拟南芥CPK6在钙离子信号转导过程中的生理功能研究

于亚慧1,杨 菊1,张雨晨2,张 林3

(1.内蒙古大学 生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 010070;2.呼和浩特市第二中学,内蒙古 呼和浩特 010090;3.内蒙古蒙草生态环境(集团)股份有限公司,内蒙古 呼和浩特 010000)

摘要为了研究拟南芥CPK6基因在钙离子信号转导过程中的生理功能,进一步明确植物适应缺钙环境的分子机制,首先对CPK6基因缺失突变体(cpk6)进行纯合鉴定,获得了2种纯合突变体:cpk6-2和cpk6-3。通过分析野生型拟南芥Col-0和cpk6突变体在Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+二价阳离子缺失培养基上的生长表型,结果发现,拟南芥cpk6突变体在缺Ca2+条件下,相对野生型Col-0,表现出生长受抑制的表型。构建含有CPK6启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的转基因材料,通过GUS组织化学染色法,发现CPK6启动子在叶片生长点部位和根上有活性,并且在缺Ca2+条件下,CPK6启动子在叶片中的活性明显增强。通过原子吸收光谱法,发现拟南芥野生型Col-0和cpk6突变体之间,在对照和缺Ca2+条件下,总钙含量没有显著差别,表明CPK6基因不影响植物对钙的吸收和积累。利用组织化学染色法和荧光探针,结果发现,缺Ca2+条件下,cpk6突变体根和叶中H2O2的积累量明显高于Col-0,表明CPK6是介导缺Ca2+诱导植物积累H2O2的负调控因子。

关键词Ca2 +;拟南芥;CPK6;GUS;H2O2

植物响应外界胁迫时导致胞质内Ca2+浓度发生变化,产生Ca2+信号,Ca2+信号通过Ca2+传感器的解码和传递,引发下游一系列的生理反应[1-2]。钙依赖性蛋白激酶(CPKs)是植物中特有的Ca2+传感器,含有EF手型结构,可以结合Ca2+[3-4]。拟南芥中CPK基因家族有34个成员,其中,CPK6基因位于第2条染色体上[5-6]CPK6在拟南芥保卫细胞和叶肉细胞中均有表达,在响应外界刺激及感应细胞内钙离子浓度变化的过程中发挥着至关重要的作用[4]。研究发现,当拟南芥受到ABA(Abscisic Acid)胁迫时,CPK3和CPK6将共同作用,激活保卫细胞上的S型阴离子通道和Ca2+渗透性ICa阳离子通道,调节气孔关闭[7]。其中,在ABA浓度升高调节气孔关闭过程中,CPK6还能介导H2O2的产生和SLAC1的磷酸化[8]。但是CPK6在参与Ca2+信号转导过程中,对植物钙依赖性生长的调节机制以及对缺钙条件下植物体中H2O2积累的调控机制尚未明确。

植物受到外界各种不利刺激时,如病原体、干旱、盐碱、低温及空气污染等[9],能够感知环境刺激的性质、强度和持续时间,作出相应的生理反应[10]。在响应这些生物或非生物胁迫过程中,植物体内活性氧(ROS)信号和Ca2+信号协调参与,调控下游一系列生理生化反应[11-14]。H2O2是ROS的一种,各种外界刺激会引发植物细胞快速产生H2O2[15]。H2O2是内源性Ca2+浓度的调节因子,在应答外界刺激时,H2O2的产生需要Ca2+内流,从而激活定位在细胞质膜上的NADPH氧化酶进行应答反应[16-18]。研究发现,在植物免疫中,H2O2信号和Ca2+信号协同作用,共同引发下游生理过程[19],但二者之间的协同机制目前尚不清楚。因此,通过研究植物响应外界刺激时Ca2+信号引发的应激反应,及H2O2信号和Ca2+信号的协同作用机制,有助于更好地揭示植物适应逆境的机制。

