蓝光受体基因Cmwc-1和Cmwc-2的原核表达和蛹虫草中表达蛋白的检测

钟雪晴,叶德晓,毛玉梅,付鸣佳,杨志海

(江西师范大学 生命科学学院,江西 南昌 330022)

摘要生物体中接受蓝光信号的因子为蓝光受体蛋白。 为了揭示蓝光受体蛋白在蛹虫草中的存在形式,将蛹虫草蓝光受体基因Cmwc-1和Cmwc-2的部分序列构建在原核表达载体pET-41a(+)中,在大肠杆菌中进行表达。以所表达的融合蛋白作抗原制备抗体,并由Western Blotting对蛹虫草菌丝体和子实体分别进行分析检测。结果表明,获得了高效价的蛹虫草蓝光受体蛋白CmWC-1和CmWC-2的抗体。经过Western Blotting分析,在蛹虫草菌丝体和子实体中检测到CmWC-1有42 ku(CmWC1-42)和48 ku(CmWC1-48)2种蛋白质存在形式,其中在菌丝体中主要以CmWC1-48为主,CmWC1-42的相对量较少;而在子实体中主要以CmWC1-42为主,没有检测到CmWC1-48。在菌丝体和子实体中检测到CmWC-2有相同的50 ku(CmWC2-50)蛋白质存在形式。结果表明,在CmWC-1和CmWC-2复合物行使生物功能过程中,CmWC-1在菌丝体和子实体中分别产生了差异性降解,而CmWC-2维持稳定。

关键词蛹虫草;蓝光受体蛋白;抗体制备;Western Blotting分析

蓝光是重要的环境因素,近年在动物[1-2]、植物[3-5]、真菌[6-8]和细菌[9-10]等多种生物中进行了相关的生理生化和分子生物学研究。真菌中感受蓝光信号的蓝光受体蛋白研究已经很多,尤其在模式真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中蓝光受体蛋白的研究较清楚[11-13]。脉孢菌中的2个重要的蓝光受体蛋白White Collar-1(WC-1)和White Collar-2(WC-2)均为GATA型锌指蛋白(Zinc finger protein),带有DNA结合域[14-16]。WC-1和WC-2均带有PAS(Per-Arnt-Sim)功能域和NLS(Nuclear localization signal,核定位信号)功能域,其中,WC-1有3个PAS域,WC-2仅有1个PAS域[17-21]。在WC-1的一个PAS域中含有一个LOV(Light oxygen voltage domain)结构域,为蓝光感光器。通过PAS域可以将WC-1和WC-2结合成WCC复合体(White collar complex)[17-19]。此外,在WC-1和WC-2中均带有多聚谷氨酰胺转录激活结构域,且在WC-2中还含有一个coiled-coil域[17-21]。WC-1和WC-2这些功能域的存在,带给粗糙脉孢菌感知光照变化的生物钟功能 [16-17,22]

WCC作为WC-1和WC-2的复合物,可以与生物钟基因frq一起共同作用形成光诱导的一系列基因转录,从而导致蓝光诱导和调控。这种蓝光的调控主要是WCC可以与钟基因frq上的启动子结合并激活frq基因的表达[23]。有研究表明,当wc-1基因或wc-2基因缺失的时候,在细胞中的frq基因的表达水平很低[24]。研究还发现,WCC既可感受光的存在,又可感受光照在环境中的变化。当WCC感受外界光照变化时,可以形成不同的聚合物形式:光照条件下,WCC由WC-1与WC-2形成四聚体结构并以该结构行使功能;黑暗条件下,WCC由WC-1与WC-2形成二聚体结构并以该结构行使功能[25]。由此表明,蓝光受体蛋白WC-1和WC-2与生物钟蛋白FRQ共同的调控,形成了生物体的节律性特征,即生物钟。

