葡萄CO4基因的克隆及其对光质响应的表达分析

范 琪,马彦妮,陈佰鸿,左存武,毛 娟

(甘肃农业大学 园艺学院,甘肃 兰州 730070)

摘要为了探究不同光质以及转光条件对葡萄CO4基因表达水平及试管苗叶绿素荧光参数的影响,利用RT-PCR技术,从葡萄贝达试管苗中克隆了一个光质响应基因CO4(GenBank登录号为KY652090),并对其进行生物信息学以及qRT-PCR分析。结果表明,CO4基因片段全长663 bp,编码了248个氨基酸,其开放阅读框为747 bp;葡萄CO4有4个跨膜区,预测其为跨膜蛋白;葡萄CO4的分子式为C1253H1990N324O340S11,预测是疏水性不稳定蛋白。系统进化树分析表明,该蛋白与巨桉CO4最为相似。经荧光实时定量PCR分析表明,在红光转蓝光处理下葡萄CO4表达量显著高于白光(对照),是对照的5.39倍;其次为蓝光处理;在白光转蓝光条件下CO4表达量最低,是对照的54%;红白转光处理下CO4表达量与对照无显著差异。叶绿素荧光参数分析结果显示,红光转蓝光处理后的Fv/Fm(最大光化学效率)、Fv/Fo(潜在活性)和qP(光化学猝灭系数)均显著高于对照,NPQ在该处理下(非光化学猝灭系数)最低;在红光处理下NPQ最高,Fv/Fm、qP最低。葡萄CO4对光质敏感,且在不同光质及转光条件下其响应水平不同,红光转蓝光处理下上调表达显著,且该光照条件下能显著促进葡萄试管苗的光化学能力。为深入研究CO基因在葡萄试管苗感光机理中的作用提供理论依据,并为葡萄光质改良奠定基础。

关键词葡萄;CO4;基因表达;光质;叶绿素荧光参数

光与植物的正常生长密不可分,它不仅是植物光合作用的原动力,还能够调控植物形态建成、生物周期节律、延缓植物衰老、物质代谢以及基因的表达等过程[1-3]

研究表明,蓝光和红光对植物的光形态建成和生长发育均有调节作用,但不同光质对植物的作用效果不同,红光能提高植物的光合效率并能促进试管苗的伸长生长和不定根的形成[4];此外,红光能够促进植物形成愈伤组织,但当其与蓝光配比使用时,在一定范围内蓝光比例越大导致叶片愈伤组织诱导率越低[5-6]。蓝光能诱导植物叶片气孔开启,对叶绿素、碳水化合物和蛋白质的形成以及光合节律等生理过程均有调控作用[7-8]。蓝光不仅能促进光合基因的表达,还有利于葡萄试管苗中白藜芦醇的形成以及干物质积累[9]。有报道认为,组合光比单色光更能促进试管苗生长,红光和红蓝混合光能提高根系的诱导率,促使根系发育健壮[10]。然而,红光与蓝光配比比例对不同试管苗的作用效果不尽相同,因此,基因型不同的植物在不同发育阶段对光质的需求不同。

CONTANS(CO)是植物光周期途径中的核心调控因子,是植物特有的多基因家族,在植物接收、传导光信号的过程中,与植物其他光信号调控蛋白相互作用,以此调控植物一系列生理过程[11]COCO-Like(COL)基因具有N端锌指结构B-box和C端CCT保守结构域,这2个结构对CO基因的功能具有重要作用[12]。在许多植物中发现了COL基因,拟南芥(Arabidopsis thaliana)有17个COL基因[13],水稻(Oryza sativa)有16个[14],番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)中至少有4个基因[15],而葡萄(Vitis vinifera L.)中至少有14个推测的CO基因[16]COCOL在不同植物中的功能可能不同。在拟南芥中,COL1和COL2基因对开花时间无显著影响[17]COL3抑制植物开花,正调控拟南芥光形态建成,促进侧根发育和芽的分化[18]COL4受ABA和盐胁迫的调节,是植物忍受非生物逆境胁迫中的重要调节因子[13];短日照条件下COL5促进植物开花[19],而长日照条件下COL9抑制开花[20]

