大豆(Glycine max)籽粒中蛋白质含量约40%，为人类提供了约30%的植物蛋白[1]。在我国，基本形成了进口大豆用于榨油、国产大豆用于蛋白食品消费的产业格局。培育高蛋白大豆品种，是满足未来大豆蛋白需求的根本途径[2]。然而，由于大豆蛋白含量是受多基因控制的复杂数量性状，且与产量负相关，依靠常规育种技术培育高蛋白、高产品种难度大[3]。“十二五”以来，东北、黄淮两大大豆主产区少有高蛋白品种(蛋白含量大于45%)通过国家区域试验审定。

野生大豆是提高栽培大豆蛋白质含量的优异基因源[4]。国家农作物种质保存中心保存一年生野生大豆种质资源6 000余份，蛋白质含量较栽培大豆高出5百分点，最高可达到55.4%[5-7]。野生大豆遗传多样性显著高于栽培大豆。一年生野生大豆驯化为栽培大豆地方品种，基因多样性降低50%，稀有等位变异丢失80%，等位基因频率发生显著性改变的基因比例达到60%。现代育成品种与一年生野生大豆相比，核苷酸多态性θ值、π值和单倍性多样性分别降低65%，49%，44%[8]。而且，聚类分析可将栽培大豆和一年生野生大豆分为独立的两组，表明栽培大豆和野生大豆间出现遗传分化[9]。王金陵等[10]从栽培大豆×野生大豆组合后代中获得6个蛋白质含量大于50%的株系；杨光宇等[11]选育出4个蛋白质含量超过50%且产量水平较理想的直立或半直立型株系。

受表型鉴定和基因型鉴定能力的制约，挖掘野生大豆高蛋白优异基因的理论工作滞后于育种实践。在表型鉴定方面，由于野生大豆具有蔓生、匍匐、缠绕等众多不利性状，表型鉴定十分繁琐，费时费力。而且野生大豆籽粒多为黑色，近红外分析不易获得准确地蛋白质含量检测结果，必须依赖于凯氏定氮法检测蛋白质含量[12]。在基因型鉴定方面，特别是大豆基因组测序结果公布之前，基因型检测费用昂贵，因此未见大量野生大豆关联分析报道。目前仅报道3个野生大豆高蛋白QTL，由Diers等[13]在A81-356022×PI468916组合中定位获得。第1个位于15号染色体，与SSR标记Satt411连锁；第2个位于13号染色体，与SSR标记Satt510和Satt335连锁；第3个位于20号染色体，与SSR标记Satt587和Satt239连锁。

随着生物信息技术的发展，美国农业部种质资源信息网(Germplasm Resources Information Network，GRIN)公布了一千余份野生大豆蛋白质含量检测数据(http://www.ars-grin.gov/npgs/searchgrin.html)，同时，Song等[14]公布了上述野生大豆种质资源的SoySNP50K基因芯片数据。本研究旨在利用公共数据库中的表型和基因型数据，通过全基因组关联分析，挖掘与野生大豆高蛋白优异基因紧密连锁的SNP标记，为下一步通过回交将野生大豆高蛋白基因导入栽培大豆育成品种奠定基础，一方面筛选确定用于回交的野生亲本，同时开发可用于辅助选择的分子标记。

1 材料和方法

1.1 参试材料

用于本研究的野生大豆资源共508份，涵盖第4，5，6，7，8熟期组，分别从中国、韩国和日本采集得到[15]。

1.2 基因型和表型数据获取

参试508份野生大豆蛋白含量数据从美国农业部种质资源信息网下载(http://www.ars-grin.gov/npgs/searchgrin.html)。种子收获晾干后，利用凯氏定氮法测量大豆籽粒蛋白质含量。

利用Illumina公司大豆50K芯片(SoySNP50K BeadChip)检测参试材料SNP位点基因型。该芯片中包含位于大豆基因组常染色质区和异染色质区的52 041个SNP位点[14]。SNP基因型数据从SOYBASE网站下载(https：//www.soybase.org/)。删除低频率等位变异小于5%的位点进行SNP基因型质量控制[16]。

1.3 群体遗传结构划分

根据连锁不平衡区段分析，共筛选出7 244个位于不同连锁不平衡区段的SNP位点，进行遗传结构分析。应用STRUCTURE 2.3.4中混合模型和等位变异发生频率非相关模型分析参试材料遗传结构[17]。所设置的STRUCTURE分析群体数(K)为2～7，每个K运行2次。每次运行的burnin time 和重复次数都设置为100 000。LnP(D)和 Evanno’s Δk 2种参数用于确定分组K值，其中，Δk=M[|L(k-1)-2L(k)+L(k+1)|]/s[L(k)]，L(k)表示第k个LnP(D)，M是2次运算的平均值，s是标准差。

1.4 全基因组关联分析

利用TASSEL软件中的混合线性模型(Mixed Linear Model，MLM)进行全基因组关联分析[18]。将某个SNP的-Log(p)>3.0设置为显著性阈值。Kinship值由TASSEL软件估算。

2 结果与分析

2.1 参试材料蛋白含量分布特征

参试508份野生大豆蛋白含量呈正态分布，蛋白含量最小值为38.1%，最大值56.9%，平均48.1%，标准差2.71%(图1)。蛋白含量最集中的范围是48%～50%，共143份，约占参试总材料份数的28.1%，其次为46%～48%，共123份，约占参试总材料份数的24.2%。蛋白质含量低于40%的材料仅有1份，即PI424096，蛋白含量38.1%；蛋白含量超过54%的材料有4份，最高为PI407301，达到56.9%，其他3份材料依次是PI407246、PI407322和PI407232，蛋白含量分别为56.8%，54.6%，54.4%。

