牦牛是分布于青藏高原及其毗邻地区海拔3 000 m以上的特殊畜种，也是当地农牧民重要的经济和食物来源。有研究表明，牦牛肉较普通黄牛肉，其肉质品质更为优良，尤其是蛋白质、脂肪和氨基酸含量均优于普通黄牛肉[1]。近年来，随着人们生活水平的不断提高，对牛肉的消费量也不断增大，人们也越来越重视牛肉的肉品质，而牦牛肉因富含丰富的蛋白质和矿物质等，深受消费者的青睐。因此，如何提高牦牛肉品质及产量成为当前的研究热点之一。
结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)是基质蛋白，为即刻早期基因(Immediate early gene，IEGs)家族成员之一[2]，在许多生理生化过程中发挥重要作用，如软骨细胞的分化增殖及成熟、胞外基质合成及平衡维持等，是关节组织内必不可少的生长因子[3]。CTGF于1988年被Almendral等[4]发现，Bradham等[5]于1991年首次分离获得CTGF，随后在牛[6]、猪[7]等其他动物体内也相继发现CTGF，CTGF在不同种属间进化较为保守，且CTGF基因及其编码蛋白均表现出高度的同源性。在正常生理状态下，动物体内CTGF表达量较低或无，但在胚胎阶段或骨发育过程却表现出CTGF高表达[8-9]，表明CTGF可通过自身调节来影响其表达水平[10]。CTGF的表达调控可进一步影响动物骨骼发育，研究显示，骨形态发生蛋白诱导的转化生长因子β(TGF-β)可通过Wnt信号通路上调CTGF表达量，CTGF通过 αvβ 1整合增强成骨细胞的黏附，并促进细胞通过细胞骨架重组和Rac 1的激活迁移[11-12]。且CTGF是胶原表达的生理调节器，可诱导胶原蛋白凝胶收缩[13]，人皮肤成纤维细胞中I型前胶原的表达依赖于内源TGF-β和CTGF的相互作用，TGF-β/Smad蛋白/CTGF轴的表达水平下调可介导I型前胶原表达降低[14]。CTGF还可诱导骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞等向软骨细胞分化，使骨骼在早期发育中具备软骨力学，参与关节软骨修复过程，在肌营养不良的成肌细胞中CTGF可作为诱导骨骼肌纤维化的新型药理学工具，是组织工程比较有意义的研究方向[15]。CTGF在滑膜炎中高表达[16]，改变CTGF的表达量能够预防损伤引起的关节炎，CTGF与骨形态发生因子4(BMP-4)、肝细胞生长因子和CCN3之间的动态联系可用于确定受伤组织愈合及纤维化过程。以上研究表明，CTGF基因除在骨骼的发育过程中发挥作用外，其与肌纤维发育也密切相关，而肌纤维可直接影响肉质品质。因此，可调控肌纤维特性来改善肉质的品质。
目前，CTGF基因在人类及一些模式动物如小鼠和大鼠等物种中的研究较多，而在家畜上的研究相对较少。本研究通过对牦牛CTGF基因进行编码蛋白的生物信息学分析，并对该基因进行荧光定量PCR检测，得到该基因在牦牛不同组织器官中的表达情况，为CTGF基因在牦牛肌纤维发育等方面的调控作用提供数据支撑。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物 以3头健康成年类乌齐牦牛为试验动物(取于西藏自治区昌都市类乌齐县)，屠宰后迅速采集其试验所需组织(心脏、肾脏、肺脏、肝脏和臀肌)，DEPC水冲洗干净后，置于液氮中保存备用，用于提取基因组 DNA 和 RNA。
1.1.2 试验试剂 DNA 提取试剂盒、2×Long Taq聚合酶、DNA Marker和Loading Buffer 购于天根生化科技(北京)有限公司，蛋白激酶K和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司，TRIzol提取试剂购于Invitrogen公司(美国)。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA及RNA的提取 使用动物组织DNA提取试剂盒获得牦牛组织样本基因组，以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行检测总DNA，-20 ℃保存备用。
将荧光定量所需组织采用TRIzol法进行总RNA 提取，并利用分光光度计和1.0 %琼脂糖凝胶电泳分别测定 RNA浓度、D260nm/280nm值和RNA质量，并按照反转录试剂盒的步骤将RNA反转录成cDNA，置于-20 ℃中保存。
1.2.2 引物设计 根据GenBank收录的普通牛CTGF基因序列(NM_174030.2)以及Primer 5.0软件设计克隆引物；后根据牦牛该基因CDS区序列设计荧光定量引物，以GAPDH作为内参基因(表1)。引物由上海伯津生物技术有限公司和成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
表1 牦牛CTGF 基因引物