本研究以模式植物拟南芥为试验材料,研究了CPK6基因参与Ca2+信号转导过程中,对植物钙依赖性生长的调节以及对缺钙条件下植物体产生H2O2的调控,旨在为进一步明确植物适应缺钙环境的机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用的哥伦比亚野生型拟南芥(Columbia ecotype,Col-0)种子、大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌菌株GV3101均由内蒙古大学祁智教授实验室保存;拟南芥CPK6基因缺失突变体cpk6-2 (Salk_033392)和cpk6-3(Salk_025460)、表达载体pORER1购自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心。EasyTaq PCR Supermix DNA聚合酶、pEASY-Blunt Simple Cloning Vector购自全式金公司;其他化学试剂购自Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 拟南芥cpk6突变体纯合鉴定 在拟南芥SIGnAL(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)网站输入cpk6突变体种子号,得到cpk6突变体纯合鉴定所需的引物序列(表1),所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用SDS方法提取Col-0和cpk6突变体幼嫩叶子的总DNA,用EasyTaq PCR Supermix DNA聚合酶进行PCR检测。PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

表1 纯合鉴定引物序列
Tab.1 Primer sequences used in homozygous verification

1.2.2 cpk6突变体表型分析 将干燥好的cpk6突变体和Col-0 种子同时播种在CK和Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+缺失的固体培养基上,于4 ℃冰箱低温处理3 d,然后置于培养室(光强:75~100 μmol/(m2·s) ;光照周期:12 h光照/12 h黑暗;温度:(23 ± 2)℃;相对湿度:60%~80%)竖直光照培养15 d。采集照片,分别测定cpk6突变体和Col-0的叶鲜质量与根长,重复3~5次。

各处理培养基成分如下:全营养培养基(CK):5 mmol/L MES,5 mmol KNO3,1/2 MS Fe盐,1 mmol/L H3PO4,1 mmol/L MgSO4,1 mmol/L CaCl2,1/2 MS微量元素,1/2 MS Mn盐,1%蔗糖,1%琼脂糖;缺钙培养基(0 mmol/L Ca2+):不含CaCl2,其余同CK;缺铁培养基(0 mmol/L Fe2+):不含Fe盐,其余同CK;缺镁培养基(0 mmol/L Mg2+):5 mmol/L MES,5 mmol/L KNO3,1/2 MS Fe盐,1 mmol/L H3PO4,1 mmol/L Na2SO4,1 mmol/L CaCl2,1/2 MS微量元素,1/2 MS Mn盐,1%蔗糖,1%琼脂糖;缺锌培养基(0 mmol/L Zn2+):1/2 MS微量元素(不含ZnSO4·H2O),其余同CK;缺锰培养基(0 mmol/L Mn2+):不含Mn盐,其余同CK。所有培养基均用KOH调节pH值至5.7,高温高压灭菌。

1.2.3 CPK6启动子活性研究 以野生型拟南芥基因组DNA为模板,将CPK6基因的启动子序列,克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector载体上,所用引物为:5′-CCGCGGTTTATTGTATGATTGTTATTATCCAAAATTTAGCG-3′和5′-GCTAGCGAAACAAACTCTCTCTATTTCACAACTT-3′,并转入E.coli DH5α中。将测序正确的CPK6启动子进一步整合到表达载体pORER1编码gusA酶基因片段上游的SacⅡ和NheⅠ多克隆位点,获得pCPK6∷GUS表达载体。将获得的重组质粒转化到农杆菌GV3101中,通过花序侵染法侵染野生型拟南芥,收获T1种子,经过3次抗性筛选后获得单基因插入的T3纯合转基因种子。

