强还原灭菌法(Reductive soil disinfestation，RSD)是一种皆具广谱，高效、便捷、环保等诸多优点的土壤灭菌方法。该方法中，因有机物料的理化性质和降解性能不同，导致淹水后所创造的土壤环境存在较大差异，最终直接影响了灭菌效果[1-5]。有研究表明，对土壤进行RSD处理时，添加水稻秸秆、甘蔗渣、菜粕、米糠、烟梗对土壤理化性状的影响明显不同，其中添加烟梗可使土壤速效钾与有机质含量显著提高，添加菜粕则显著提高了土壤速效氮、有机质、全氮含量及过氧化氢酶和脲酶活性[6]。以紫花苜蓿为有机物料对土壤进行强还原灭菌处理后，土壤pH值升高，同时，灭菌土壤上配施968生物菌肥可降低番茄茎基腐病与黄瓜枯萎病的发病率[7]；此外，紫花苜蓿为有机物料还可在短期内有效改良设施蔬菜退化土壤，显著提高土壤pH值[8]。
作为世界第一大水果的柑橘是仅次于小麦和玉米的第三大贸易农产品[9]，柑橘皮中富含果胶、矿质等多种营养[10]，同时还可以从中提取精油、橙皮苷、多酚等生物活性物质[11]。柑橘皮资源在农业生产中具有极大的应用价值与开发潜力[12-13]。据统计，我国每年产生柑橘皮渣高达1 000万t以上[14]，但是，三分之二的皮渣被废弃或填埋，不仅造成资源的浪费，还对环境造成了威胁[15]。
鉴于此，本研究利用柑橘皮渣作为有机物料对供试土壤进行强还原灭菌处理，探究土壤理化性状及土壤酶活性的变化，以期为农业生产中有效利用柑橘皮渣资源提供理论依据和技术支持。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试土壤：土壤为农田黑土，风干过筛，测定其基本理化性状如下：碱解氮198.71 mg/kg，速效磷106.46 mg/kg，速效钾90.74 mg/kg，有机质22.88 g/kg，pH值7.16。
供试有机物料：柑橘皮渣，自然风干，粉碎过0.84 mm孔径筛。
土培试验盆钵：(上口径：10.5 cm，下口径：6.5 cm，高：9.5 cm)。
1.2 试验设计
橘皮添加量共设3个水平：①不添加橘皮(CK1)；②RSD处理时添加橘皮量为土质量的0.25%，(0.25%)；③RSD处理时添加橘皮量为土质量的0.50%(0.50%)，每处理6盆。
1.3 试验方法
土样进行RSD处理时，每盆装风干土400 g，依据试验设计分别添加有机物料1 g(0.25%)、2 g(0.50%)，装盆前将有机物料与土壤充分混匀，灌水使土壤水分达饱和状态，覆膜，室温培养40 d。土培试验结束后，各处理随机取样，一部分土样风干，磨细、过筛，测定土壤碱解氮、速效磷、速效钾、有机质、pH值，另一部分样品用于测定土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性。
1.4 测定项目及方法
土壤有机质、碱解氮、速效磷含量、pH值分别采用K2Cr2O7容量法、碱解扩散法、钼锑抗比色法、电位法测定[16]；速效钾采用比浊法[17]测定；土壤脲酶活性采用扩散法测定；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定；磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定[18]。
1.5 试验数据处理
试验数据应用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析与相关分析，采用LSD法进行多重比较，测定指标间的相关性以皮尔逊相关系数表示，显著水平取0.05(P≤0.05)。
2 结果与分析
2.1 强还原灭菌处理对土壤理化性状的影响
以橘皮为有机物料对土壤进行RSD处理后其理化性状见表1，由表可知，强还原灭菌处理后，土壤有机质，碱解氮与速效磷含量都显著高于灭菌前。所有处理中，以橘皮添加量为0.25%处理的土壤碱解氮与速效磷含量为最高，其中，无橘皮处理，橘皮添加量为0.25%处理与0.50%处理的土壤碱解氮含量分别为灭菌前处理的1.21，1.33，1.25倍，相应处理的土壤速效磷含量分别为灭菌前处理的1.74，2.13，1.83倍。同时，在RSD处理条件下，橘皮添加量为0.25%处理的土壤碱解氮与速效磷含量分别是无橘皮处理的1.10，1.22倍。经RSD处理后只有橘皮添加量为0.50%处理的土壤速效钾含量显著高于灭菌前。
表1 强还原灭菌对土壤理化性状的影响
Tab.1 The effects of RSD on soil physical and chemical properties
处理Treatments碱解氮/(mg/kg)Alkaline hydrolysable nitrogen速效磷/(mg/kg)Available phosphorus速效钾/(mg/kg)Available potassium有机质/(g/kg)Organic matterpH值pH valueCK198.71±1.20d106.46±5.11c90.75±1.62b22.88±1.88c7.17±0.02dCK1240.68±1.21c185.03±5.04b101.41±10.10b26.98±0.76b7.53±0.01c0.25%263.72±2.00a 226.49±10.47a 113.49±13.01b 29.83±0.25ab7.57±0.02b0.50%247.66±2.22b195.14±5.00b175.30±6.66a30.85±0.25a7.66±0.01a
注：表中CK、CK1、0.25%、0.50%分别表示灭菌前、无橘皮添加的RSD处理、橘皮添加量为0.25%的RSD处理、橘皮添加量为0.50%的RSD处理；表中数值为4次重复测定的均值±标准误；同列不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著。表2同。
Note：CK，CK1，0.25% and 0.50% represent before RSD，without citrus peels in RSD，adding 0.25% citrus peels in RSD and adding 0.50% citrus peels in RSD respectively；the values are means of four replicates ±s；Significant difference(LSD，P≤0.05)is indicated by different letters within the same columns.The same as Tab.2.