综上,目前CO基因家族的研究主要集中于如何应对非生物胁迫和响应光周期从而调控植物开花的机制中[16],但CO基因家族对不同光质及转光条件的响应未见报道。本研究克隆获得葡萄光质应答相关的基因CO4(葡萄CO4的分子式为C1253H1990N32403402S11),并对其进行生物信息学分析以及运用qRT-PCR技术分析其在不同光质处理下的表达规律,为葡萄光质改良提供候选基因,并为深入研究葡萄试管苗感光机理提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为葡萄贝达(Vitis riparia×V.labrusca)试管苗,将其单芽茎段接种于GS[21]液体培养基。分别培养于LED白光、红光、蓝光的人工气候培养箱中。培养条件为28 ℃,220 μmol/(m2·s)光照16 h;23 ℃暗培养8 h。

DH5α、AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司;cDNA反转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific(上海)公司;pGEM-Teasy载体、T4 DNA、LigBuffer、普通PCR SuperMix购自TaKaRa(大连)公司;Marker V购自TransGen Biotech(北京)公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 将在GS液体培养基中生长的贝达试管苗放置于不同光质及不同转光条件下处理(表1),35 d后用便携式调制荧光仪(PAM-2100)在黑暗条件下测定试管苗叶片的叶绿素荧光参数,试管苗叶片总RNA的提取使用CTAB法[22]

表1 不同光质和转光培养条件
Tab.1 Treatment conditions of grape plantlets
under different light conversion

1.2.2 基因克隆 PCR MIX、大肠杆菌菌株、pEASY-T1 Cloning Kit均购自北京全式金生物技术有限公司,DL2000 Marker、DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京),荧光定量染料、SYBR Premix Ex Taq kit反转录试剂盒购自大连 TaKaRa 公司。由上海生工生物工程股份有限公司进行引物的合成及测序。

葡萄CO4基因扩增上游引物:5′-GCGGATCCATGGTAATTTTGTGTTTGTTATTAC-3′;下游引物:5′-GCGAGCTCAGTTACCTGACATA-3′。PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55.5 ℃退火1 min,72 ℃延伸100 s,40个循环;72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶检测PCR产物并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收,与克隆载体pGEM-Teasy连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,用X-gal和IPTG进行筛选,选取单一菌落进行PCR扩增检测,将阳性克隆送上海生工测序。

1.2.3 生物信息学分析 通过NCBI在线比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),筛选得到与其同源性较高的植物氨基酸序列,多序列比对用DNAMAN软件完成,氨基酸序列同源性用Clustalx 1.83和MEGA 5.0软件比较,然后用Maximum Likelihood法(参数为500)构建进化树。

氨基酸分子量、残基的数目、理论等电点、不稳定指数、脂溶指数以及亲、疏水性用Expasy工具(http://ca.expasy.org/tools.protscale.htm)进行分析。蛋白质的二级结构预测利用SOPMA(http://www.predictprotein.org/)进行。蛋白质跨膜域分析利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)进行。利用SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽的分析。功能域分析使用InterPro:protein sequence analysis & classification(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)进行。

1.2.4 葡萄CO4基因在不同处理下的表达水平分析 CO4上游引物:5′-TCTGTGCCGCTCTACC-3′;下游引物:5′-GCTCAACCTCCATCCC-3′,以葡萄看家基因UBQ为内参基因。用实时荧光定量仪(LightCycler®96,Roche)分析不同处理后葡萄CO4基因表达水平。PCR总体系25 μL:1 μL cDNA模板,上下游引物分别0.8 μL,SYBR Green 荧光染料12.5 μL,ddH2O 9.9 μL,反应程序为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40个循环。每处理设置3个重复,基因相对表达量采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.3 数据统计分析

每个处理设置3个重复,使用软件SPSS 22.0统计分析数据,分析差异显著性使用Duncan法,显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 葡萄CO4基因的克隆