将稳定表达pCPK6∷GUS的拟南芥T3转基因种子播于全营养培养基(CK),4 ℃低温处理3 d,竖直光照培养7 d,分别移至CK和Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+缺乏的固体培养基上。继续竖直光照培养7 d后,采用组织化学法定位检测GUS活性。具体试验方法如下:取待染色的植物材料浸入GUS染色液中,37 ℃黑暗处理12 h,GUS染色液配方(1 mL):790 μL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液、10 μL 100 mmol/L X-Gluc母液、100 μL 5 mmol/L铁氰化钾、100 μL 5 mmol/L亚铁氰化钾、1 μL TritonX-100;用磷酸缓冲液冲洗植物材料;于FAA固定液中室温固定1 h,FAA固定液配方(100 mL):50 mL无水乙醇,5 mL冰醋酸,10 mL 37%甲醛,35 mL蒸馏水;将植物材料依次用50%,70%,100%乙醇漂洗各30 min;最后置于30%甘油中保存,用解剖镜观察并采集照片。

1.2.4 拟南芥cpk6和Col-0总钙量的测定 将干燥好的cpk6突变体和Col-0种子分别播于全营养培养基(CK),4 ℃低温处理3 d,竖直光照培养7 d后,分别移至CK和缺Ca2+固体培养基上。继续竖直光照培养3 d,收集植物材料,用1 mmol/L CuSO4溶液涮洗一遍,再用去离子水涮洗3遍,将根叶分离,用滤纸吸干表面水分;称鲜质量,记录数据;105 ℃杀青30 min;80 ℃烘干至其质量为恒定值;分别研磨植物的根和叶,置于2.0 mL离心管中称其干质量,记录并编号;向每个离心管中加入1.5 mL 5%的HNO3,涡旋振荡1 min;37 ℃裂解48 h;15 000 r/min离心30 min;取上清液至新的离心管,加入5%的HNO3稀释至2.0 mL,用原子吸收光谱仪(TAS990)测定总Ca含量。

1.2.5 H2O2检测 将干燥好的cpk6突变体和Col-0种子分别播种于全营养培养基(CK)和缺Ca2+固体培养基上,4 ℃低温处理3 d,竖直光照培养17 d。通过DAB(Diaminobenzidine)染色检测幼苗体内H2O2积累,取cpk6突变体和Col-0幼苗分别浸泡于浓度为1 mg/mL的DAB溶液中;抽真空,直至溶液完全进入幼苗,幼苗沉降到溶液底部;室温避光染色12 h;用100%乙醇漂洗12 h,进行脱色,期间更换100%乙醇数次;用去离子水清洗幼苗后放于60%甘油中保存;解剖镜观察,拍照。为进一步研究该现象,将竖直光照培养17 d后的幼苗,通过DHR(Dihydrorhodamine-123)染色法检测幼苗体内H2O2积累,取cpk6突变体和Col-0幼苗,黑暗条件下,将其分别浸泡于浓度为1 mg/mL 的DHR溶液中;避光染色10 min;用去离子水清洗幼苗后制片,并使用蔡司LSM 710激光共聚焦显微镜进行观察拍照。

2 结果与分析

2.1 拟南芥cpk6突变体纯合鉴定

为了获得纯合突变体,用SDS方法提取Col-0和cpk6幼嫩叶子的总DNA,利用T-DNA特异引物LBb1.3和CPK6基因特异引物LP和RP进行PCR检测。对于野生型拟南芥(AA),因无T-DNA插入,用LP/RP引物可扩增出一条900~1 100 bp的特异性DNA片段,用LBb1.3/RP引物扩增无DNA片段。而对于T-DNA插入的纯合突变体拟南芥(aa),用LBb1.3/RP引物进行PCR,能够扩增出一条410~710 bp的DNA片段,用LP/RP引物扩增无DNA片段。对于杂合体拟南芥(Aa),用LP/RP引物能够扩增出一条900~1 100 bp的特异DNA片段,同时也能用LBb1.3/RP引物扩增出一条410~710 bp的DNA片段[20]

图1 cpk 6-2和6-3纯合突变体鉴定
Fig.1 cpk 6-2 and cpk 6-3-homozygous-mutant-verification

结果显示,野生型Col-0用LP/RP引物扩增出一条1 000 bp左右的DNA片段,用LBb1.3/RP引物没有扩增出DNA片段。而cpk6突变体用LP/RP引物没有扩增出DNA片段,用LBb1.3/RP引物扩增出一条600 bp左右的DNA片段(图1)。表明鉴定的cpk6突变体均为纯合植株,可继续繁种进行下一步试验。

