玉米雄穗发育早期耐旱相关转录因子的发掘

吴永波1,2,郝转芳2,王 楠2,宋 洁2,周跃恒2,柳波娟2,朱汉勇3,邸 宏1,王振华1,李新海1,2

(1.东北农业大学 农学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.中国农业科学院 作物科学研究所,北京 100081;3.文山州农业科学院,云南 文山 663000)

摘要为了发掘更多与玉米雄穗生长发育早期耐旱性相关的转录因子基因,选用耐旱型玉米自交系(DT)铁7922、X178,以及干旱敏感型自交系(DS)吉81162和丹340为试验材料。使用盆栽方法进行育苗,并在一致且适宜的肥水条件下培养至雄穗发育前期,通过人工模拟田间干旱胁迫及正常灌溉的方法对材料进行处理。采用RNA-Seq技术检测玉米雄穗发育早期在受到干旱胁迫后相对于正常灌溉处理而言,耐旱相关转录因子家族基因在转录水平上表达量的变化。结果共发现287个转录因子基因在受到干旱胁迫后相对于正常灌溉呈现差异表达。对差异表达基因进行功能富集和注释结果发现,差异表达基因中具有耐旱调控功能的转录因子基因34个。其中在2个耐旱型材料中共有且表达模式一致的基因6个;在2个干旱敏感型材料中共有且表达模式一致的基因3个;在4个材料中均呈显著差异表达的转录因子基因1个。研究结果为玉米雄穗发育早期耐旱功能转录因子基因发掘和耐旱分子育种提供了基因基础。

关键词玉米雄穗;转录因子;耐旱性

玉米(Zea mays L.)作为重要的经济作物、饲料作物和工业原料,随着社会经济发展对其需求量逐年上升[1-2]。干旱是影响玉米生长发育和产量的最主要非生物胁迫因素,全球气候变暖趋势加剧,对玉米生产影响日渐突出[3]。增强耐旱性是保证玉米稳产的有效手段,然而,耐旱性是作物极难改良的性状之一,其调控分子机制复杂,涉及基因众多[4-5]。因此,不断了解干旱胁迫应答分子机制、发掘耐旱调控基因,对于改良玉米耐旱性、保持产量稳定至关重要。玉米是典型的雌雄同株异花授粉植物,雄穗在生育过程中发挥重要作用;雄穗发育期新陈代谢活动剧烈,需水量较大[6]。干旱胁迫会引起雄穗生长迟缓且发育不良,从而导致花粉量减少和雌雄花期间隔(Anthesis and silking interval,ASI)延长,是导致玉米减产的重要因素。

耐旱性是受多个逆境基因表达和多条代谢通路共同调控的复杂数量性状。一般而言,植物响应干旱过程包括从信号感知到信号转导,再到调节下游功能蛋白表达3个部分[7]。其中,信号转导过程连接着胁迫信号感知和应答反应,是耐旱调控的桥梁,在玉米耐旱调控中起到至关重要的作用。转录因子(Transcription factors,TFs)通过与基因簇启动子区相互作用,调控多种下游基因的表达,在信号转导途径扮演重要的角色[8]。现已发现,在拟南芥、水稻、小麦、玉米等作物中存在NAC、WRKY、MYB、bHLH、bZIP、AP2、DREB等多个调控作物耐旱相关的转录因子家族[9-12]。近年来,在玉米中证明了一些转录因子耐旱性功能,例如NAC111、SNAC1、bZIP72、WRKY58、WRKY33、ZmDREB2A等[13-18]。但是相对于水稻、拟南芥等作物来说,玉米中已知的耐旱相关转录因子较少。

转录因子是一类响应特定胁迫条件而差异表达的蛋白质,遭受干旱胁迫后,响应干旱胁迫的转录因子基因表达量会出现明显变化。在转录组水平上检测转录因子基因表达量的变化是研究转录因子响应胁迫的重要手段。在转录组水平,发掘耐旱调控基因并预测耐旱调控机制方法很多,如SSH(Suppression subtractive hybridization)、ESTs(Expression sequence tags)cDNA microarrays等[19-26]。近年来,随着高通量测序技术以及转录组研究的不断发展和深入,RNA-Seq已经成为研究复杂数量性状的重要手段。通过RNA-Seq技术可以在全基因组水平上检测基因表达谱。Wang等[27]采用RNA-Seq分析玉米株高调控相关基因。Zhao等[28]通过RNA-Seq方法在转录组水平上对抗茎腐病(Fusarium graminearum)基因进行检测。Li等[29]通过RNA-Seq技术分析玉米苗期叶片遭受干旱、高盐、高温、低温等非生物胁迫前后转录组表达谱,发掘与非生物胁迫相关基因。