除了在脉孢菌中存在蓝光受体WC-1和WC-2以及WCC复合物以外,在其他真菌中也存在类似功能的蛋白质结构。在灵芝(Ganoderma lucidum)中克隆到蓝光受体基因Glwc-1 和Glwc-2,其结构与脉孢菌中的蓝光受体基因wc-1和wc-2类似[26];在一种地下真菌松露(Tuber melanosporum)中检测到与脉孢菌同源的wc-1和wc-2高水平表达[27]。也有研究者确定了蓝光受体可以上调某些基因的表达,其中深绿木霉(Trichoderma atroviride)中的蓝光受体可以上调转录因子blu7基因的表达,并由此调节光感应和耐受性[28]。在冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)中克隆到蓝光受体基因Oswc-1,其序列与wc-1同源[29]。在烟草赤星病菌(Alternaria alternata)中的蓝光受体LreA(与wc-1同源),其基因的表达影响到孢子和次生代谢产物的产生[30]。此外,烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)中也存在蓝光受体LreA,尽管与脉孢菌中的WC-1只有45%的同源性,但仍然包含了WC-1中行使功能的所有类型结构域[31]。在植物病原真菌灰霉病菌(Botrytis cinerea)中也存在WCC复合物结构,这种结构的存在与病原菌的致病性有关[32]。在裂褶菌(Schizophyllum commune)中,蓝光受体复合物WC-1/2(即WCC)与菇的形成和光毒性有关,可以影响到光裂合酶(Photolyase)和亚铁螯合酶(Ferrochelatase)的活性[33]

蛹虫草(Cordyceps militaris)已经被确定为新资源食品,是一种传统的药用真菌。其蓝光受体基因Cmwc-1和Cmwc-2已经被克隆[34-35],对Cmwc-1和Cmwc-2的表达特性也进行了初步研究[34],且已经知道CmWC-1对子实体的形成和次生代谢物的产生有影响[36]。为了更为深入地研究Cmwc-1和Cmwc-2在蛹虫草菌丝体和子实体中的具体功能,本研究通过原核表达蓝光受体蛋白而制备了这2种蓝光受体蛋白的抗体,并进行了初步的检测,为进一步深入研究蛹虫草蓝光信号系统打下了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和载体 蛹虫草和大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α和BL21(DE3)由真菌分子生物学实验室保存。pMD18-T载体购自大连宝生物工程公司;表达载体pET-41a(+)为美国Novagen公司产品。

1.1.2 仪器与试剂 S1000TM thermal cycler Chassis 型 PCR 扩增仪购自美国伯乐(Bio-Rad)公司;D-37520 Osterode台式高速离心机购自美国Thermo公司;DYY-12 型电泳仪和 DYCp31D 型水平电泳槽购自北京六一仪器厂。TRIzol 试剂、蛋白酶抑制剂和第一链 cDNA 合成试剂盒PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser均为生工生物工程(上海)有限公司新产品;ProteinIsoTM Ni-NTA Resin蛋白质纯化柱购自北京全式金生物技术有限公司;福氏完全佐剂购自美国Sigma公司;ProteinA亲和介质购自美国GE公司;HRP-羊抗兔IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品;DAB显色试剂为武汉博士德生物工程有限公司产品。引物合成及测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 蛹虫草的培养 菌丝体培养:将蛹虫草菌种接种于含1%奶粉的PDA 培养基上,24 ℃培养菌丝体。子实体培养:在100 mL PDA液体培养基中接入蛹虫草菌种,20 ℃摇菌培养至菌丝体成为球状即成液体菌种,培养约4~5 d。同时将30 g优质大米置入培养瓶中,加入PDA液体培养基35 mL,高温高压灭菌以后成为大米培养基。接种5 mL液体菌种到大米培养基中,在20 ℃、RH≈75%条件下避光培养至菌丝体长满整个大米培养基中,而后开始光照培养。当观察到大米培养基上出现橙黄色的微小菌蕾时,培养瓶盖换成可透气的瓶盖,在光照条件下可见子实体的逐渐长大。