2.2 缺Ca2+条件抑制cpk6突变体生长

为了研究拟南芥CPK6基因在植物矿质营养方面的功能,分析了cpk6突变体和Col-0在全营养培养基(CK)和Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+缺失的固体培养基上的生长表型。结果发现,在全营养(CK)和Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+缺失条件下,不论是根长还是鲜质量,cpk6突变体同Col-0相比都无显著性差异,而在缺Ca2+条件下,相对于Col-0,cpk6突变体叶小发黄(图2-A),生长受到了明显抑制。根据鲜质量和根长的量化分析结果,发现在缺Ca2+条件下,Col-0的鲜质量为1.4 mg,根长为5.6 cm,cpk6突变体的鲜质量为0.8 mg,根长为4.2 cm。与Col-0相比,cpk6突变体的鲜质量减少了约42%(图2-B),根长短了约25%(图2-C)。表明缺Ca2+条件抑制cpk6突变体生长。

A.典型苗照片;B.鲜质量量化分析;C.根长量化分析;不同字母(a,b)代表同一培养条件下,Col-0、cpk6-2和cpk6-3在P<0.05水平上差异显著。
A.Typical seedlings photos;B. Fresh quality quantification analysis;C. Root length quantification analysis;
The different letters (a, b) represent significant difference of Col-0,>cpk6-2 and cpk6-3 under the same treatment at P<0.05.

图2 拟南芥 cpk 6生长表型分析
Fig.2 cpk 6 growth phenotypic analysis of Arabidopsis

2.3 缺Ca2+条件能够增强CPK6启动子在叶片中的活性

在一定的反应条件下,β-葡聚糖苷酶(GUS)可将X-Gluc水解成蓝色物质,因此,具有GUS活性的部位呈现蓝色或蓝色斑点,且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性。通过GUS组织化学染色法,发现移苗至CK和Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+缺失培养基的幼苗,在叶片的生长点部位和根上呈现蓝色,表明CPK6启动子在叶片的生长点部位和根中有活性(图3)。而移苗至缺Ca2+培养基的幼苗,不仅在叶片的生长点部位和根上呈现蓝色,其叶片中呈现蓝色的部位明显增多(图3),表明缺Ca2+处理能够明显增强CPK6启动子在叶片中的活性。

2.4 CPK6不参与拟南芥钙的积累

拟南芥cpk6突变体出现低钙敏感表型的原因,可能是由于植物体内Ca元素的积累能力下降,从而影响其在低钙条件下的生长发育。为了探究CPK6是否影响拟南芥对Ca元素的积累,通过原子吸收光谱法对cpk6突变体与Col-0体内的总Ca含量进行测定。结果发现,在全营养(CK)条件下,cpk6突变体和Col-0叶中总Ca含量为5.9 μg/mg,根中总Ca含量为3.4 μg/mg(图4)。在缺Ca2+条件下,cpk6突变体和Col-0叶中总Ca含量为3.6 μg/mg,根中总Ca含量为2.3 μg/mg(图4)。表明cpk6突变体和Col-0在缺Ca2+条件下的总Ca含量明显比在全营养(CK)条件下少,叶片中的总Ca含量减少了约39%,根中的总Ca含量减少了约32%,表明在缺Ca2+条件下,cpk6突变体和Col-0对Ca的积累明显减少。在缺Ca2+条件和全营养(CK)条件下,cpk6突变体与Col-0之间的总Ca含量无明显差异(图4)。表明CPK6不参与拟南芥对Ca元素的积累。

A.典型全苗照片;B.典型叶照片。
A.Typical whole seedling photos;B.Typical leaves photos.