通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取的贝达葡萄试管苗的总RNA,结果表明,条带完整无降解,其纯度契合本试验要求。以cDNA作为模板,设计特异性引物用于PCR扩增,得到与预期蛋白(663 bp)相符合的验证序列。将阳性菌液作为模板,扩增出与目标条带大小一致的条带(图1)。测序结果与目标基因序列一致,GenBank登录号为KY652090。

M. DNA Marker V;A-1、B-1.空白对照;A.葡萄CO4的目的条带扩增带;B.葡萄CO4的菌液PCR扩增带。
M.DNA Marker V;A-1,B-1.Blank control;A.Amplified target band of gene CO4;B.Bacteria PCR amplified band.

图1 葡萄 CO 4基因的克隆
Fig.1 Cloning of CO4 genes in grapevine

2.2 葡萄CO4基因的生物信息学分析

2.2.1 多序列比对及进化树构建 本试验克隆得到1个葡萄CO4基因,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为747 bp,编码248个氨基酸,包括1个起始密码子ATG和1个终止子TGA(图2)。

氨基酸序列同源性比对分析显示(图3),葡萄CO4同其他物种相似度为76.11%,由高到低依次为可可树(Theobroma cacao XP_007025812.1)为48.88%、棉花(Gossypium hirsutum L. KJB57663.1)为48.61%、山嵛(Eutrema salsugineum XP_006417372.1)同源性为48.59%、枣(Ziziphus jujuba Mill. XP_015869465.1)为47.19%、大豆(Glycine max KHN00100.1)为39.34%、巨桉(Eucalyptus grandis XP_010052390.1)为38.70%、核桃(Juglans regia AAY89231.1)为38.39%、油菜(Brassica napus XP_013711185.1)为37.43%、木薯(Manihot esculenta OAY26084.1)为37.40%、醉蝶花(Tarenaya hassleriana XP_010533861.1)为37.21%、拟南芥(Arabidopsis thaliana L. CAA39037.1)为37.16%、拟南芥(Arabidopsis thaliana L. NP_172592.1)为36.97%。磷酸化位点分析结果表明,葡萄CO4基因含有4个磷酸化位点,其中,1个酪氨酸磷酸化位点(Tyr21),1个苏氨酸磷酸化位点(Thr236),2个丝氨酸磷酸化位点(Ser85、Ser241)。

方框标注为起始密码子ATG及终止密码子TGA;其中D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)为酸性氨基酸,
K(赖氨酸)、R(精氨酸)和H(组氨酸)为碱性氨基酸,其余为中性氨基酸。
The ATG start codon and TGA stop codon is marked in pane;Asp(D)and Glu(E)belong to acidic amino acids,
Lys(K),Arg(R)and His(H)are basic amino acids,and the rest of them are neutral amino acids.

图2 葡萄 CO 4基因编码区核苷酸及氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and predicted amino acid sequences of CO4 gene in grapevine

方框标注葡萄CO4苏氨酸磷酸化位点(Thr236)和丝氨酸磷酸化位点(Ser241)。
The CO4 threonine phosphorylation site(Thr236)and serine phosphorylation site(Ser241)were marked in pane.

图3 不同植物CO同源蛋白的多序列比对分析
Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of CO homologs proteins from other plants

将葡萄CO4蛋白氨基酸序列与其他12种植物中同源蛋白氨基酸序列进行比对,并构建系统进化树,发现葡萄CO4与巨桉(Eucalyptus grandis)CO亲缘关系最近,属同一亚族(图4)。

图4 葡萄 CO4进化树分析
Fig.4 CO4 gene in grapevine phylogenetic tree analysis

2.2.2 葡萄CO4基因的结构及理化性质分析 葡萄CO4编码蛋白的二级结构主要形式有α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链结构,主要的二级结构为α-螺旋和延伸链结构,其次为无规则卷曲和β-转角结构(表2)。

信号肽与跨膜域预测结果表明,葡萄CO4为跨膜蛋白,有一个信号肽,并有4个跨膜区,分别在第28-50个氨基酸区、第60-79个氨基酸区、第145-167个氨基酸区和第177-199个氨基酸区。