1.2.2 总RNA的提取与cDNA第1链的合成 蛹虫草在固体PDA培养基上培养4 d,长出菌丝体后置于-80 ℃。取0.05~0.10 g样品在预冷的研鼴中充分研磨,迅速加入1 mL TRIzol试剂,采用氯仿去除蛋白质等杂质,异丙醇沉淀和75%酒精洗涤等步骤,干燥后融于无RNase的去离子水中,即为提取的总RNA。用Recombinant DNase I进行处理,以去除样品的DNA。采用cDNA合成试剂盒和Oligo(dT)18引物合成cDNA第1链,具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.3 Cmwc-1aCmwc-2b的克隆和测序 在NCBI上搜索到蓝光受体基因Cmwc-1(GenBank序列号:JX845417.1)以及蓝光受体基因Cmwc-2 (GenBank序列号:JX852619.1)[34],截取基因Cmwc-1 ORF其中的1 549~2 772 bp片段(标记为Cmwc-1a)和基因Cmwc-2 ORF其中的394~1 179 bp片段(标记为Cmwc-2b)分别用以原核表达。利用软件Primer 5.0或Oligo 6.0设计序列Cmwc-1a 和序列Cmwc-2b进行PCR扩增的引物,同时在相应引物上引入酶切位点(表1)。以WC-1aWC-1bWC-2aWC-2b为引物对,以2 μL 反转录合成的第1链cDNA产物为模板进行PCR扩增,以获得Cmwc-1aCmwc-2b。进行PCR扩增时,其程序为先94 ℃预变性3 min;随后 94 ℃变性40 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,此3步骤共30个循环。回收PCR产物,克隆到pMD18-T载体进行测序分析。

表1 用于原核表达的相关引物
Tab.1 A list of primers used in this study

注:GGTACC为Kpn Ⅰ酶切位点,AAGCTT为Hind Ⅲ酶切位点。

Note:GGTACC is the digestion site of restriction enzyme Kpn Ⅰ,AAGCTT is the digestion site of restriction enzyme Hind Ⅲ.

1.2.4 Cmwc-1aCmwc-2b的表达和重组蛋白纯化 克隆到pMD18-T载体上的Cmwc-1aCmwc-2b经测序正确以后,分别经Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,而后分别连接到同样经过Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的pET-41a(+)载体上,构建表达载体pET-41a-Cmwc-1a和pET-41a-Cmwc-2b,然后转化至大肠杆菌 BL21(DE3)中。超声波破碎经0.5 mmol/L IPTG诱导培养的重组菌,离心后收集上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE电泳检测。用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin蛋白质纯化柱纯化表达蛋白,具体操作按试剂盒说明书进行。采用SDS-PAGE分析纯化后的表达。

1.2.5 抗体制备 纯化获得的原核表达蛋白质作为抗原免疫家兔,制备抗体anti-WC-1A和anti-WC-2B。具体方法为:抗原加入福氏完全佐剂,家兔颈背部皮下多点注射,免疫雄性纯种新西兰大白兔(体重2.5~3.0 kg),每隔14 d 免疫1次,共免疫5~6次,每种抗原均免疫2只新西兰大白兔。免疫结束后采血并收集血清。获得的抗血清经Protein A亲和层析柱纯化,具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.6 Western Blotting 取样的蛹虫草菌丝体和子实体均保存在-80 ℃。检测时,将0.2 g菌丝体或子实体置于预冷的研鼴中研磨,研磨的粉末收集在1.5 mL离心管中,用带有蛋白酶抑制剂的pH值7.4的PBS缓冲液1 mL悬浮,涡旋2 min,4 ℃浸提4 h或过夜。而后12 000 r/min离心10 min,上清液即为蛋白质样品。该样品经SDS-PAGE电泳后,电转移至PVDF膜上,于封闭液(5%脱脂奶粉)中孵育2 h,用PBST(pH值7.4的PBS加入0.1% Tween-20)洗涤3次,每次10 min。将膜在一抗中4 ℃孵育过夜,再用PBST洗膜3次后,加羊抗兔二抗IgG-HRP共同孵育1 h,PBST洗涤3次,然后用DAB试剂显色,具体操作按试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草总RNA提取

