甘肃黑猪H-FABP基因多态性筛查及蛋白功能预测

张 丽,刘丽霞,农伟伦,李慧洁,张国华,卢建雄

(西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730124)

摘要为了明确甘肃黑猪H-FABP基因的遗传特征,采用DNA池结合直接测序技术快速筛查甘肃黑猪H-FABP基因遗传多态性,并利用生物信息学方法预测其编码氨基酸的理化性质及蛋白功能。结果显示,甘肃黑猪H-FABP基因在扩增区域共发现4个突变位点,分别为C734T-Intron1、T152C-Exon2、G30A-Intron2、T121G-Intron2,各等位基因频率在突变前后存在明显差异;该基因编码区全长402 bp,共编码133个氨基酸残基,其中,编码区序列有1个T152C-Exon2的错义突变,氨基酸由原来非极性的异亮氨酸(Ile)转变为极性的苏氨酸(Thr);H-FABP编码蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,二、三级结构均为混合型,β-折叠所占比例最高。蛋白质功能预测结果显示,甘肃黑猪H-FABP编码蛋白存在19个潜在磷酸化位点和1个N-糖基化位点,可能会影响H-FABP基因调控肌内脂肪含量的增加。同源性比较和系统发育树分析表明,甘肃黑猪与偶蹄目动物亲缘关系最近。研究结果可为甘肃黑猪肌内脂肪含量沉积的分子遗传标记提供理论基础,该基因的多态性筛选已成为家畜肉质性状改良的分子研究热点。

关键词甘肃黑猪;H-FABP基因;DNA池;单核苷酸多态性;生物信息学

甘肃黑猪是我国甘肃省培育的第一个瘦肉型专门化新猪种,含有内江猪、巴克夏和八眉猪的血缘,主要分布在甘肃天水、陇南、平凉、庆阳及甘南等地,陕西也有零星分布。甘肃黑猪的繁殖力和纯合度均较高,与其他优质品种公猪杂交后代在繁殖性能及增重速度和胴体瘦肉率方面表现出高的杂种优势。脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABPs)是一类低分子量对脂肪酸有较高亲和力的可溶性蛋白质。至今为止,已经分离出9种类型,其中,心脏型脂肪酸结合蛋白(Hear fatty acid binding proteins,H-FABP)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty acid binding proteins,A-FABP)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(Live fatty acid binding proteins,L-FABP)、肠型脂肪酸结合蛋白(Intestinal fatty acid binding proteins,I-FABP)是该家族中比较常见的4种类型[1]。其中,H-FABP基因是影响肌内脂肪含量(Intramuscular fat,IMF)的主要基因,对机体脂肪代谢有调控作用,研究H-FABP基因多态性对改善猪肉品质具有重大意义[2]。肌内脂肪含量是影响猪肉品质的重要因素,主要作用是在肌内脂肪氧化时溶解肌纤维束,从而提高肌肉嫩度和多汁性,进而能通过Mailard反应产生香味[3]H-FABP作为FABPs家族中的重要成员,其mRNA表达量与IMF显著相关[4],是影响肌内脂肪含量的重要候选基因,深入研究该基因的蛋白结构与功能可为提高猪IMF提供理论基础。

本研究以甘肃黑猪为研究对象,克隆出H-FABP基因4个外显子,快速筛选其多态性,利用生物信息学方法从分子水平预测和分析其氨基酸理化性质、编码蛋白的结构和功能,以期揭示甘肃黑猪H-FABP基因的遗传特征,为该基因相关生长发育性状和肌内脂肪沉积等研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 耳组织DNA的提取及DNA池构建

102头甘肃黑猪新生仔猪耳组织,每头剪取5 g,置于75%乙醇的离心管中保存并做好标记,-70 ℃保存。采用试剂盒法提取基因总DNA。提取好的DNA,经紫外分光光度计检测后稀释成相同浓度,各样品吸取5 μL 用于构建DNA池。