葡萄CO4的分子式为C1253H1990N324O340S11,含量最高的氨基酸是亮氨酸Leu(12.1%),含量最低的氨基酸是组氨酸His(1.2%)。葡萄CO4属疏水性蛋白,其总平均疏水性为0.430;该蛋白有较好脂溶性,其脂溶指数为114.40。从蛋白质的稳定性来看,葡萄CO4的不稳定指数为43.17,属于不稳定蛋白(表3)。

表2 葡萄 CO4编码蛋白的二级结构分析
Tab.2 Protein secondary structure comparative analysis of CO4 gene in grapevine %

表3 葡萄CO4的理化性质分析
Tab.3 Physical and chemical characterization of CO4 protein in grapevine

2.3 葡萄CO4在不同光处理下的表达分析

葡萄CO4在不同光处理下的定量表达水平显示(图5),葡萄CO4能够积极响应不同光处理信号。在红光转蓝光处理下其表达量最高,是白光(对照)的5.39倍,差异显著(P<0.05);在白光转红光及红光转白光条件下,基因表达量与对照无显著差异(P>0.05);在白光转蓝光和蓝光转白光的处理下其表达量显著下调(P<0.05),分别为对照的54%和68%。在红光和蓝光的处理下,葡萄CO4的相对表达量显著(P<0.05)高于对照,其中在蓝光处理下表达量最高,为对照的2.86倍。

上述结果表明,葡萄CO4在不同光质及转光条件下的响应不同,其中在红光转蓝光处理下表达量上调最显著,蓝光处理次之,白光转蓝光处理下其表达量显著下调。

2.4 不同光照处理对贝达葡萄试管苗叶片荧光参数的影响

葡萄试管苗叶片荧光参数在不同光质及转光处理下不同,在红光转蓝光处理后Fv/Fm最高,差异显著(P<0.05);其次为白光;蓝光及蓝光转白光处理下的Fv/Fm与对照差异不显著(P>0.05);在红光处理下Fv/Fm最低,且差异显著(P<0.05)(图6-A)。Fv/Fo在红光转蓝光处理后最高,其次为红光处理,而在蓝光、白光转红光、白光转蓝光、蓝光转白光处理后Fv/Fo均与对照差异不显著(P>0.05)(图6-B)。qP在红光转蓝光处理后最高,在红光转白光、蓝光转白光处理后与对照均无显著性差异(P>0.05),在红光处理后最低,是对照的54%(图6-C)。红光处理后NPQ显著高于对照(P<0.05),为对照4.83倍;红光转蓝光处理后NPQ最低,但与对照无显著差异(P>0.05)(图6-D)。

图中不同小写字母表示在5%水平上差异显著(P<0.05)。图6同。
Different small letters in the figure meant significant difference
at 0.05 levels among treatments. The same as Fig.6.

图5 葡萄 CO4基因在不同转光下的相对表达量
Fig.5 Relative expression of the CO4 gene in grapevine
in different light conversion treatments

图6不同处理对荧光参数的影响
Fig.6 Effect of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters

3 讨论

CO基因对植物光周期信号传导具有重要作用,CO蛋白能够将生物钟信号和光信号相整合,并通过诱导FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)的表达,进而促使植物开花[23]CO基因还在芽休眠、株高伸长、侧枝(根)分化、果实成熟、光形态建成、生物和非生物胁迫抗性、块茎发育等过程中起着重要作用[17,24]。有研究认为,多数真核生物的磷酸化过程主要在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸残基中进行,而Ser85是向光素1的磷酸化位点,向光素接收光信号后,可以通过自发磷酸化作用输出光信号[25]。本研究中,克隆到的葡萄CO4基因含有2个丝氨酸磷酸化位点(Ser85和Ser241),1个苏氨酸磷酸化位点(Thr236),1个酪氨酸磷酸化位点(Tyr21),推测葡萄CO4能够通过磷酸化反应对不同光照条件进行感知和应答,从而调控植物的生长发育。