Tab.1 Primers of CTGF gene in the yak
基因Gene序列(5'-3')Sequence退火温度/℃Temperatures扩增片段/bpProductCTGF-PCRF:GGAGTGCCTGTTCCAAGA58.0996R:TTGACGGACTATTCGTTTGACTGF-qPCRF:CCAACCAACCGCAAGATC57.5232R:ATTCCTCGCAGCATTTCC GAPDHF:CCACGAGAAGTATAACAACACC57.5120R:GTCATAAGTCCCTCCACGAT
1.2.3 PCR扩增 以牦牛基因组DNA样品为模板进行梯度PCR，反应体系(15 μL)：上、下游引物各0.6 μL，DNA模板0.6 μL，总RNA为800 ng，ddH2O 5.7 μL，2×Long Taq DNA预混酶7.5 μL。
PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，退火温度和延伸时间由每对引物不同分别选择一定范围进行梯度PCR，共30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。
1.2.4 组织表达分析 内参基因为GAPDH，cDNA为模板，分析该基因在牦牛各组织(心脏、肾脏、肺脏、肝脏和臀肌)的相对表达量。反应体系(10 μL)：上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，总RNA为800 ng ddH2O 3.2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。使用Excel自行编辑函数(2Ct)计算各个组织相对表达量，利用SPSS 19.0软件中单因素方差分析Duncan程序进行组织表达量显著性分析。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的扩增
以类乌齐牦牛基因组DNA为模板，进行PCR产物扩增，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，得到的条带与目的条带一致，长度为996 bp(图1)。
M.DL2000 DNA Marker；1，2.CTGF基因的序列。
M.DL2000 DNA Marker；1，2.CTGF gene sequence.
图1 牦牛CTGF基因的PCR扩增
Fig.1 PCR amplification of CTGF gene of yak
并对牦牛CTGF基因序列进行开放阅读框分析，得出该基因的CDS区长度为1 050 bp，共编码349个氨基酸。序列已上传NCBI，登录号：MT968972。
2.2 CTGF基因CpG岛与跨膜区、信号肽的预测
用CpGPlot预测CpG岛的位置，满足G+C含量>50.0，Obs/Exp比率>0.6，长度>200，在47～635 bp长度为589 bp的区段含有CpG岛，在949～1 152 bp长度为204 bp的区段含有CpG 岛，暗示有2个启动子区域(图2)。
图2 牦牛CTGF基因CpG岛预测
Fig.2 CpG island prediction of yak′s CTGF gene
通过Signal P 4.1 server软件预测CTGF信号肽及切割位点，发现位于1-27位氨基酸为信号肽(P=0.904)，且发生切割的位点位于26-27位氨基酸之间(P=0.450)(图3)。采用TMHMM server 2.0软件分析该蛋白的跨膜结构，发现编码此蛋白的所有氨基酸均位于膜表面，说明该蛋白是一种膜表面蛋白。
图3 牦牛CTGF蛋白分子信号肽预测
Fig.3 SignalP peptide prediction of yak′s CTGF protein
2.3 CTGF蛋白理化性质分析
采用Protparam工具预测牦牛CTGF基因编码蛋白理化性质分析中，发现该蛋白的分子式为C1637H2600N460O495S47；分子质量为38.152 26 ku，含20种基本氨基酸，其中所占比例最高和最低的氨基酸分别为Cys(10.6%)和Trp(0.6%)；带有负电荷的Asp+Glu残基和带有正电荷的Arg+Lys残基分别有35，44个，理论等电点为8.39，且该蛋白的平均亲水系数和不稳定系数分别为-0.223，45.94，表明该蛋白不稳定。
2.4 CTGF基因编码蛋白三级结构预测
采用CDD在线分析软件对类乌齐牦牛CTGF蛋白三级结构进行预测，发现该蛋白具有3个保守功能结构域，分别为：IGFBP为胰岛素样生长因子结合蛋白；VWC为血管性血友病因子C结构域；TSPI为血小板反应蛋白I型域(图4)。
图4 CTGF蛋白的三级结构
Fig.4 Third structure of CTGF protein
2.5 蛋白磷酸化分析