本研究通过RNA-Seq方法在转录组水平上对NAC、WRKY、MYB、bHLH、bZIP耐旱显著相关的5个家族基因表达量进行分析;通过GO富集和功能注释对差异表达基因进行功能分类,以筛选耐旱型材料以及干旱敏感型材料中响应干旱胁迫的转录因子。

1 材料和方法

1.1 研究材料

本研究使用的耐旱型玉米自交系(Drought-tolerant line,DT)为铁7922和X178;敏感型自交系(Drought-susceptible line,DS)为吉81162和丹340。自交系所属类群和系谱如表1所示,材料耐旱性鉴定参见参考文献[30]。4份玉米自交系材料均由中国农业科学院作物科学研究所提供。

表1 材料基本信息
Tab.1 The information of maize inbred lines used in this study

注:耐旱性的评定是按照Hao 等[30]所述的选择指数(SI)进行评价。选择指数SI越高说明耐旱性越强。

Note:The evaluation of drought tolerance is according to the Hao et al selection index(SI). The higher the selection of the index SI,the stronger the drought tolerance.

1.2 玉米雄穗发育早期干旱胁迫处理及RNA-Seq分析

4份玉米自交系种植于中国农业科学院作物科学研究所温室,盆栽处理,自然条件生长,每份自交系分别种植20盆。待自交系生长至雄穗发育前期,每份分别挑选出10株生长状态良好、长势一致的植株,其中,5株作干旱胁迫处理即停止浇水,另外5株正常灌溉处理。处理5 d后,对干旱胁迫和正常灌溉下的土壤相对含水量、顶生叶叶绿素稳态荧光值进行测定(德国Walz公司,Min-PAM)。剥取玉米雄穗样品,-80 ℃保存。

提取样品总RNA,使用IlluminaHiSeq 2000 Platform(Illumina,USA)对4份自交系2种水分条件下8个雄穗样品进行RNA-Seq分析。采用规范化RPKM法(每百万Reads中来自于某基因每千碱基的Reads数)量化基因表达水平,获得4份自交系2种水分处理,共8个样品基因表达谱[31]

1.3 数据处理与GO功能分析

自Plant TFDB网站(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)获取NAC、WRKY、MYB、bHLH、bZIP 共5个转录因子家族基因的基本信息,分别从8个样品基因表达谱中提取5个家族转录因子映射基因的表达量信息。构建4份玉米自交系在2种水分条件下基因差异表达谱,筛选差异表达基因(Log2|fold change|≥1,P<0.01,FDR≤0.05,FDR≤0.01,FDR≤0.001),对差异表达基因数、表达模式进行比较分析。

为了解差异表达基因功能,使用agriGO(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/)Singular EnrichmentAnalysis(SEA)工具进行Gene Ontology分析。以Zea mays V5a为参考基因组背景,富集差异显著的GO条目(FDR < 0.05)。使用PlantTFDB对生物学功能显著富集GO term基因功能进行注释。

2 结果与分析

2.1 耐旱表型分析

本研究使用耐旱型玉米自交系铁7922、X178,敏感型自交系吉81162、丹340为材料。为了分析自交系遭受干旱胁迫后表型变化,对正常灌溉处理与干旱胁迫处理下自交系的土壤相对含水量和稳态叶绿素荧光值进行测定,结果显示(图1),正常灌溉处理下,土壤相对含水量维持在0.63 cm3/cm3左右,稳态叶绿素荧光值最大的是X178(0.50),最小为丹340(0.32),铁7922和吉81162分别为0.33,0.39。相同条件下,干旱胁迫处理5 d后土壤相对含水量降至0.23 cm3/cm3左右,叶绿素稳态荧光值最大的是X178(0.42),最小的是吉81162(0.20),铁7922和丹340分别为0.27,0.22。与正常灌溉处理相比,干旱胁迫处理下材料土壤相对含水量平均下降39.5个百分点,稳态叶绿素荧光值也均呈现下降趋势。下降幅度较大的是敏感自交系吉81162、丹340,分别下调0.19,0.10;耐旱型自交系铁7922和X178下降较小,分别为0.06和0.08。叶绿素稳态荧光值是光合作用的指标,反映光合作用的重要参数,干旱胁迫会对植物的光合作用造成影响,而受到胁迫以后耐旱型自交系适应性较强,受到影响较小;敏感型自交系适应性较差,受到影响较大。

4份玉米自交系材料干旱胁迫与正常灌溉处理5 d前后土壤相对含水量的变化,顶叶稳态叶绿素荧光值的变化。
Before and after 5 days of drought stress of 4 maize inbred lines,the change of relative water content in the soil and chlorophyll fluorescence.