CO基因的表达受光质调控,光敏色素能通过影响CO基因编码蛋白的稳定性,以此调控CO基因的表达模式[18]。Imaizumi等[26]研究认为,CO基因转录水平受光照控制,蓝光受体基因FKF1在蓝光刺激下通过降解CDF1的活性而促进CO基因的转录。樊丽娜等[27]认为,CO蛋白在红光下不稳定,在蓝光下稳定。本研究中,CO4在葡萄转光培养中响应敏感,红光转蓝光后葡萄CO4基因表达量显著上调;在单色光红光和蓝光处理下,葡萄CO4表达量均高于白光,因此,蓝光和红光对诱导葡萄CO4的表达具有促进作用。Sawa等[28]也认为,蓝光能够促进拟南芥CO基因转录,与本研究结果相近。

叶绿素荧光参数值的变动能够反映植物的一系列光合生理特性,因此,可用来评估植物的光合能力;光质是叶绿素荧光参数的一个重要影响因素,有研究发现,大多数植物的光合速率在红光下高于蓝光[3]。本研究发现,叶绿素荧光参数Fv/Fm、Fv/Fo、qP在红光转蓝光处理后均高于其他处理,NPQ在该处理下最低;蓝光处理后的Fv/Fm、qP显著高于红光处理,推测红光转蓝光能够提高贝达葡萄试管苗叶片PSⅡ的原初光能转换效率;蓝光比红光更能促进试管苗对光能的利用,且在红光转蓝光处理后促进作用更为明显。Bondada等[29]认为,蓝光促进叶绿体的形成,红光主要促进光合产物的累积,这可能与蓝光能够促进光基因psbA转录物质的积累有关,张文林等[30]对转基因杨树的研究中也认为,蓝光能够提高PS Ⅱ的相对电子传递速率。此外,葡萄CO4表达水平、Fv/Fm、Fv/Fo、qP在红光转蓝光处理后均分别高于红光和蓝光处理,且在红光转蓝光处理与蓝光转红光处理之间差异显著。据报道,光敏色素或光受体诱导的反应发生于植物生长发育的一定时期和一定组织中,具有一定的时空效应[31]。由此推测,红光转蓝光处理与蓝光转红光处理间的差异是因为红光和蓝光的光效应具有时间顺序差异,导致光能在植物光合系统中分布不平衡,但其中的作用机理尚未见报道,有待进一步研究。

本研究利用RT-PCR法克隆得到葡萄CO4基因,发现该基因受不同光质调节,在红光转蓝光条件下,相对表达水平显著高于对照;同时,该光照条件可提高葡萄试管苗对光能的利用。在后期研究中,将对该基因所关联的下游元件做深入分析,以期阐明葡萄CO4及其调控系统对光合信号的响应,为深入研究葡萄试管苗CO基因感光机理及对光质改良提供依据。

参考文献:

[1] Franklin K A. Light and temperature signal crosstalk in plant development[J]. Current Opinion in PlanBiology,2009,12(1):63-68.

[2] Sindelar T J,Millar K D,Kiss J Z. Red light effects on blue light-based phototropism in roots of Arabidopsis thaliana[J]. International Journal of Plant Sciences,2014,175(6):731-740.

[3] Guo F,Wang C,Liu H P,et al. Effect of light quality and light intensity on the chlorophyⅡ fluorescence parameters of red raspberry tissue culture plantlets[J]. Northern Horticulture,2016(11):27-31.

[4] Ouzounis T,Heuvelink E,Ji Y,et al. Blue and red led lighting effects on plant biomass,stomatal conductance,and metabolite content in nine tomato genotypes[J]. Acta Horticulturae,2016,1134(1134):251-258.

[5] Samuoliene G,Sirtautas R,Brazaityte A A,et al. Supplementary red-LED lighting and the changes in phytochemical content of two baby leaf lettuce varieties during three seasons[J]. Journal of Food Agriculture & Environment,2012,10(3/4,2):701-706.