采用NetPhos 2.0 Server在线软件分析牦牛CTGF蛋白的磷酸化位点，发现该蛋白含有21个磷酸化位点，其中9个Ser磷酸化分别位于25，26，112，115，119，145，166，271 和275位碱基处；8个Thr磷酸化位点分别位于69，96，187，222，259，294，299和300位碱基处；4个Tyr磷酸化位点位于122，209，340和345位碱基处。蛋白质磷酸化位点周围存在与激酶类型有关的保守残基片段，可逆磷酸化位点有助于阐明蛋白质复杂而重要的生物学功能。
利用NetGlycate 1.0 Server在线预测软件分析糖基化位点，发现该蛋白分别在98，211，252，261，264，321和343 7个位点发生糖基化反应。由于在糖基化位点上可连接不同的糖链，从而产生微观不均一性现象。
2.6 亲水性/疏水性及亚细胞定位预测
运用ProtScale工具对牦牛CTGF蛋白进行亲/疏水性预测分析，发现在牦牛CTGF多肽链中具有最强亲水性(-2.533)的位点位于第74位C；最强疏水性(3.144)的位点位于第15位V和16位L，整个多肽链表现为亲水性。采用PSORT Ⅱ Prediction软件对牦牛CTGF基因进行亚细胞定位分析，发现CTGF在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多。
2.7 CTGF基因编码蛋白功能分析
采用Protfun 2.2 Server软件对CTGF进行蛋白功能分类预测，结果显示，CTGF在运输和结合过程中的概率值为0.834，其次，在能量代谢过程中的概率值为0.122，推测CTGF在蛋白功能作用中主要参与机体的能量代谢、运输和结合等过程(表2)；同时在CTGF基因编码蛋白基因本体分类结果中，发现CTGF在结构蛋白、转录因子和生长因子中概率值分别为0.223，0.217，0.078，说明CTGF可能作为结构蛋白、转录因子和生长因子，在机体中发挥功能(表3)。
表2 牦牛CTGF基因编码蛋白功能分类分析
Tab.2 Functional category analysis of protein
encoded by yak′s CTGF gene
功能分类Functional category概率Probability可能性Odds氨基酸生物合成 Amino acid biosynthesis0 0 辅因子的生物合成 Biosynthesis of cofactors0.0300.414细胞被膜 Cell envelope0.0460.760细胞加工 Cellular processes0.0270.373中央中间代谢 Central intermediary metabolism0.0410.658能量代谢 Energy metabolism0.1221.350脂肪酸代谢 Fatty acid metabolism0.0181.404嘌呤和嘧啶 Purines and pyrimidines0.0690.283调节功能 Regulatory functions00复制和转录 Replication and transcription00翻译 Translation00运输和结合 Transport and binding0.8342.033
表3 牦牛CTGF基因编码蛋白基因本体分类分析
Tab.3 Gene Ontology category analysis of protein
encoded by yak′s CTGF gene
2.8 系统发育树构建
利用MEGA 7软件构建类乌齐牦牛CTGF基因的系统发育树，结果显示，牦牛与普通牛亲缘关系最近；其次与绵羊、猪、人、兔等的亲缘关系较近；与安大略鲑的亲缘关系最远，说明在生物进化过程中，高度保守，且符合物种进化规律(图5)。
图5 牦牛CTGF基因的系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree of CTGF gene in yak
2.9 组织表达分析
荧光定量结果显示，CTGF基因在类乌齐牦牛肾脏、肺脏、肝脏、心脏和臀肌各组织中均有表达(图6)，在肝脏中的表达量最高，其次是肾脏，在臀肌中的表达量最低；对各组织进行差异显著性分析发现，肾脏、肺脏、肝脏与心脏和臀肌相比，其差异显著(P<0.05)，心脏与臀肌相比，差异显著(P<0.05)。
小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)；
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
The same lowercase letter indicates that the
difference is not significant(P>0.05)；
The different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).