图1 干旱胁迫与正常灌溉处理下4份自交系土壤相对含水量以及稳态叶绿素荧光值
Fig.1 Steady state chlorophyll fluorescence and relative soil water content of drought
stressed and well-watered treatment

2.2 干旱胁迫下差异表达基因分析

对4份自交系2种水分条件下雄穗RNA-Seq表达谱中5个转录因子家族基因表达量进行分析(图2)。干旱胁迫与正常灌溉处理下共检测到502个基因表达量发生变化(FDR≤0.05,P<0.01),表达量差异2倍以上的基因有287个(log2|fold change| ≥1),其中,4份玉米自交系中分别检测到108,132,118,71个(图2-A)。

根据4份自交系的耐旱性不同,将自交系按照耐旱性分为耐旱与干旱敏感型2组,每组2个自交系相互验证,对其差异表达基因数以及表达模式进行比较分析(图2-B、C)。

发现耐旱型自交系铁7922、X178中差异表达基因206个,2个自交系共有34个,干旱胁迫处理表达量上调基因106个,下调基因134个;干旱敏感型自交系吉81162和丹340中差异表达基因163个,2个自交系共有24个(图2-C)。干旱胁迫处理下表达量上调基因73个,下调基因114个。对耐旱型和敏感型自交系中差异表达基因数进行分析发现,耐旱型自交系(DT)>干旱敏感型自交系(DS)。研究结果表明,受到干旱胁迫后,大部分转录因子基因呈现下调表达,部分呈现上调表达。敏感型玉米自交系中响应基因相对较少且下调表达基因较多,耐旱型自交系中响应基因相对较多且上调表达基因较多。

A.4份玉米自交系中的差异表达基因数目:FDR≤0.05,FDR≤0.01,FDR≤0.001 为3种FDR水平; B.表达模式进行分析:Log2|fold change|≥
1上调表达,Log2|fold change|≤-1下调表达; C.287个差异表达基因在4份玉米自交系中存在情况。.
Before and after 5 days of drought stress of 4 maize inbred lines,the change of relative water content in the soil and chlorophyll fluorescence.A. The number of differentially expressed genes in 4 maize inbred lines;three FDR levels of FDR≤0.05 FDR or less than 0.01 FDR or less than 0.001 were analyzed;B.The expression patterns,Log2|fold change|≥1 up-regulated expression,Log2|fold change|≤-1 down regulated expression;C.The existence of 287 differentially expressed genes in 4 maize inbred lines.

图2 差异表达基因在4份玉米自交系中的存在情况与表达模式分析
Fig. 2 Analysis of the presence and expression patterns of differentially expressed genes in four maize inbred lines

2.3 GO功能注释和富集分析

为了解差异表达转录因子功能,对287个差异表达基因进行GO基因功能富集和注释(Gene Ontology)。在生物学过程方面,主要参与调控转录、生物合成、响应刺激、多细胞生物学过程、器官发育、代谢过程、信号转导等。分子功能方面,主要有DNA结合、转录因子活性、特异性序列结合活性、蛋白质聚合活性以及氨基酸结合活性。细胞组分方面,主要与细胞核、胞内组分、细胞质、膜整体构架、细胞器组成相关(图3)。

对差异表达基因生物学过程方面主要富集的 6个GO条目中各基因详细功能进行分析。调控转录条目中功能基因162个,占差异表达基因数的56.45%,主要功能为调控转录。生物合成条目中功能基因113个,占差异表达基因的39.37%,与叶绿素、亚铁血红素、木质素、脯氨酸、海藻糖、类黄酮等生物合成相关;响应刺激条目中功能基因104个,占差异表达基因的36.23%,主要包括响应脱落酸、乙烯、茉莉酸、水杨酸、赤霉素等植物激素,响应水分亏损、高盐、低温、光照等非生物胁迫,真菌、细菌、病毒等生物胁迫。器官发育条目中功能基因47个,占差异表达基因的16.38%,主要参与调控胚胎、种子、花粉、气孔、根、叶、叶脉等器官的发育。代谢过程条目中功能基因38个,占差异表达基因的13.24%,主要涉及脯氨酸、活性氧、赤霉素、花青素等代谢过程。信号转导通路条目中基因功能基因16个,占差异表达基因的5.57%,主要参与脱落酸、茉莉酸、水杨酸、赤霉素、葡萄糖、红光/远红光等介导的信号通路。