土壤有机质是评价土壤肥力高低的一个重要指标，与土壤生产力息息相关。与灭菌前相比，添加橘皮对土壤进行强还原灭菌处理可显著提高有机质含量，且土壤有机质含量随橘皮添加量的增加而增加，但橘皮添加量为0.25%处理与0.50%处理间无显著差异，其中，橘皮添加量为0.25%处理的土壤有机质含量分别是灭菌前与无橘皮灭菌处理的1.30，1.11倍。土壤pH值不仅是衡量土壤酸碱度的一个直观指标，而且是影响土壤酶活性的一个重要因素。与有机质的变化相似，土壤经过强还原灭菌后pH值都显著提高，且随着橘皮添加量的增加而不断上升，橘皮添加量为0.50%时土壤pH值达最高，较灭菌前升高0.49个pH值单位。
2.2 强还原灭菌处理对土壤酶活性的影响
土壤经RSD处理后，除蔗糖酶外，脲酶与磷酸酶活性较灭菌前均显著增强(表2)。与碱解氮的变化相似，灭菌处理后土壤脲酶活性以橘皮添加量为0.25%处理最高，此时的酶活性分别为灭菌前与无橘皮处理的 8.07，1.69倍。灭菌后土壤磷酸酶活性随橘皮添加量的增加而增强，其中，无橘皮处理与橘皮添加量为0.25%处理与0.50%处理的土壤磷酸酶活性分别为灭菌前的2.27，2.43倍，且橘皮添加量为0.50%处理的土壤磷酸酶活性是无橘皮灭菌处理的1.46倍。
表2 强还原灭菌对土壤酶活性的影响
Tab.2 The effects of RSD on soil enzyme activities
处理Treatments脲酶活性/(mg/(g·d))Urease activity蔗糖酶/葡萄糖/(mg/(g·d))Invertase activity磷酸酶活性/(mg/(g·d))Phosphatase activityCK0.18±0.01c33.01±1.69a0.059±0.000dCK10.86±0.02b 24.95±0.40bc0.135±0.005c0.25%1.45±0.09a27.97±2.65b0.144±0.002b0.50%1.02±0.06b21.47±0.47c0.197±0.003a
与灭菌前相比，土壤蔗糖酶活性在强还原灭菌后都显著降低，橘皮添加量为0.25%处理与0.50%处理的土壤蔗糖酶活性与无橘皮处理间差异不显著。
2.3 土壤理化性状与酶活性相关性分析
RSD处理前后土壤理化性状与酶活性的相关性分析见表3，4，由表3可知，灭菌前，土壤脲酶活性与pH呈显著负相关，相关系数为0.973。土壤脲酶活性与有机质在灭菌前与无橘皮灭菌条件下均呈负相关，橘皮添加量增加至0.25%和0.50%时，二者转变为正相关，但相关性未达到显著水平。灭菌前，土壤磷酸酶活性与速效磷呈负相关，RSD处理后二者呈正相关，且橘皮添加量为0.50%时，相关性达显著水平，相关系数为0.982；此外，无橘皮灭菌条件下，土壤磷酸酶活性与速效钾也呈显著正相关。土壤经RSD处理，橘皮添加量为0.5%时土壤蔗糖酶活性与pH呈负相关，相关系数为0.645。
表3 灭菌前与无橘皮处理条件下土壤理化性状与酶活性相关性
Tab.3 Correlation between physical and chemical properties and enzyme activities
of soil before RSD and without citrus peels in RSD
相关性Correlation有机质Organic matter碱解氮Alkaline hydrolysable nitrogen速效磷Available phosphorus速效钾Available potassiumpH值pH vaule脲酶活性Urease activity蔗糖酶活性Invertase activity磷酸酶活性Phosphatase activity有机质 Organic matter10.9430.238-0.0040.538-0.3960.2570.529碱解氮 Alkaline hydrolysable nitrogen0.60910.070-0.2650.258-0.082-0.0750.614速效磷 Available phosphorus-0.1390.34310.8910.159-0.2960.387-0.682速效钾 Available potassium0.0500.2640.94410.359-0.5410.665-0.730pH值 pH vaule-0.309-0.7850.1190.3181-0.973*0.9120.350脲酶活性 Urease activity-0.272-0.5850.4200.5980.9491-0.982*-0.132蔗糖酶活性 Invertase activity-0.5040.2560.8620.653-0.0930.1591-0.080磷酸酶活性 Phosphatase activity0.2140.5470.9380.951*0.0180.3270.6701