培养获得的蛹虫草菌丝体和子实体取样后迅速冰冻在-80 ℃,以保证每次取样样品的新鲜度。将获得的蛹虫草样品直接进行总RNA的抽提,从图1中可以看出,所获得的总RNA有2条清晰的28S和18S条带,从菌丝体和子实体中均获得较好的总RNA提取结果,均可用于cDNA第1链的合成。

图1 蛹虫草菌丝体(A)和子实体(B)中提取的总RNA
Fig.1 Total RNA extraceted from the mycelia (A)
and fruiting body (B) of Cordyceps militaris

2.2 Cmwc-1aCmwc-2b的RT-PCR扩增

提取获得的总RNA用DNA酶处理以去除其中的DNA,再反转录可得到cDNA。Cmwc-1aCmwc-2b片段的RT-PCR扩增使用相应的引物(表1)进行,获得预计大小的DNA片段。将扩增获得的DNA片段连接克隆载体pMD18-T后,进行DNA测序,结果Cmwc-1a片段长度为1 224 bp ,Cmwc-2b片段长度为786 bp(图2)。

M.DNA Marker DL2000。

图2 蛹虫草Cmwc-1a(A)和Cmwc-2b (B)的RT-PCR扩增
Fig.2 Cmwc-1a (A)and Cmwc2b (B)was amplified by RT-PCR and identified to be 1 224 bp and 786 bp

2.3 表达载体的构建和鉴定

Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ将构建于克隆载体中的Cmwc-1a进行双酶切并回收,插入同样双酶切的表达载体pET-41a(+)中,获得重组质粒pET-41a-Cmwc-1a;同样用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ将克隆载体中的Cmwc-2b进行双酶切并进行回收,插入pET-41a(+)中,获得重组质粒pET-41a-Cmwc-2b。表达载体pET-41a-Cmwc-1a和pET-41a-Cmwc-2b分别转化进入大肠杆菌DH5α菌株中。为了验证这2个表达载体构建的准确性,一方面进行DNA测序分析;另一方面,抽提表达载体质粒进行Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定。结果测序获得了正确的结果,双酶切也得到了正确大小的酶切片段(图3),表明构建的表达载体符合预期。

M.DNA Marker DL5000。

图3 Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ对重组质粒pET-41a-Cmwc-1a (A)和pET-41a-Cmwc-2b (B)进行限制性内切酶酶切检测
Fig.3 Digestion detection of he recombinant plasmids pET-41a-Cmwc-1a (A)
and pET-41a-Cmwc-2b (B)byrestriction enzyme KpnⅠ and Hind Ⅲ

2.4 原核表达蛋白的SDS-PAGE检测

将测序成功的重组质粒pET-41a-Cmwc-1a和pET-41a-Cmwc-2b分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)。工程菌株进行IPTG诱导,而后收集大肠杆菌菌体并进行处理,SDS-PAGE分析表达情况。

带有pET-41a-Cmwc-1a质粒的转化菌适于的表达条件为28 ℃,1.0 mmol/L 的IPTG诱导。在该条件下可出现特异的76 ku融合蛋白(图4-A泳道2),经超声波裂解以后离心的沉淀中可见浓度更高的76 ku融合蛋白(图4-A泳道3);而未经IPTG诱导的重组菌中无特异的融合蛋白带(图4-A泳道1),经IPTG诱导并超声波裂解后离心的上清液中融合蛋白含量较少(图4-A泳道4)。结果表明,表达的融合蛋白是以包涵体形式存在。同样,pET-41a-Cmwc-2b转化菌和pET-41a-Cmwc-1a转化菌的诱导条件和诱导后表达情况基本相同,这时表达的融合蛋白大小为60 ku(图4-B)。

2.5 重组蛋白的纯化

大肠杆菌中重组蛋白CmWC-1A和CmWC-2B的表达都以包涵体形式,可用6 mol/L的盐酸胍处理工程菌中得到的包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE分析。