图3 缺失不同二价阳离子条件下稳定表达 pCPK 6∷ GUS 的拟南芥幼苗组织化学染色
Fig.3 Histochemical staining of Arabidopsis seedlings stably expressing
of pCPK 6∷ GUS under different divalent cations deficient medium

A.叶中总钙含量;B.根中总钙含量;相同字母代表同一培养条件下,Col-0、cpk6-2和cpk6-3没有显著性差异(P>0.05)。
A.The total content of calcium in leaves;B.The total content of calcium in roots;The same letter represents no
significant difference of Col-0,cpk>-2 and cpk6-3 under the same treatment (P>0.05).

图4cpk6和Col-0总钙含量比较
Fig.4The comparison o total content of calcium ncpk6 and Col-0

2.5 CPK6是介导缺Ca2+诱导植物积累H2O2的负调控因子

为了研究缺Ca2+环境对植物体内H2O2积累的影响,对cpk6突变体和Col-0幼苗进行DAB组织化学染色,发现cpk6突变体和Col-0在缺Ca2+条件下叶片及根中的红褐色沉淀明显比在全营养(CK)条件下多,表明缺Ca2+诱导植物积累H2O2(图5)。在全营养(CK)下,cpk6突变体和Col-0相比,叶片及根中的红褐色沉淀都无明显差异。而在缺Ca2+条件下,与Col-0相比,cpk6突变体叶片及根中的红褐色沉淀都明显增多(图5),表明缺Ca2+条件下,cpk6突变体积累了更多的活性氧。

A. 典型全苗照片;B. 典型叶照片。
A. Typical whole seedling photos;B. Typical leaf photos.

图5 cpk 6和Col-0幼苗DAB组织化学染色
Fig.5 DAB histochemical staining of cpk 6 and Col-0 seedlings

为进一步研究该现象,对cpk6突变体和Col-0幼苗进行DHR染色,发现在全营养(CK)条件下,cpk6突变体和Col-0根部所发射出的绿色荧光强度较弱,且二者之间无明显差异,表明产生的H2O2较少(图6)。缺Ca2+条件下,cpk6突变体根部所发射出的绿色荧光强度明显高于Col-0(图6)。再次证明,缺Ca2+处理使得cpk6突变体根中H2O2的积累量明显高于Col-0。综上所述,CPK6是介导缺Ca2+诱导植物积累H2O2的负调控因子。

图6 cpk6和Col-0幼苗H2O2荧光探针DHR染色
Fig.6 H2 O2 fluorescent probe DHR staining of
cpk6andCol-0seedlings

3 讨论与结论

植物缺钙时,生长发育会受到严重影响,表现出植株小,叶子发黄等性状。有研究表明,拟南芥CPK6能够感应Ca2+浓度变化,参与多种Ca2+介导的信号通路,在植物逆境信号转导中发挥着重要作用[21-22]。本研究对在外界环境营养胁迫下,CPK6基因缺失突变体的生长情况进行分析,发现拟南芥CPK6基因使植物的生长受缺Ca2+抑制。进而探索cpk6突变体缺Ca2+敏感表型形成的机理,对CPK6启动子的活性进行检测。GUS组织化学染色结果显示,缺Ca2+处理能够增强CPK6启动子在叶片中的活性,推测拟南芥CPK6基因使植物的生长受缺Ca2+抑制可能与CPK6在叶中的表达量有关。为了研究突变体和野生型在缺Ca2+条件和全营养(CK)条件下总钙含量的差别,采用原子吸收光谱法进行测定,发现缺Ca2+条件并非通过影响cpk6突变体内Ca元素的积累而影响植物的生长。