注：右上三角和左下三角中的数值分别表示灭菌前与无橘皮添加的RSD处理土壤理化性状与酶活性的相关系数；*.在 0.05 水平上相关性显著。表4同。
Note：The values in the upper right triangle and the lower left triangle respectively represent the correlation coefficient between the physical and chemical properties and enzyme activities of soil before RSD and without citrus peels in RSD；*.Significant correlation at the level of 0.05.The same as Tab.4.
表4 橘皮添加量为0.25%与0.50%处理土壤理化性状与酶活性相关性
Tab.4 Correlation between physical and chemical properties and enzyme activities of soil for the treatments
of adding 0.25% citrus peels in RSD and adding 0.50% citrus peels in RSD
相关性Correlation有机质Organic matter碱解氮Alkaline hydrolysable nitrogen速效磷Available phosphorus速效钾Available potassiumpH值pH value脲酶活性Urease activity蔗糖酶活性Invertase activity磷酸酶活性Phosphatase activity有机质 Organic matter10.322-0.366-0.784-0.2590.174-0.939-0.895碱解氮 Alkaline hydrolysable nitrogen0.2571-0.724-0.782-0.676-0.553-0.126-0.710速效磷 Available phosphorus0.5480.30610.463-0.002-0.1550.0280.625速效钾 Available potassium-0.9450.059-0.54010.7510.4250.7100.946pH值 pH value-0.0700.9460.1100.38110.9060.3400.497脲酶活性 Urease activity0.1780.889-0.1260.1460.8701-0.0670.117蔗糖酶活性 Invertase activity0.782-0.3760.179-0.909-0.645-0.30010.750磷酸酶活性 Phosphatase activity0.6080.1510.982*-0.649-0.070-0.2580.3351
注：右上三角和左下三角中的数值分别表示橘皮添加量分别为0.25%和 0.50%处理的土壤理化性状与酶活性的相关系数。
Note：The values in the upper right triangle and the lower left triangle respectively represent the correlation coefficient between physical and chemical properties and enzyme activities of soil added 0.25% citrus peels in RSD and added 0.50% citrus peels in RSD.