[6] Alvarenga I A,Pacheco F V,Silca S T,et al. In vitro culture of Achillea millefolium L.:quality and intensity of light on growth and production of volatiles[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture,2015,122(2):299-308.

[7] Cameron R F,Harrisonmurray R S,Judd H L,et al. The effects of photoperiod and light spectrum on stock plant growth and rooting of cuttings of Cotinus coggygria ′Royal Purple′[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology,2015,80(2):245-253.

[8] Liang Z S,Li Q,Xu W H. Effects of different light quality on growth,active ingredients and enzymes activities of Salvia miltiorrhiza[J]. China Journal of Chinese Materia Medica,2012,37(14):2055-2060.

[9] 刘 媛,李 胜,马绍英,等. 不同光质对葡萄试管苗离体培养生长发育的影响[J]. 园艺学报,2009,36(8):1105-1112.

[10] Sindelar T J,Millar K L,Kiss J Z. Red light effects on blue light-based phototropism in roots of Arabidopsis thaliana[J]. International Journal of Plant Sciences,2014,175(6):731-740.

[11] Sun W,Ubierna N,Ma J Y,et al. The coordination of C4 photosynthesis and the CO2-concentrating mechanism in maize and Miscanthus×giganteus in response to transient changes in light quality[J]. Plant Physiology,2014,164(3):1283-1292.

[12] Wong A C S, Hecht V F G, Picard K, et al. Isolation and functional analysis of CONSTANS-LIKE genes suggests that a central role for CONSTANS in flowering time control is not evolutionarily conserved in Medicago truncatula[J]. Frontiers in Plant Science, 2014, 5(17): 486-486.

[13] 冉从福,邵 慧,余 静,等.小麦CO-like基因TaCO9的克隆及分析[J]. 麦类作物学报,2014,34(10):1319-1326.

[14] Drabešová J, Cháb D, kolar J, et al. A dark-light transition triggers expression of the floral promoter CrFTL1 and downregulates CONSTANS-like genes in a short-day plant Chenopodium rubrum[J]. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(8): 2137.

[15] 叶雪凌,刘志勇,王孝宣,等. 番茄CONSTANS类似基因的克隆与表达分析[J]. 园艺学报,2008,35(11):1607-1612.

[16] Almada R,Cabrera N,Casaretto J A,et al. VvCO and VvCOL1,two CONSTANS homologous genes,are regulated during flower induction and dormancy in grapevine buds[J]. Plant Cell Reports,2009,28(8):1193-1203.

[17] Chaurasia A K, Patil H B, Azeez A, et al. Molecular characterization of CONSTANS-Like (COL) genes in banana (Musa acuminata L. AAA Group, cv. Grand Nain)[J]. Physiol Mol Biol Plants, 2016, 22(1): 1-15.

[18] Datta S,Hettiarachchi G H,Deng X W,et al. Arabidopsis CONSTANS-LIKE 3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J]. The Plant Cell,2006,18(1):70-84.

[19] Hassidim M,Harir Y,Yakir E,et al. Over-expression of CONSTANS-LIKE 5 can induce flowering in short-day grown Arabidopsis[J]. Planta,2009,230(3):481-491.

[20] Fu J, Yang L, Dai S. Identification and characterization of the CONSTANS-like gene family in the short-day plant Chrysanthemum lavandulifolium[J]. Molecular Genetics & Genomics, 2015, 290(3): 1039-1054.

[21] 马宗桓,陈佰鸿,毛 娟,等. 人参果长丽叶片再生体系的建立[J]. 中国农学通报,2014,30(22):197-202.

[22] 马宗桓,毛 娟,李文芳,等. 葡萄 SnRK2 家族基因的鉴定与表达分析[J]. 园艺学报,2016,43(10):1891-1903.

[23] Valverde F. CONSTANS and the evolutionary origin of photoperiodic timing of flowering[J]. Journal of Experimental Botany,2011,62(8):2453-2463.

[24] Tan J, Wu F, Wan J. Flowering time regulation by the CONSTANS-Like gene OsCOL10[J]. Plant Signaling & Behavior, 2017, 12(1):e1267893.