为筛选耐旱调控基因,对差异表达基因中耐旱功能(响应脱落酸、乙烯、茉莉酸、水杨酸、赤霉素等植物激素刺激,参与其生物合成、代谢过程以及调控气孔发育,响应水分亏损胁迫)基因进行富集,获得差异表达基因34个。其中,在2个耐旱自交系中共有且表达模式一致基因6个;2个敏感自交系中共有且表达模式一致基因3个,4个自交系中均检测到差异表达基因1个,共筛选出10个基因为耐旱调控候选基因。

2.4 耐旱相关重要转录因子

在2个耐旱型自交系共有且表达模式一致基因6个,其中上调表达基因4个,下调表达基因2个。基因功能以及在2个耐旱自交系中的差异表达倍数如表2所示。

在2个敏感型(DS)自交系中共有且表达模式一致耐旱候选基因3个,且全部表现为下调表达,基因功能以及在2个敏感型自交系中的差异表达倍数如表3所示。

图3 差异表达基因的基因功能注释
Fig.3 The GO gene function annotation of the
differentially expressed genes

表2 耐旱型自交系中筛选出的候选基因
Tab.2 Candidate genes detected in the drought-sensitive inbred lines

表3 敏感型自交系中筛选出的候选基因
Tab.3 Candidate genes screened in the drought-sensitive inbred lines

在4个自交系2种水分条件下均检测到耐旱候选基因GRMZM2G137046(ZmbZIP61),该基因响应脱落酸(ABA)和赤霉素(Gibberellin),与拟南芥中(ATbZIP56)基因同源,在铁7922、X178、吉81162、丹340自交系干旱胁迫与正常灌溉条件下,表达量差异倍数分别为2.97,-7.63,-2.99,-3.02。

3 讨论与结论

玉米雄穗发育前期是花器官分化重要阶段,遭受干旱胁迫会对玉米产量造成严重影响。转录因子能够协调耐旱调控网络,在调节植物耐旱性上具有重要作用[6]。大量转录因子基因响应干旱胁迫,在转录组水平上呈现差异表达[7]。RNA-Seq技术是检测基因转录水平变化的有力手段,具有检测基因较多且重复性好的特点[32-34]。本研究以玉米雄穗为研究对象,从中检测出5个转录因子家族中大量功能各异的转录因子在受到干旱胁迫后呈现差异表达,由于不同玉米自交系遗传背景不同,导致差异表达基因不尽相同。为了发掘与玉米雄穗耐旱相关的转录因子,筛选在耐旱自交系或敏感自交系中可以相互验证(即在2个耐旱型自交系或2个敏感自交系中共有且表达模式一致)的耐旱相关转录因子基因为耐旱候选基因。

3.1 调控气孔发育与活动的转录因子

气孔形态与活动在调节水分散失方面起到重要作用,是响应干旱胁迫的关键组分。现已证明,很多转录因子通过调控气孔发育与活动调控耐旱,例如AtWRKY1、AtWRKY53、AtMYB60等[35-37]。本研究筛选出与调控气孔发育和活动相关基因GRMZM2G417164(bHLH82)在2个敏感性自交系中一致下调表达。Yang等[38]研究发现,其同源基因AT3G06120在拟南芥中通过调控气孔发育调控旱性。所以,该基因可能通过调控气孔发育,与雄穗耐旱性相关。

3.2 响应水分亏损胁迫的转录因子

响应水分亏损是响应干旱胁迫的直接表现,本研究在WRKY家族中筛选出2个候选基因GRMZM2G449681(WRKY92)和GRMZM2G018721(WRKY48),均具有响应水分亏损功能,2个基因在拟南芥中的同源基因分别为AT5G07100(AtWRKY26)和AT1G69310(AtWRKY54)。前人研究发现,AtWRKY26响应非生物胁迫,AtWRKY54在叶片衰老上起到负向调控作用,2个基因可能在雄穗耐旱性调控中起到重要作用[39-40]

3.3 植物激素相关的转录因子

近年来,脱落酸、生长素、乙烯、茉莉酸、水杨酸、赤霉素等多种植物激素被证明与植物耐旱显著相关,其中研究最多的是“逆境激素”脱落酸(ABA) [41]