1.2 引物设计PCR扩增及序列测定

参照NCBI网站发布的野猪H-FABP基因序列(No.Y16180),利用Primer 3.0在线软件设计4对特异性引物(表1)用于扩增甘肃黑猪H-FABP基因的4个外显子区域,引物交由苏州金唯智生物有限公司合成。经PCR扩增,获得的良好产物由凝胶回收试剂盒纯化回收后送至苏州金唯智进行双向测序。测序结果用Lasergene系列软件比对、矫正、拼接,最终获得甘肃黑猪H-FABP基因编码区序列。

表1 甘肃黑猪 H-FABP 基因引物信息
Tab.1 Information of H-FABP primersin Gansu black pigs

1.3 生物信息学数据处理

按照参考文献[5-6]中介绍的在线软件对甘肃黑猪H-FABP基因编码区进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 甘肃黑猪H-FABP基因PCR扩增电泳结果

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测获得明亮清晰的条带,片段大小与预期扩增片段长度相符(图1)。

2.2 甘肃黑猪H-FABP基因SNPs筛选及等位基因频率估算

经过软件剪切拼接获得甘肃黑猪H-FABP基因编码区序列402 bp,将拼接好的甘肃黑猪H-FABP基因与GenBank中野猪(Y16180)编码区序列比对,发现存在4个SNPs位点(图2),以外显子和内含子的第1个碱基为基准,在第1内含子734 bp处发生C→T突变,在第2外显子152 bp处发生T→C突变,在第2内含子30,121 bp处发生G→A和T→G突变,分别命名为C734T-Intron1、T152C-Exon2、G30A-Intron2、T121G-Intron2。其中,T152C-Exon2为错义突变,氨基酸由原来的异亮氨酸(Ile)转变为苏氨酸(Thr)。等位基因频率估测结果显示,突变前后存在明显差异(表2)。

M.Marker DL2000;1~4. H-FABP基因Exon1~Exon4 PCR产物。
M.Marker DL2000;1-4. PCR product of Exon1-Exon4.

图1 甘肃黑猪 H-FABP基因扩增产物检测结果
Fig.1 Agarose gel check results of the PCR amplicons
of H-FABP gene in Gansu black pigs

图2 甘肃黑猪H-FABP基因测序结果
Fig.2 Results of sequencing of H-FABP gene in Gansu black pigs

表2 甘肃黑猪 H-FABP基因的SNPs位点突变类型及等位基因频率
Tab.2 SNPs mutation types and allele frequency of H-FABPgene in Gansu black pigs

2.3 甘肃黑猪H-FABP氨基酸理化性质预测分析

甘肃黑猪H-FABP基因编码区翻译的133个氨基酸残基是由20种标准氨基酸构成(图3),其中,负电荷残基总数(Asp + Glu)为18,正电荷残基总数(Arg + Lys)为17;分子式为C653H1052N172O206S4,分子质量约为14.74 ku,半衰期为30 h,不稳定指数为14.42。

图3 甘肃黑猪H-FABP编码氨基酸组成
Fig.3 Putative amino acid composition
of H-FABPinGansublackpigs

2.4 甘肃黑猪H-FABP氨基酸亲水性/疏水性预测分析

甘肃黑猪H-FABP编码氨基酸亲水性/疏水性预测结果如图4所示,横坐标为编码氨基酸位置,纵坐标为亲水性/疏水性分值。正值代表疏水性,负值代表亲水性。其分值越高,疏水性越强;反之,则亲水性越强。在氨基酸多肽链的第113 位丙氨酸(Ala)疏水性最强(+1.289),第103位的天冬氨酸(Arg)亲水性最强(-2.444)。整条氨基酸多肽链中,亲水氨基酸所占比例较高,为62.15%,总平均亲水值为-0.248,所以该蛋白表现为亲水性。

图4 甘肃黑猪H-FABP氨基酸疏水性预测结果
Fig.4Hydrophobicity prediction results
of H-FABP in Gansu black pigs

2.5 甘肃黑猪H-FABP氨基酸信号肽跨膜区的预测分析

信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15~30个氨基酸组成。信号肽是指导新合成蛋白质的跨膜转移的N-末端的短肽链,它负责把蛋白质引导到含不同细胞膜结构的亚细胞器内[7]。信号肽预测结果显示(图5),甘肃黑猪H-FABP氨基酸的C值为0.158,Y 值为0.122,S值为0.104,第14-15位氨基酸之间为切割点。因此,基本可以判定甘肃黑猪H-FABP编码蛋白不存在信号肽。

