters indicate significant differences
by Turkey HSD test(P<0.05). The same as Fig.6-7.

图5 GsTIFY6B在野大豆不同组织的相对表达量
Fig.5 Relative expression of GsTIFY6B in different
of Glycine soja

2.5 野大豆GsTIFY6B基因在盐碱胁迫下的表达特性分析

为更深入地了解野大豆GsTIFY6B参与的生物学功能,采用荧光定量PCR分析其在100 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaHCO3胁迫处理下野大豆叶和根中的相对表达量。从图6可以看出,在盐碱胁迫处理下,GsTIFY6B的相对表达量出现上调。NaCl胁迫时,GsTIFY6B在野大豆根和叶中的诱导表达量分别在6,3 h达到峰值,分别为0 h表达量的13,12倍。在NaHCO3胁迫处理初期,GsTIFY6B的相对表达量在根和叶中都有略微的下调,而在6 h表现为上调,在12 h达到峰值,分别为0 h表达量的8,10倍。说明GsTIFY6B受盐碱胁迫诱导表达,在盐碱胁迫信号通路中发挥重要作用,且野大豆响应NaCl胁迫的方式与NaHCO3截然不同。

图6 盐碱胁迫处理下 GsTIFY6 B 在野大豆根和叶中的相对表达量
Fig.6 Relative expression of GsTIFY6 B in Glycine soja roots and leaves with the treatment of salt and alkaline

2.6 野大豆GsTIFY6B基因在ABA和MeJA处理下的表达特性分析

作为TIFY家族的蛋白,特别是JAZ亚族,在JA信号通路中发挥重要作用。有研究表明,JAZ蛋白通过TIFY结构域和负调节子NINJA蛋白之间的相互作用,从而抑制JA信号通路[15]。采用荧光定量PCR分析了GsTIFY6B响应ABA和MeJA胁迫时的调控机制。从图7可以看出,在100 μmol/L ABA处理下,GsTIFY6B在野大豆根中相对表达量明显下调,且在3 h表达量最低;而在叶中,前3 h相对表达量变化不明显,在6 h之后表现为明显上调表达,且在12 h达到峰值,说明GsTIFY6B在应对ABA胁迫时,在根和叶中表现出截然不同的应答模式;在MeJA处理时,GsTIFY6B在根中1,3 h下调表达,6,12 h上调表达,说明GsTIFY6B在中后期响应MeJA信号,而在叶中GsTIFY6B的相对表达量呈现出上调表达,且在3 h达到峰值,上调了约9倍。说明GsTIFY6B主要在野大豆的叶中积极响应植物激素ABA和MeJA。

图7 植物激素ABA和MeJA处理下 GsTIFY6B在野大豆根和叶中的相对表达量
Fig.7 Relative expression of GsTIFY6B in Glycine soja roots and leaves with ABA and MeJA

3 讨论与结论

关于植物耐盐碱的分子机制,转录调控子在调控上游起着重要的作用,例如:WRKY转录因子有高度保守的WRKY结构域,其转录激活与WRKY蛋白的磷酸化有关[20],刘辉等[21]研究发现,巴西橡胶树中HbWRKY41在高盐胁迫下被强烈诱导;MYB转录因子具有高度保守的MYB结构域,尤其是R2R3-MYB类转录因子在盐碱胁迫中发挥重要作用[22],王晓雪等[23]研究发现,OsMYB56转录因子能够提高转基因水稻耐盐能力。DREB转录因子属于植物AP2/ERF转录因子超家族,含有60~70个氨基酸的AP2保守区,通过与抗逆相关基因启动子区域中的DRE/CRT顺式作用元件结合从而调控下游基因表达[24],张彬彬等[25]研究发现,TaDREB3转录因子可以提高大豆耐盐碱能力。

TIFY家族蛋白是植物特有的转录因子,主要定位于细胞核,起着转录调控的作用。包含28个氨基酸和一个TIF[F/Y]XG核心模体,其中疏水性氨基酸是可变的,而甘氨酸完全保守[26]。TIFY家族蛋白可以分为4个亚家族,分别是ZML、JAZ、PPD和TIFY亚家族[27]。本研究克隆获得一个TIFY亚家族蛋白-GsTIFY6B,编码348个氨基酸,通过进化树和结构域分析发现GsTIFY6B与大豆、绿豆、木豆和蔓花生的TIFY蛋白亲缘关系最近,都具有N端保守结构域,还有TIFY和Jas结构域。通过与其相似性较高的氨基酸进行比对发现均为不稳定蛋白,它们的等电点在8.82~9.48,均为不稳定蛋白。通过预测GsTIFY6B的二级结构和三级结构发现其主要有α螺旋和无规则卷曲构成,而三级结构比较简单。