植物受到外界刺激时,会影响自身生长和发育,导致植物体内代谢紊乱,在植物组织细胞中积累过量活性氧,引起氧化胁迫[23-24]。据前人研究,马铃薯钙依赖性蛋白激酶家族中,CPK4 和CPK5可以使NADPH氧化酶磷酸化进而正调控H2O2的产生,而拟南芥中与马铃薯CPK4、CPK5同源性最高的钙依赖性蛋白激酶是CPK6[25]。本研究对在缺Ca2+条件下,拟南芥组织细胞中活性氧的积累量进行分析,根据DAB组织化学染色和H2O2荧光探针DHR染色结果发现,拟南芥CPK6是介导缺Ca2+诱导植物积累H2O2的负调控因子,说明植物适应氧化胁迫的能力与植物的抗逆性密切相关。早有研究发现植物在应答外界胁迫刺激时,H2O2信号和Ca2+信号通路之间协同作用,但它们相互作用的机制目前仍不清楚[19]。为了研究H2O2的积累是否会导致细胞质内Ca2+浓度发生变化,本研究在拟南芥Col-0和cpk6突变体内表达了Ca2+依赖的水母发光蛋白(AEQ),在外加H2O2的条件下,检测细胞质Ca2+浓度的动态变化,但经过反复试验一直没有确定合适的H2O2处理浓度。下一步将深入分析原因,研究低Ca2+条件诱导植物积累H2O2的机制,以及H2O2和Ca2+信号通路之间在应对外界胁迫时的协同机制,进一步探索植物对低Ca2+环境的适应机制。综上所述,CPK6基因参与Ca2+信号转导,在植物生长发育过程中发挥着重要的作用,对CPK6的研究有助于揭示植物对缺钙环境的适应机制。

参考文献:

[1] Gilroy S,Trewavas A. Signal processing and transduction in plant cells:the end of the beginning[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(4):307-314.

[2] Aldon D,Mbengue M,Mazars C,et al. Calcium signalling in plant biotic interactions[J]. International Journal of Molecular Sciences,2018,19(3):1-19.

[3] Harmon A C,Gribskov M,Harper J F. CDPKs-a kinase for every Ca2+ signal[J]. Trends in Plant Science,2000,5(4):154-159.

[4] Boudsocq M,Sheen J. CDPKs in immune and stress signaling[J]. Trends in Plant Science,2013,18(1):30-40.

[5] 王娇娇,韩胜芳,李小娟,等. 钙依赖蛋白激酶(CDPKs)介导植物信号转导的分子基础[J]. 草业学报,2009,18(3):241-250.

[6] Laanemets K,Brandt B,Li J,et al. Calcium-dependent and independent stomatal signaling network and compensatory feedback control of stomatal opening via Ca2+ sensitivity priming[J]. Plant Physiology,2013,163(2):504-513.

[7] Mori I C,Murata Y,Yang Y,et al. CDPKs CPK6 and CPK3 function in ABA regulation of guard cell S-type anion-and Ca2+-permeable channels and stomatal closure[J]. PloS Biology,2006,4(10):1749-1762.

[8] Poovaiah B W,Du L,Wang H,et al. Recent advances in calcium/calmodulin-mediated signaling with an emphasis on plant-microbe interactions[J]. Plant Physiology,2013,163(2):531-542.

[9] Van Loon L C. The intelligent behavior of plants[J]. Trends in Plant Science,2015,21(4):286-294.

[10] Kissoudis C,Wiel C V D,Visser R G,et al. Future-proof crops:challenges and strategies for climate resilience improvement[J]. Current Opinion in Plant Biology,2016,30:47-56.

[11] Boudsocq M,Sheen J. CDPKs in immune and stress signaling[J]. Trends in Plant Science,2013,18(1):30-40.

[12] Poovaiah B W, Du L, Wang H, et al. Recent advances in calcium/calmodulin-mediated signaling with an emphasis on plant-microbe interactions[J]. Plant Physiology, 2013, 163(2):531-542.

[13] Schulz P,Herde M,Romeis T. Calcium-dependent protein kinases:hubs in plant stress signaling and development[J]. Plant Physiology,2013,163(2):523-530.

[14] Zipfel C,Oldroyd G E. Plant signalling in symbiosis and immunity[J]. Nature,2017,543(7645):328-336.

[15] 潘孝武,黎用朝,李小湘,等. 非生物胁迫条件下植物H2O2的代谢及信号转导[J]. 中国农业科技导报,2010,12(2):38-43.

[16] Keller T,Damude H G,Werner D,et al. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs[J]. Plant Cell,1998,10(2):255-266.