2.6 甘肃黑猪H-FABP编码蛋白质磷酸化与N-糖基化位点预测分析

甘肃黑猪H-FABP编码蛋白质磷酸化与N-糖基化位点预测结果如图6所示,氨基酸编码序列中存在19个潜在的磷酸化位点,分别为4个Ser位点(Ser56、Ser64、Ser83、 Ser122)、14个Thr位点(Thr8、Thr40、Thr41、Thr51、Thr54、Thr57、Thr61、Thr74、Thr75、Thr103、Thr104、Thr117、Thr119、Thr126)和1个Tyr位点(Tyr20),并存在1个潜在的N-糖基化位点。

图5 甘肃黑猪H-FABP氨基酸信号肽预测结果
Fig.5 Result of signal peptide on Gansu black pig H-FABP

2.7 甘肃黑猪H-FABP蛋白质二级结构和三级结构预测分析

多肽链依赖氢键排列成在一维方向上具有规则重复的构象就是该蛋白质的二级结构。甘肃黑猪H-FABP编码蛋白二级结构和三级结构预测结果如图7,8所示,β-折叠(e)数量最多,α-螺旋(h)数量最少,其次为无规则卷曲,二、三级结构预测该蛋白为混合型蛋白。

实线.磷酸化潜力值;虚线.N-糖基化潜力值。
Full line.Potential of phosphorylation;
Dashed line.Potential of N-Glycosylation.

图6甘肃黑猪H-FABP编码蛋白质的
磷酸化和N-糖基化位点
Fig.6 Phosphorylation and N-Glycosylation sites
oH-FABP in Gansu black pig

h.α螺旋;e.β-折叠;t.β-转角;c.无规则卷曲。
h.Alpha helix; e.Beta sheet; t.Beta turn; c.Random coil.

图7 甘肃黑猪H-FABP蛋白二级结构预测
Fig.7Putative result of H-FABP protein secondary structure inGansu black pigs

A.T152C-Exon2突变前;B.T152C-Exon2突变后。
红色.α螺旋;黄色.β折叠;绿色.β-转角和无规则卷曲。
A.Before mutation T152C-Exon2; B.After mutation T152C-Exon2.
Red.Alpha helix; Yellow.Beta sheet-sheet; Green.Beta turn and random coil.

图8 甘肃黑猪H-FABP蛋白三级结构预测
Fig.8 Putative result of H-FABPprotein tertiary structure in Gansu black pigs

2.8 甘肃黑猪H-FABP氨基酸序列的同源性比较及系统发育分析

甘肃黑猪H-FABP氨基酸与其他物种同源性比较结果显示,H-FABP基因几乎在所有哺乳动物中都有表达,在某些非哺乳动物中也存在,但以哺乳动物为主;从进化树上可以看出,与甘肃黑猪亲缘关系最近的为野驴和绵羊,都为偶蹄目动物,符合物种进化规律(图9)。

图9 甘肃黑猪H-FABP蛋白系统发育树
Fig.9 Phylogenetic tree of H-FABP protein in Gansu black pigs

3 讨论

FABPs家族基因作为影响猪肉嫩度、风味的肉质基因,其4种主要家族基因的多态性对猪肉嫩度、风味的影响程度以及作用原理不同。H-FABP作为主要家族成员,其主要功能是与疏水性配体结合,促使细胞摄取脂肪酸,从而影响猪肉多汁性[8]。单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphisms site,SNPs)是染色体基因组中单个核苷酸碱基以颠换、转换、插入和缺失等形式突变所引起的DNA序列的改变[9],是基因组水平上最常见的一种遗传变异类型,具有多态性丰富和遗传稳定性高等优点,在哺乳动物中平均每300~1 000 bp就有1个SNP位点[10]。位于基因内部的部分编码区的SNPs可引起蛋白质编码氨基酸序列的变异,这种改变会影响DNA各组成元件的功能以及转录产生的mRNA水平和蛋白质的表达,进一步会导致生物机体功能或性状的改变。何桂娟等[11]、周春宝等[12]与周泉勇等[13]分别在莆田黑猪、苏姜猪和玉山黑猪H-FABP基因5′调控区与第2外显子均发现多态性。郭吉利等[14]研究显示,豫南黑猪H-FABP基因5′调控区和第2内含子存在4个SNPs,且第2内含子上的3个酶切位点处于连锁平衡状态。本研究也认为,H-FABP基因为高度多态基因。甘肃黑猪H-FABP基因存在4个碱基突变位点,分别为C734T-Intron1、T152C-Exon2、G30A-Intron2、T121G-Intron2,其中,T152C-Exon2为错义突变,导致氨基酸由原来的异亮氨酸(Ile)转变为苏氨酸(Thr)。覃兆鲜等[15]在陆川猪H-FABP基因编码区第235 bp处发现1个A→G的错义突变,氨基酸由原来的精氨酸变(Arg)变为甘氨酸(Gly)。这可能是由品种、遗传背景、饲养环境等不同导致的。