图6 CTGF基因在牦牛不同织中mRNA的相对表达量
Fig.6 The relative expression of mRNA in different
tissues of CTGF gene in yak
3 讨论与结论
结缔组织生长因子(CTGF)称为细胞通信网络因子2[17]，存在于多种组织器官中，其功能主要是促进细胞增殖分化、骨骼发育、软骨发生、组织修复，并参与许多细胞活动，刺激细胞增殖、分化和凋亡，调节基质基因表达维持基质平衡，刺激细胞迁移和成纤维细胞的活化，并诱导细胞转化等[18-23]。而牦牛因生长环境原因，其肌纤维较粗，肉质较其他牛品种嫩度较差，但牦牛肉中含有丰富的蛋白质和氨基酸，从而受到广大消费者青睐 [24-26]，同时牦牛肉是藏族人民特有的肉类资源和重要的经济来源。因此，如何提高牦牛肉质品质成为近年来的研究热点之一。目前，关于CTGF基因的研究主要集中在该基因的表达调控对病理过程的影响，如：肾功能衰竭[27]、心肌纤维化[28]、肝纤维化[29]等疾病，而关于家畜肉质性状、肌肉发育等的研究相对较少。
本研究通过对类乌齐牦牛CTGF基因进行编码蛋白的生物信息学分析，发现该基因含2个CpG岛，有一个长为1 050 bp的开放阅读框，编码349个氨基酸，这与黄叶[7]等在猪上的研究结果一致。CTGF有信号肽，为水溶性不稳定的表面蛋白，共有21个磷酸化位点和7个糖基化位点，在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多，其中内质网是蛋白质、脂类(如甘油三酯)和糖类合成的基地，而CTGF主要分布于内质网中，推测CTGF基因可能在蛋白质、脂类和糖类合成过程中发挥一定的调节作用，从而参与牦牛的生长发育过程。对牦牛CTGF蛋白进行三级结构预测，发现存在3个保守功能结构域，分别为IGFBP(胰岛素样生长因子结合蛋白)、VWC(血管性血友病因子C结构域)和TSPI(血小板反应蛋白I型域)，推测CTGF可能作为生长因子在牦牛生长发育等过程中发挥重要作用。
对类乌齐牦牛的肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌进行荧光定量检测，发现该基因在牦牛各组织中均有表达，其中在肝脏的表达水平最高，其次是肺脏和肾脏，臀肌的表达量最低；且肾脏与臀肌差异显著(P<0.05)。有研究表明，鳖甲煎丸能显著改善肝硬化模型大鼠的肝功能和糖脂代谢紊乱，其作用机制与调控CTGF等纤维化细胞因子有关[30]；而肝脏是以代谢功能为主的重要器官，起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用，会导致纤维基质在肝脏内沉积[31-32]，且肝脏脂质过氧化的发生导致肝脏脂质代谢紊乱，从而导致多种疾病的发生(如：动脉粥样硬化)[33]。肾脏具有排泄体内代谢产物、维持机体内水平衡和维持体内电解质和酸碱平衡等功能；在气体信号分子硫化氢下调CTGF途径来改善小鼠酒精性肾间质纤维化中的应用试验中，得出硫化氢可改善小鼠肾小管间质纤维化，其机制与下调CTGF信号通路及其调控的MMP-8/TIMP-1有关[34]。而荧光定量显示，牦牛CTGF基因在肝脏中的表达水平最高，推测该基因在肝脂质代谢过程中发挥作用，而在肾脏中的表达量也相对较高，说明该基因在牦牛肾脏组织中与脂质代谢过程可能存在间接相关性。此外，牦牛在肺脏中的表达水平也相对较高，肺脏是机体的重要呼吸器官，而牦牛主要生活在高海拔地区的低氧、寒冷等极度恶劣的气候环境中，推测该基因在牦牛低氧适应性的生理特性中也发挥一定调控作用。
牦牛CTGF基因含2个CpG岛，开放阅读框长度为1 050 bp，可编码349个氨基酸，CTGF有信号肽，为水溶性不稳定的表面蛋白，共21个磷酸化位点和7个糖基化位点，在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多，有3个完整的保守功能结构域，且在肝脏组织中的表达水平最高，其次是肺脏和肾脏。
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