本研究中筛选出的候选基因中与ABA相关的有GRMZM2G014653 (NAC109)、GRMZM2G159547 (MYB48)、GRMZM2G137046 (ZmbZIP61)。其中,GRMZM2G014653(NAC109)参与ABA信号通路并起负向调节作用,在2个耐旱自交系受到干旱胁迫后表达量显著上升,该基因属于NAC家族中与耐旱显著相关的SNAC亚家族[9]。Thatcher等[42]发现,拟南芥中同源基因AT1G01720(AtNAC002)通过可变剪切方式响应干旱胁迫。GRMZM2G159547(MYB48)响应ABA、植物生长素、茉莉酸等植物激素,在耐旱自交系干旱胁迫后表达量一致上升,Wang等[43]研究发现,ZmMYB48在转基因拟南芥中过表达会增强拟南芥耐旱性,进一步证明该基因参与雄穗耐旱调控。GRMZM2G137046(ZmbZIP61)属于bZIP转录因子家族,响应ABA和赤霉素刺激,本研究在4个玉米自交系中均显著差异表达。目前,没有研究表明该基因与耐逆相关,但是本研究在玉米雄穗中检测到该基因一致响应干旱胁迫,且其功能与ABA、赤霉素等植物激素相关,可能是一个参与雄穗耐旱调控的转录因子。

除了检测到一些转录因子与ABA密切相关以外,还检测出与植物生长素、乙烯、茉莉酸、水杨酸代谢相关的转录因子在雄穗受到干旱胁迫后显著差异表达,包括响应茉莉酸乙烯赤霉素水杨酸的GRMZM2G047626(MYB6);响应乙烯、植物生长素的GRMZM2G057027 (MYB p2);响应乙烯、水杨酸的GRMZM2G139688(MYB138);以及属于SNAC亚家族中的响应茉莉酸NAC家族转录因子GRMZM2G179885(NAC132)。GRMZM2G139688(MYB138)拟南芥中的同源基因AT3G11440(AtMYB60)在干旱胁迫下调控气孔活动和根系生长相关[37]。sNAC家族GRMZM2G179885(NAC132)的水稻同源基因LOC_Os07g37920(OsNAC10)增强了水稻的耐旱性和产量[44]

雄穗发育早期干旱胁迫是造成玉米产量亏损的重要因素,转录因子在耐旱性调控中起到重要作用。本研究采用RNA-Seq技术在转录组水平上检测耐旱型自交系和敏感型自交系干旱胁迫与五大耐逆相关转录因子家族(NAC、MYB、bHLH、bZIP、WRKY)基因表达谱,结果发现,287个转录因子在干旱胁迫后表达量差异显著(P<0.01, FDR<0.05)。筛选出在耐旱型或干旱敏感型自交系中表达稳定的雄穗发育早期耐旱候选基因10个。

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The Identification of Drought Tolerance-related Transcription Factors in Early Developing Tassel of Maize

WU Yongbo1,2,HAO Zhuanfang2,WANG Nan2,SONG Jie2,ZHOU Yueheng2,LIU Bojuan2,ZHU Hanyong3,DI Hong1,WANG Zhenhua1,LI Xinhai1,2

(1.College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;3.Wenshan Academy of Agricultural Sciences,Wenshan 663000,China)

AbstractTo explore more drought-related transcription factors genes in early growth and development of tassels, two drought-tolerant(DT) Tie 7922,X178 and two sensitive maize inbred lines(DS) Ji 81162, Dan 340 were used. The potted planting method was used to cultivate the seedlings, and the materials were treated by artificial simulated field drought stress and normal irrigation under the same and suitable water conditions. RNA-Seq technique was used to detect the changes in transcriptional level of the gene in drought related transcription factor family in the early stage of maize ear development compared with the normal irrigation treatment. The results showed that 287 genes were differently expressed under drought stress, and 34 of them are related to drought tolerance regulation revealed by GO enrichment and annotation, including 6 commons in two drought-tolerant line, 3 commons in two sensitive line, and all with uniform expression pattern, and 1 detected in four inbreds. The results provided the basic knowledge for drought tolerant gene identifition and molecular breeding of maize.

Key words:Maize tassel; Transcription factors; Drought tolerance

中图分类号Q78;S513.03

文献标识码:A

文章编号:1000-7091(2018)04-0001-08

doi:10.7668/hbnxb.2018.04.001

收稿日期2018-05-06

基金项目国家重点研发计划(2016YFD0101803);自然科学基金国际合作项目(31661143010)

作者简介吴永波(1991-),男,内蒙古赤峰人,在读硕士,主要从事玉米遗传育种研究。吴永波、郝转芳为同等贡献作者。

通讯作者

王振华(1965-),男,黑龙江哈尔滨人,教授,博士,博士生导师,主要从事玉米遗传育种研究。

李新海(1969-),男,黑龙江尚志人,研究员,博士,博士生导师,主要从事玉米生物技术及种质改良研究。