[25] 曾幼玲,杨瑞瑞. 植物miRNA的生物学特性及在环境胁迫中的作用[J]. 中国农业科学,2016,49(19):3671-3682.

[26] Imaizumi T,Schultz T F,Harmon F G,et al. FKF1F-BOX protein mediates cyclic degradation of a repressor of CONSTANS in Arabidopsis[J]. Science,2005,309(5732):293-297.

[27] 樊丽娜,邓海华,齐永文. 植物CO基因研究进展[J]. 西北植物学报,2008,28(6):1281-1287.

[28] Sawa M,Nusinow D A,Kay S A,et al. FKF1 and GIGANTEA complex formation is required for day-length measurement in Arabidopsis[J]. Science,2007,318(5848):261-265.

[29] Bondada B R,Syvertsen J P. Leaf chlorophyⅡ,net gas exchange and chloroplast ultrastructure in citrus leaves of different nitrogen status[J]. Tree Physiology,2003,23(8):553-559.

[30] 张文林,任亚超,张益文,等. 不同光质LED光源对转基因杨树叶片Bt毒蛋白含量及叶绿素荧光参数的影响[J]. 核农学报,2016,30(8):1639-1645.

[31] Franklin K A,Quail P H. Phytochrome functions in Arabidopsis development[J]. Journal of Experimental Botany,2010,61(1):11-24.

Cloning and Expression Analysis of CO4 Gene in the Different Light Qualities and Light Transfers of Grapevine

FAN Qi,MA Yanni,CHEN Baihong,ZUO Cunwu,MAO Juan

(College of Horticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

AbstractTo explore the effects of different light qualities on the expression of CO4 gene in grapevine plantlet in vitro. The full-length cDNA sequence of CO4 was cloned from Vitis riparia×V.labrusca Beta in vitro by RT-PCR. Bioinformatics analysis of the second level structure,and phylogenetic tree of protein. The result showed that the size of CO4 gene fragment was 663 bp,the open reading frame(ORF)of CO4 gene was 747 bp,including 248 amino acid coding regions. By use bioinformation analysis,CO4 of Beta was a hydrophobic,unstable protein with good lipid solubility. CO4 had a signal peptide,it can be inferred that it was a transmembrane protein. Phylogenetic tree indicated that CO4 of Beta(Vitis riparia×V.labrusca)had the highest evolutionary relationship with Eucalyptus grandis(Eucalyptus grandis Hill ex Maiden).qRT-PCR analysis showed that the CO4 expressed specifically and strongly in the treatment of red to blue light(control),which increased 5.39 fold in comparison to the control. The difference was not significant when exposed to the treatment of white to red light and red to white light. However the expression of CO4 was the lowest in the white to blue light treatment,which was 54% of the control. Fluorescence parameter analysis showed that the maximum photochemical efficiency(Fv/Fm),potential activity(Fv/Fo)and photochemical quenching coefficient(qP)were significantly higher than those of the control under red to blue light. The non photochemical quenching coefficient(NPQ)was the lowest under that treatment, but was the highest under red light treatment,it was the lowest under this treatment. The CO4 of Beta was more sensitive to light. The treatments of red to blue light could not only promote the expression of CO4,but also could improve the Beta Grapevine in vitro photosynthetic capacity. Thus,red to blue light played an important role in the process of morphogenesis of Beta Grapevine in vitro.

Key wordsGrapevine;CO4;Gene expression;Light quality;Chlorophyll fluorescence parameters

中图分类号Q78;S663.03

文献标识码:A

文章编号:1000-7091(2018)04-0090-08

doi10.7668/hbnxb.2018.04.013

收稿日期2018-01-27

基金项目国家自然基金项目(31401500)

作者简介范 琪(1991-),女,甘肃定西人,在读硕士,主要从事果树种质创新与生物技术研究。

通讯作者毛 娟(1981-),女,甘肃临洮人,副教授,博士,主要从事园艺植物生物技术与果树栽培学的教学与科研工作。