蛋白质由20种标准氨基酸构成,其不同的空间结构对蛋白质的稳定性、构象和功能具有重要影响。甘肃黑猪H-FABP编码蛋白由133个氨基酸构成,依据氨基酸理论等电点(6.11)、半衰期(30 h)和氨基酸的不稳定指数14.42(<40)推测,该蛋白是稳定蛋白,与高红等[16]分析结果一致,符合贾浩等 [17]关于蛋白质半衰期与稳定性之间呈正相关的理论。总平均疏水性能够体现蛋白质的亲水/疏水性质,且数值越高代表疏水能力越强[18],甘肃黑猪H-FABP编码氨基酸总平均疏水性值为-0.248,由此推断,该蛋白为亲水的可溶性蛋白,与高红等[16]和王兰萍等[19]认为的相同或相近物种间H-FABP基因编码蛋白质差异不大的理论完全一致。蛋白质磷酸化影响着蛋白质翻译后的修饰,发生的酯化作用改变了蛋白质的结构,以磷酸化形式的混合物介导细胞内的活性,既可以改变细胞应激或新陈代谢,又可以调节蛋白质在信号转导中的作用、基因表达、细胞生长和分化[20]。甘肃黑猪H-FABP编码氨基酸有19个潜在的磷酸化位点,这些位点可能影响到细胞内的蛋白质,从而影响机体的生理生化功能。蛋白质经过糖基化作用使不同的蛋白质打上不同的标记,最后形成糖蛋白,从而改变多肽构象和增加蛋白质的稳定性。因此,糖基化作用是对蛋白质很重要的修饰过程。蛋白质序列中的N-糖基化,这种修饰可能干扰酶的折叠,而蛋白质的错误折叠将导致蛋白体降解,或者妨碍通过分泌途径的转运,阻碍底物结合引起活性的丧失[21]。蛋白质糖基化作用对蛋白质折叠、分选及其定位有重要影响,主要修饰天冬酰胺上的N端,参与受体激活、信号转导等作用,影响免疫分子的结构和功能,从而影响机体对抗原的应答反应[22]。甘肃黑猪H-FABP编码蛋白质仅存在1个N-糖基化位点,有可能直接影响H-FABP基因调控IMF的增加。信号肽能引导新蛋白质的合成,决定着该蛋白是否为分泌蛋白以及担负新生肽链在细胞中的定位,从而影响蛋白质在细胞中的功能[23]。因此,信号肽在蛋白质合成过程中起到非常重要的作用,但本研究显示,甘肃黑猪H-FABP基因编码蛋白质不存在信号肽,为非分泌蛋白,与高红等[16]研究结果一致。