[17] Harding S A,Oh S,Roberts D M. Transgenic tobacco expressing a foreign calmodulin gene shows an enhanced production of active oxygen species[J]. Embo Journal,2014,16(6):1137-1144.

[18] Yang T,Poovaiah B W. Hydrogen peroxide homeostasis:activation of plant catalase by calcium/calmodulin[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2002,99(6):4097-4102.

[19] Stael S,Kmiecik P,Willems P,et al. Plant innate immunity-sunny side up[J]. Trends in Plant Science,2015,20(1):3-11.

[20] 李 敏, 杨 双, 阮燕晔, 等. 拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3的PCR鉴定[J]. 植物生理学通讯, 2006,42(1):91-94.

[21] 周 卫,汪 洪. 植物钙吸收、转运及代谢的生理和分子机制[J].植物学报,2007,24(6):762-778.

[22] 高 天,铁 英,王 妍,等. 拟南芥低钙诱导cDNA文库的构建[J]. 北方农业学报,2016,44(5):8-14.

[23] 李师翁,薛林贵,冯虎元,等. 植物中的H2O2信号及其功能[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2007(10):804-810.

[24] 张小莉,王鹏程,宋纯鹏. 植物细胞过氧化氢的测定方法[J]. 植物学报,2009,44(1):103-106.

[25] Munemasa S,Hossain M A,Nakamura Y,et al. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase,CPK6,functions as a positive regulator of methyl jasmonate signaling in guard cells[J]. Plant Physiology,2011,155(1):553-561.

Study on Physiological Function of Arabidopsis CPK6 in Ca2+ Signal Transduction

YU Yahui1,YANG Ju1,ZHANG Yuchen2,ZHANG Lin3

(1.School of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010070,China;2.Hohhot No.2 High School,Hohhot 010090,China;3.Inner Mongolia M-Grass Ecology and Environment(Group)Co,Ltd.,Hohhot 010000,China)

AbstractThe objective was to research the physiological function of CPK6 in Ca2+ signal transduction and to reveal the mechanism of plants to adapt to Ca2+ deficient environment. By homozygous identification of the CPK6 deletion mutant(cpk6),two homozygous mutants,cpk6-2 and cpk6-3 were obtained. And the growth phenotype of wild-type Arabidopsis Col-0 and cpk6 mutants in the deficiency of Ca2+,Fe2+,Mg2+,Zn2+ and Mn2+ were analyzed. The results showed that the mutants showed a growth-inhibiting phenotype relative to wild-type Col-0 in the deficiency of Ca2+. The Arabidopsis transgenic material expressing CPK6 promoter-driven β-glucuronidase were obtained. Using GUS histochemical staining,it was found that CPK6 promoter had activity in the roots and the growth point of the leaves. And the activity of CPK6 promoter in leaves was visibly enhanced under Ca2+ deficient condition. The total Ca content of Col-0 and cpk6 was determined by atomic absorption spectrometry(AAS). It was found that there was no significant difference in Ca content between Col-0 and cpk6 under control and Ca2+ deficiency conditions. The results indicated that CPK6 gene did not participate in the absorption and accumulation of Ca in Arabidopsis. Using histochemical staining and fluorescent probes methods,it was found that the accumulation of H2O2 in the leaves and roots of cpk6 was visibly higher than that in Col-0 under Ca2+ deficient condition. The results showed that CPK6 was a negative regulator of the accumulation of H2O2 induced by Ca2+ deficiency in plants.

Key words:Ca2 +Arabidopsis thalianaCPK6;GUS;H2O2

中图分类号Q945.78

文献标识码:A

文章编号:1000-7091(2018)04-0075-07

doi:10.7668/hbnxb.2018.04.011

收稿日期2018-04-14

基金项目内蒙古科技重大专项(内财教[2014]2020号)

作者简介于亚慧(1994-),女,山东菏泽人,在读硕士,主要从事植物生化与分子生物学研究。

通讯作者张 林(1965-),男,内蒙古赤峰人,高级工程师,博士,主要从事植物逆境生理学研究。