植物对非生物胁迫的应答是一个极为复杂的过程,有研究表明,非生物胁迫所引起植物生理生化指标改变是由植物体内的保护系统和相关基因表达共同调控的,且基因的表达具有组织特异性[28]。植物在相应盐碱胁迫时,最先感知的器官为根。赵春梅等[29]研究发现,GmCHI1p具有明显的根组织特异性,且在伤害诱导时强烈表达。本研究通过荧光定量PCR检测发现GsTIFY6B在野大豆中的不同组织中均有表达,且在根中相对表达量最高。在NaCl胁迫处理下,GsTIFY6B相对表达量在根和叶中均出现上升趋势,且上升趋势相似,可以推测出GsTIFY6B在野大豆的根和叶中均能正向调控NaCl胁迫对野大豆的伤害,从而提高大豆耐盐能力。在NaHCO3胁迫处理前期,GsTIFY6B在根和叶中的相对表达量受到抑制,而后出现明显上升,可能是因为GsTIFY6B基因在NaHCO3处理下需要经历一个过渡期或启动期才能被诱导表达。

另外,植物激素ABA、MeJA等在植物逆境胁迫应答过程中通过相互协同或相互拮抗作用对植物生长和发育起重要的调控作用[30]。郭贵华等[31]研究发现,ABA具有缓解孕穗期干旱胁迫对水稻生理代谢功能的损伤,促进复水后的功能修复,从而减轻干旱对产量的影响。杨艺等[32]研究发现MeJA能够缓解盐胁迫对棉花种子伤害,从而促进棉花种子的萌发和幼苗生长。本研究发现,在ABA胁迫处理下,GsTIFY6B在根中的相对表达量明显被抑制,表现出下调,而在野大豆叶中GsTIFY6B的表达量在前期受到抑制,而6 h之后表达量增加;在MeJA胁迫处理时,GsTIFY6B在根中的相对表达量变化不明显,而在叶中GsTIFY6B的相对表达量呈现出上调表达,且在3 h达到峰值。说明GsTIFY6B响应ABA和MeJA参与野大豆耐盐碱的机制不一样。可能是由于植物激素作用的专一性不明显,通常同一种激素具有多种不同的生理效应,而不同的激素又往往可以引起同一种生理效应[30]

本研究克隆得到了野大豆GsTIFY6B基因全长CDS 1 047 bp,编码348个氨基酸,其理化性质与同源性相近蛋白相似,含有保守结构域TIFY和Jas,在野大豆根中表达量最高。能够积极响应盐碱胁迫、植物激素ABA和MeJA。GsTIFY6B可能通过参与ABA和MeJA信号通路来调控对盐碱胁迫的响应。本研究可为后期植物耐盐碱功能基因的挖掘,培养具有较强耐盐碱能力的大豆,为改良盐碱地和提高我国盐碱地的利用率提供理论研究基础。

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Cloning and Expression Analysis of GsTIFY6B Associated with Saline and Alkali Stress in Glycine soja

YAN Wenfei1,2,CHENG Fansheng1,JIANG Xinqiang3,LIU Cuixia2,ZHU Dan2

(1.College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;3.College of Landscape Architecture and Forestry,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

AbstractIn order to determine the molecular characterization and expression patterns of TIFY family genes involved in saline and alkali stress in Glycine soja, according to previous transcriptome data,GsTIFY6B was obtained by homologous cloning using cDNA of Glycine soja G07256,with extremely tolerant ability to saline and alkali stress,as its template. The full-length CDS was 1 047 bp. GsTIFY6B protein was an unstable protein with 348 amino acids. Its molecular weight was 36.8 ku and its isoelectric point was 9.12. Phylogenetic tree analysis showed the closest homology of GsTIFY6B to the TIFY family proteins of GmTIFY6B, VrTIFY6B,CcTIFY6B and AdTIFY6A. All those proteins had the conserved domains TIFY and Jas. The transcription level of GsTIFY6B in different parts of Glycine soja as well as response to saline and alkali stress and hormone treatment was detected by Real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the highest relative expression level of GsTIFY6B in roots. Under salt stress,the expression of GsTIFY6B in roots and leaves showed an up-regulation.Under alkali stress,the expression of GsTIFY6B in roots and leaves showed the first down-regulation and then up-regulation expression. It is speculated that the gene might be involved in the defense reaction of saline-alkali stress.Under the ABA treatment,GsTIFY6B showed down-regulated expression in the roots and up-regulated expression at 6,12 h in leaves. Under MeJA stress,GsTIFY6B expression was decreased first and then increased in roots,but showed up-regulation in leaves. This study suggested that GsTIFY6B could positively respond to saline and alkali stress by participating in the ABA and MeJA signaling pathways. These results will provide a theoretical basis for the later study on the molecular mechanism of saline-alkali-tolerant response of Glycine soja.

Key words:Glycine sojaGsTIFY6B;Gene cloning;Saline and alkali stress

中图分类号Q785;S565.03

文献标识码:A

文章编号:1000-7091(2018)04-0082-08

doi:10.7668/hbnxb.2018.04.012

收稿日期2018-03-21

基金项目国家自然科学基金项目(31501331;31501798)

作者简介阎文飞(1992-),女,山东临沂人,在读硕士,主要从事食品生物技术和农产品加工及贮藏研究。

通讯作者朱 丹(1986-),女,湖北黄冈人,讲师,博士,主要从事植物逆境分子生物学研究。