蛋白质二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,对其进行预测和分析有助于研究该蛋白质的结构与功能。研究发现,蛋白质二级结构与密码子第2位存在联系,遗传密码的组织结构反映了蛋白质的二级结构,因此,推动蛋白质组织结构的主要适应力之一可能是蛋白质二级结构,影响着蛋白质的折叠,从而影响蛋白质的功能[24]。本研究中,甘肃黑猪H-FABP编码产物二级结构中α-螺旋数量小于30%,β-折叠数量大于30%,由此可推测该蛋白为混合型蛋白;二、三级结构预测结果一致,均以β-折叠为主导地位,其次为无规则卷曲和α-螺旋,不含有其他二级结构,这与高红等[16]、王兰萍等[19]和Zheng等[25]分析结果一致。α-螺旋和无规则卷曲是蛋白质中配体与受体结合的活性部位,无规则卷曲更容易受到侧链的相互影响而改变空间构象[26],H-FABP蛋白质肽链中的某些氨基酸可导致其蛋白质结构发生改变,影响其与受体结合的亲和力及其生物学活性,进而影响猪肉中肌内脂肪含量的分布,从而影响猪肉品质。对错义突变位点T152C-Exon2进行蛋白质二级结构分析表明,突变前后α-螺旋、β-折叠、β-转角均没有改变,可能是编码氨基酸肽链中只有1个错义突变位点,虽然氨基酸改变了,但并没有引起该蛋白质的结构发生变化。突变前后蛋白质三级结构预测分析结果表明,T152C-Exon2位点突变碱基T、 C分别对应的氨基酸为异亮氨酸(Ile)和苏氨酸(Thr),氨基酸的性质由非极性转变为极性。位于编码蛋白质活性中心的大部分氨基酸残基为非极性的疏水性氨基酸,这种变异可能对该蛋白质的功能产生一定影响,但蛋白质三维结构突变前后并没有发生改变。错义突变指碱基序列的改变将导致编码氨基酸的变化,从而对蛋白质产生影响[27]。同源性比较和系统进化树分析发现,甘肃黑猪与绵羊、野驴等偶蹄兽同源性最近,与小家鼠、鼠、褐家鼠的遗传距离最远,亲缘关系也最远,与其他有蹄类可归为一类。

本研究系统地对甘肃黑猪H-FABP基因编码氨基酸的理化特性、蛋白结构和功能进行了预测,为进一步确定H-FABP基因多态性与IMF的关系,寻求与IMF沉积紧密连锁的遗传标记,以便在甘肃黑猪育种实践的标记辅助选择中发挥遗传改良作用提供依据。

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H-FABP Gene Polymorphism Screening and Protein
Function Prediction in Gansu Black Pig

ZHANG Li,LIU Lixia,NONG Weilun,LI Huijie,ZHANG Guohua,LU Jianxiong

(Life Science and Engineering College,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730124,China)

AbstractIn order to identify the genetic characteristics of the H-FABP gene,DNA pooling and direct sequencing technique were used for rapid screening of H-FABP gene polymorphism,the physicochemical properties of the encoded amino acids and the protein structure and function were predicted by bioinformatics in Gansu black pig. The result showed that 4 mutation sites were found in the region of the H-FABP gene amplification in the Gansu black pig. C734T-Intron1,T152C-Exon2,G30A-Intron2,T121G-Intron2,respectively,it was shown that the allele frequencies were significant differences before and after mutation;the CDS region of H-FABP gene in Gansu black pig was 402 bp,encoding 133 amino residues,and T152C were missense mutations,was found in CDS region. Amino acids were converted from threonine(Ile)to threonine(Thr). The H-FABP gene encoding protein of black pig was a stable hydrophilic protein,protein secondary structure and tertiary structure were mixed type,and the proportion of beta folding was the highest. The results of protein function prediction showed that there were 19 potential phosphorylation and 1 N-glycosylation sites,it might affect the increase of fat content in the H-FABP gene regulation muscle;Homology comparison and phylogenetic tree analysis showed that it had most similar genetic relationship between Artiodactyl and Gansu black pig. These provided a theoretical basis for the molecular genetic markers of the intramuscular fat content deposition in Gansu black pigs,the polymorphism screening of the H-FABP gene,it has become a hot spot of molecular research in the improvement of meat quality traits in domestic animals.

Key wordsGansu black pig;H-FABP gene;DNA pooling;Single nucleotide polymorphisms;Bioinformatics

中图分类号S828;Q78

文献标识码:A

文章编号:1000-7091(2018)04-0046-07

doi10.7668/hbnxb.2018.04.007

收稿日期2018-02-23

基金项目国家自然科学基金项目(31460589;31560639);西北民族大学实验室开放项目(SYSKF-2018155)

作者简介张 丽(1980-),女,宁夏石嘴山人,副教授,博士,主要从事家畜遗传育种研究。