3 讨论与结论
已有的研究表明，RSD法对土壤质量及作物产量会产生诸多积极的影响[6，19-20]。其中，有机物料的种类是影响其效果的重要因素之一[1]。本研究中，创新性地选用橘皮为有机物料，土壤经RSD处理后，碱解氮、速效磷与有机质含量均显著增加，pH值显著上升；同时，土壤脲酶与磷酸酶活性也显著提高。以其他有机物料对土壤进行强还原灭菌处理也有类似的结论。以水稻秸秆为有机物料对土壤进行RSD处理，15 d后，土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量以及pH值都比RSD处理前显著增加，且随着秸秆量的增多有机质含量和pH值也增加[21]。此外，以麦秸为有机物料对土壤进行淹水处理时发现，强还原条件下速效磷含量也显著增加[22]。分析认为，RSD处理后土壤速效磷的增加主要有三方面原因，首先，强还原条件有利于土壤闭蓄态磷表面胶膜的分解，进而将其包被的磷酸盐释放；其次，土壤pH值升高可以在一定程度上减少磷的吸附与固定。最后，土壤速效磷含量的增加还与还原条件下有机酸的产生有关。有研究证实，以麦麸为有机物料对土壤进行强还原灭菌，可以检测到乙酸和丁酸产生，且随着处理时间的延长，2种酸的含量呈现持续增加的趋势，后期乙酸的含量高于丁酸[23]。有机物的厌氧分解主要经历水解酸化、产氢产乙酸、产甲烷3个阶段，而乙酸、丙酸和丁酸是这一过程中产生的代表性有机酸，且丁酸和丙酸则先要在产氢产乙酸菌作用下转化为乙酸。结合本研究，土壤强还原过程中产生的有机酸与难溶性磷酸盐组分中的Fe3+、Al3+、Ca2+螯合，将
释放，从而提高了磷的有效性。本研究中，以橘皮为有机物料对土壤进行强还原灭菌处理过程中有机酸种类及含量的变化有待进一步深入研究。
强还原后土壤有机质含量显著增加与柑橘皮中丰富的碳水化合物是密不可分的，柑橘皮富含果胶与纤维素，其中，果胶含量约占其干质量的 20%～30%[24]。橘皮的分解为土壤提供了大量有机质[25]。本研究中经RSD处理的土壤pH值显著升高，这可能与厌氧条件下某些易还原物质的转化有关。相关研究表明，对土壤进行RSD处理时，强还原条件会刺激反硝化微生物的生长，有利于反硝化作用的进行，硝态氮被还原时消耗大量H+，导致土壤pH值显著上升[26]。另外，在水稻土、红壤和砖红壤中添加紫云英，土壤淹水处理后风干土的pH值上升，研究认为干湿交替引起的pH值变化与还原条件下铁锰氧化物被还原需要消耗H+有关[27]。本试验中速效钾含量随橘皮量的增加而增加，这与橘皮中富含钾[10]有关。
土壤酶在养分的生物循环、腐殖质的合成和分解过程中发挥着重要作用[28]。研究表明，土壤脲酶和碱性磷酸酶的活性可用作评价土壤肥力的指标，且对磷酸酶活性影响最大的是土壤全氮，其次是速效磷，对脲酶活性影响最大的则是土壤有机质，其次是碱解氮[29]。湿地土壤上的研究也证实，有机质是影响土壤脲酶活性最主要的因素[30]。本研究中，RSD处理后，橘皮添加量分别为0.25%与0.50%处理的土壤脲酶活性与有机质含量呈正相关，而无橘皮处理时两者则呈负相关，由此说明土壤脲酶活性的增强有赖于有机质含量的增加，而橘皮的添加使二者的相关性变大；此外，RSD处理可使土壤温度升高[31]，而脲酶活性与温度有关，低温条件下脲酶活性较弱[32]，所以土壤温度升高是脲酶活性增强的第2个原因。在玉米上施用生物有机肥并配施氮肥后，土壤碱性磷酸酶活性与土壤速效磷、速效钾含量呈显著正相关，而土壤蔗糖酶活性与各养分指标间相关性未达到显著水平[33]。本试验中，RSD处理后土壤磷酸酶活性与速效磷含量均呈正相关，其中橘皮添加量为0.50%处理时二者的相关性达显著水平，无橘皮处理的土壤磷酸酶活性与速效钾含量也呈显著正相关；此外，本试验中RSD处理后土壤蔗糖酶活性显著降低，这可能与土壤微生物数量和pH值变化有关。土壤蔗糖酶活性依赖于土壤微生物数量与土壤呼吸强度。有研究表明，土壤蔗糖酶活性与土壤微生物量碳呈显著正相关[34]；而RSD创造的厌氧条件能杀灭好氧微生物，且厌氧菌分解有机物不彻底，在短期内产生大量有机酸，杀灭部分土壤微生物，从而降低土壤微生物多样性以及土壤中可培养放线菌和真菌的数量[35]；另外，土壤蔗糖酶活性会因介质pH降低而增强[32]。因此，RSD处理pH值显著升高极大地抑制了蔗糖酶的活性。
以橘皮为有机物料对土壤进行RSD处理，可显著提高土壤速效养分含量及有机质水平，同时使土壤pH值显著升高。以橘皮为有机物料对土壤进行RSD处理，土壤脲酶与磷酸酶活性显著增强，有利于土壤中养分的转化。以橘皮为有机物料对土壤进行RSD处理，橘皮添加量为0.25%可显著提高土壤碱解氮与速效磷含量，并提高氮磷转化相关酶活性；橘皮添加量为0.50%可显著提高土壤速效钾含量，且pH值明显上升。
综上所述，以橘皮为有机物料对土壤进行RSD处理，多方面综合作用的结果使土壤理化性状显著改善，土壤肥力明显提高，由此可见，采用强还原灭菌技术改良土壤质量时，橘皮资源具有极大的利用潜力。
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