用200~500 mmol/L浓度内的咪唑液洗脱,可获得较高浓度的纯化原核表达的重组蛋白CmWC-1A,其中以500 mmol/L洗脱的效果较好,电泳可见有纯化程度较好的76 ku融合表达蛋白(图5-A泳道6)。以同样浓度范围的咪唑液洗脱,也可获得一定纯化程度的CmWC-2B,低浓度(10 mmol/L)和高浓度(500 mmol/L)得到的重组蛋白的纯化情况基本相同,可以检测到60 ku融合蛋白,但也存在部分杂蛋白带。因此,一定范围内咪唑液浓度对Ni-NTA亲和层析柱吸附CmWC-2B洗脱影响差异不大(图5-B泳道3~6)。

M.Protein Marker;1.无IPTG诱导;2.28 ℃和1.0 mmol/L IPTG诱导;3.IPTG诱导且超声波破碎后的沉淀;4.IPTG诱导且超声波破碎后的上清液。
M.Protein Marker;1.Engineering bacteria were not induced by IPTG;2.Engineering bacteria were induced by 1.0 mmol/L IPTG at 28 ℃;3.Precipitate
from the Ultrasonic breaking engineering bacteria induced by IPTG;4.Supernatant from the Ultrasonic breaking engineering bacteria induced by IPTG.

图4 重组蛋白CmWC-1A(A)和CmWC-2B(B)表达的SDS-PAGE分析
Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CmWC-1A(A)and CmWC-2B(B)expressed in E.coliBL21

M.Protein Marker;1,2.6 mol/L的盐酸胍溶液处理包涵体裂解液;3~6.Ni-NTA亲和层析柱上洗脱下来的
CmWC-1A与CmWC-2B(咪唑缓冲液浓度分别为10,50,200,500 mmol/L)。
M.Protein Marker;1,2.Lysate of inclusion bodies treated with 6 mol/L guanidine hydrochloride solution;
3-6.CmWC-1A and CmWC-2B eluted with 10,50,200,500 mmol/L,respectively.

图5重组蛋白CmWC-1A(A)和CmWC-2B(B)由Ni-NTA亲和层析纯化后的SDS-PAGE分析
Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein CmWC-1A(A)
and CmWC-2B(B)by Ni-NTA affinity chromatography

2.6 抗体的制备

将原核表达获得融合蛋白CmWC-1A和CmWC-2B分别进行纯化,而后分别用这2个纯化的蛋白质免疫家兔,可以得到抗体anti-WC-1A和anti-WC-2B(抗体制备均为2次重复,表2)。获得的抗体都经过亲和层析柱Protein A的纯化。ELISA分析anti-WC-1A和anti-WC-2B的效价,结果表明,稀释80 000倍时,酶标仪检测ELISA的光吸收值均远远超过了空白对照(免疫前的兔血清)的值(表2),说明获得的抗体anti-WC-1A和anti-WC-2B有较高的效价。

表2 ELISA分析anti-WC-1A和anti-WC-2B的效价
Tab.2 ELISA analysis of titer of anti-WC->1A and anti-WC-2B

2.7 CmWC-1在蛹虫草菌丝体和子实体中的Western Blotting分析

蛹虫草菌丝体和子实体中的蓝光受体蛋白CmWC-1的分析,可以通过已经制备的抗体anti-WC-1A进行Western Blotting的蛋白质印迹分析。研究过程中,无论是菌丝体还是子实体,每毫升蛋白质提取液中均只溶解0.2 g生物量的蛋白质。Western Blotting分析表明,在蛹虫草菌丝体和子实体中,CmWC-1的表达存在明显的差异。当培养时间为5,8,13 d时,蛹虫草菌丝体中可检测到2条特异性杂交带蛋白质,分子量约为42 ku的蛋白质(命名为CmWC1-42)和分子量为48 ku的蛋白质(命名为CmWC1-48),且表达量CmWC1-48比CmWC1-42多,同时CmWC1-48和CmWC1-42在不同时间的表达量基本变化不大(图6-泳道1~3)。接种在培养瓶中的蛹虫草,其菌丝体在培养大约18 d以后可产生子实体,Western Blotting分析生长在不同时间的子实体中CmWC-1,在培养时间为20,25,40 d产生的子实体中只检测到42 ku的CmWC1-42,但表达量显然比菌丝体中要高很多,而且随着时间的推移其表达量稍有增加(图6-泳道4~6)。

M.Protein Marker;1~3分别为培养时间5,8,13 d的菌丝体中的Cm
WC-1;4~6分别为培养时间20,25,40 d子实体中的CmWC-1。
M.Protein Marker;1-3.CmWC-1 from the C. militaris mycelium at the
5th,8th and 13th day of inoculation,respectively;4-6.CmWC-1 from
the C. militaris fruiting body at the 20th,25th and 40th day of inocula
tion,respectively.

图6 anti-WC-1A作一抗Western Blotting
检测蛹虫草菌丝体和子实体中CmWC-1
Fig.6 Western Blotting analysis of
CmWC-1 in C.militaris mycelium and fruiting
body using anti-WC-1A as the first antibody

2.8 CmWC-2在蛹虫草菌丝体和子实体中的Western Blotting分析

蛹虫草菌丝体和子实体中的钟蛋白CmWC-2的分析,可以通过已经制备的抗体anti-WC-2B进行Western Blotting的蛋白质印迹分析。Western Blotting分析表明,CmWC-2在蛹虫草菌丝体和子实体中均只有一条分子量大小为50 ku的蛋白质(命名为CmWC2-50)。通过Western Blotting分析蛹虫草菌丝体培养5,8,13 d的情况,CmWC2-50量随时间推移而减少(图7-泳道1~3);而分析接种20,25,40 d后产生的蛹虫草子实体中的情况,CmWC2-50的量普遍要比菌丝体中的高,且也有随时间的推移表达量减少的趋势(图7-泳道4~6)。

M.Protein Marker;1~3分别为培养时间5,8,13 d的菌丝体中的Cm
WC-2;4~6分别为培养时间20,25,40 d子实体中的CmWC-2。
M.Protein Marker;1-3. CmWC-2 from the C. militaris mycelium at the
5th,8th and 13th day of inoculation,respectively;4-6.CmWC-2 from
the C. militaris fruiting body at the 20th,25th and 40th day of inocula-
tion,respectively.

图7 anti-WC-2B作一抗Western Blotting
检测蛹虫草菌丝体和子实体中CmWC-2
Fig.7 Western Blotting analysis of CmWC-2
in C. militaris mycelium and fruiting body using
anti-WC-2B as the first antibody

3 讨论

本研究通过克隆Cmwc-1和Cmwc-2基因的部分序列Cmwc-1aCmwc-2b,将这2个序列片段成功构建进入了原核表达载体pET-41a(+)中,而后转入大肠杆菌BL21菌株中并获得了表达。从表达的结果来看,均为包涵体融合蛋白,通过亲和层析柱对这2个融合蛋白进行了纯化并获得了可用于制备蓝光受体蛋白CmWC-1和CmWC-2抗体的融合蛋白。本研究采用原核表达的方法制备抗原,是目前较常用到的方法,2个蓝光受体基因均获得了较好的表达,为进一步的研究提供了可能。将获得的抗原免疫家兔,获得了蓝光受体蛋白CmWC-1和CmWC-2抗血清,经过亲和层析柱纯化获得了CmWC-1和CmWC-2的多克隆抗体。纯化的抗体经过ELISA检测,效价均较高,完全可以用于相关的蛹虫草中CmWC-1和CmWC-2的研究。

环境可以影响蛹虫草的发育,其中光对蛹虫草的影响已经有报道[34-35,37]。已从蛹虫草中克隆了2个蓝光受体蛋白基因[34-35],对蛹虫草中这2个蓝光受体蛋白在菌丝体中的短期表达和子实体中的表达进行了实时荧光定量分析[20]。在本研究中,制备的CmWC-1和CmWC-2的抗体anti-WC-1A和anti-WC-2B被用于Western Blotting分析,以检测蛹虫草中CmWC-1和CmWC-2的存在形式。从检测结果来看,可检测到蛹虫草CmWC-1存在CmWC1-48和CmWC1-42 这2种形式,分子量明显比由基因序列推测的要小很多(GenBank序列号:AFU65172.1);也可检测到CmWC-2存在CmWC2-50蛋白质,其分子量与基因序列推测的非常接近(GenBank序列号:AFZ15762.1),如果考虑CmWC-2信号肽序列的切除,正好符合实际分子量的大小。比较脉孢菌中,WC-1和WC-2蛋白均可进行磷酸化且其磷酸位点比较多,WC-1和WC-2的磷酸化程度可影响WCC的功能[38-39]。有研究表明,WCC的转录因子活性在光照条件下会增强[40]。进一步分析表明WCC磷酸化水平对转录因子活性和蛋白质的稳定性影响较大:当磷酸化水平低时,转录因子活性高,蛋白质稳定性低;反之,当磷酸化水平高时,转录因子活性低,蛋白质稳定性高[41]。由此推测,蛹虫草中的CmWC-1和CmWC-2形成复合物时的稳定性也会受到其磷酸化水平的影响。

CmWC-1在菌丝体中可见有CmWC1-48和CmWC1-42,但以CmWC1-48为主;而子实体中只可见有CmWC1-42,且含量较菌丝体中更高。产生这种情况的原因目前还不完全清楚,推测可能是由于菌丝体和子实体中蓝光受体CmWC-1的作用机制和磷酸化水平有差异,导致降解机制不同。而对菌丝体和子实体中的CmWC-2进行分析,均只能检测到CmWC2-50,表明没有降解。因此,可以初步形成一个结论,CmWC-1和CmWC-2形成复合物行使生物学功能后,会导致CmWC-1的降解,而CmWC-2维持稳定的存在,且CmWC-1的降解在菌丝体和子实体中存在差异。

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Prokaryotic Expression of Blue Light Receptor Genes Cmwc-1 and Cmwc-2 and Detection of Expressed Proteins in Cordyceps militaris

ZHONG Xueqing,YE Dexiao,MAO Yumei,FU Mingjia,YANG Zhihai

(College of Life Sciences,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China)

AbstractThe blue light receptor protein is the factor that receives blue light signal in living organisms. To reveal the existence form of blue light receptor protein,the partial sequences of the blue light receptor genes Cmwc-1 and Cmwc-2 in Cordyceps militaris were constructed in prokaryotic expression vector pET-41a(+),and the correct expression of Cmwc-1 and Cmwc-2 was carried out in Escherichia coli. Using the expressed fusion protein as antigen to prepare antibodies,we obtained the antibodies of high titer of the C. militaris blue light receptor CmWC-1 and CmWC-2. By Western Blotting analysis,42 ku(CmWC1-42)and 48 ku(CmWC1-48)protein for CmWC-1 were detected in mycelia and fruiting bodies of C.militaris,which in the mycelium was dominated by CmWC1-48,more than the CmWC1-42 relative quantity,while in the fruiting body was dominated by CmWC1-42,no CmWC1-48 was detected. 50 ku(CmWC2-50)protein for CmWC-2 was detected in both mycelia and fruiting bodies in C.militaris. These results suggested that CmWC-1 degraded differently in mycelia and fruiting bodies,while CmWC-2 remained stable after completing the biological functions of CmWC-1 and CmWC-2 complexes.

Key wordsCordyceps militaris;Blue light receptor protein;Antibody preparation;Western Blotting analysis

中图分类号Q936

文献标识码:A

文章编号:1000-7091(2018)04-0053-08

doi10.7668/hbnxb.2018.04.008

收稿日期2018-01-17

基金项目国家自然科学基金项目(31760601;31260010);江西省重点研发计划项目(20171BBF60007)

作者简介钟雪晴(1994-),女,江西吉安人,在读硕士,主要从事微生物学研究。钟雪晴、叶德晓为同等贡献作者。

通讯作者付鸣佳(1964-),男,江西高安人,教授,博士,硕士生导师,主要从事食药用真菌分子生物学研究。