2.2 参试材料群体结构特征

对参试材料进行群体遗传结构分析，当分组数(K值)由2增加到7时，后验概率值(LnP(D))由-3 156 285升高到-3 013 257，但未出现明显拐点(图2-A)。当分3组时(K=3)，ΔK获得最大值(图2-B)，因此确定分组数为3(图2-C)。第1组中包括271份材料，蛋白含量最小值38.1%，最大值56.9%，平均为(48.3±2.92)%；第2组中包括111份材料，蛋白含量变化为42.0%～52.7%，平均(47.8±2.31)%；第3组中包括126份材料，蛋白含量42.5%～53.0%，平均(48.1±2.56)%。

2.3 蛋白含量全基因组关联分析

为了对SNP位点进行质量控制，删除低频率等位变异频率小于0.05的SNP后，保留32 049个SNP用于全基因组关联分析。QQ散点图(Quantile-quantile plots)显示(图3)，LOD实际观测值，与无关联位点预期值无明显背离，表明关联分析结果中假阳性比例在可接受范围内。通过全基因组关联分析，共检测到与蛋白含量相关的SNP位点74个，这些位点散布在19条染色体的60个单倍型区段内(表1)。显著性SNP位点LOD平均值为3.47，第1号染色体上的SNP位点BARC_1.01_Gm_01_54656209_A_G的LOD值最大，为5.18。单个显著性SNP位点可解释遗传变异为0.022～0.047，平均为0.027%。可解释遗传变异最大的SNP位点是第19号染色体上的BARC_1.01_Gm_19_36780878_G_T；第17号染色体上的BARC_1.01_Gm_17_7641259_C_T，可解释遗传变异最小。

全部74个显著性SNP位点中，9个富集在第11号染色体常染色质区15 128 832～15 253 199，长度为124 kb的单倍型区段内，文中命名为HAP_11_1。另外4个显著性SNP富集于第12号染色体异染色质区26 842 687～27 818 244，长度为976 kb的单倍型区段内，文中命名为HAP_12_1。在HAP_11_1中，经SNP质量控制后，用于本研究关联分析的SNP位点共30个，LOD值变化为0.01～3.80，平均为1.39，可解释遗传变异变化为0～2.88%，平均为1.00%；其中，9个显著性SNP位点LOD值平均为3.32，可解释遗传变异平均为2.50%；SNP位点BARC_1.01_Gm_11_15167305_G_A的LOD值最大，为3.80，可解释遗传变异为2.88%。在HAP_12_1中，经SNP质量控制后，用于关联分析的SNP位点共9个，LOD值变化介于0.41～4.12，平均为2.27，可解释遗传变异变化在0～3.36%，平均为1.71%；其中，4个显著性SNP位点LOD值平均为3.71，可解释遗传变异平均为2.98%；SNP位点BARC_1.01_Gm_12_27563620_C_T的LOD值最大，为4.12，可解释遗传变异为3.23%。

3 讨论与结论

本研究中发现2个与蛋白含量相关的单倍型区段，HAP_11_1和HAP_12_1。前人利用双亲杂交分离群体在相近位置处发现了与蛋白含量相关的分子标记。在科丰1号×南农1138-2组合中，检测到RFLP标记A520_1与蛋白含量连锁[19]，参照Soymap3 [20]，及大豆物理位置[21]，与HAP_11_1位置重叠，A520_1可解释总遗传变异的5.8%。在豫豆12×ZDD09454组合中，检测到SSR标记Satt469与蛋白含量连锁[22]，与HAP_12_1位置重叠。在OAC Wallace×OAC Glencoe组合中，Satt302与蛋白含量连锁[23]，与HAP_12_1位置重叠。但Hwang等[24]利用300份栽培大豆为材料，进行关联分析时，没有检测到这2个区间与蛋白含量的相关性。这2个区间与蛋白含量的相关性，在本研究中利用野生大豆自然作图群体可检测到，文献报道在部分双亲分离群体中可检测到，而在栽培大豆自然群体中没有检测到。可能原因是这2个区间里调控蛋白含量的基因，在野生大豆中，不同等位变异分布较均匀，而在驯化过程中，部分等位变异被淘汰，成为稀有等位变异，所以能够在特定的双亲分离群体中检测到，而不能在自然群体中检测到[25]，因此挖掘野生大豆优异基因，有可能进一步扩大栽培大豆遗传基础[26]。

大豆基因组中存在大量不同长度、包含不同数量的SNP的单倍型区间[16]。同一单倍型区间内的不同SNP，通常作为一个整体出现，不易发生重组。因此，同一单倍型区间内的不同SNP，应该与特定的性状具有相对一致的相关性。但在本研究中，HAP_11_1和HAP_12_1，均有部分SNP与蛋白含量相关性达不到显著性水平。经分析，次要等位变异基因频率与LOD值呈正相关关系，相关系数81.2%。在次要等位变异频率大于25%的20个SNP中，仅有3个LOD值小于2.5，分别是BARC_1.01_Gm_11_15215338_C_T、BARC_1.01_Gm_12_27170294_C_A和BARC_1.01_Gm_12_27818244_A_G。其中，BARC_1.01_Gm_12_27170294_C_A在分3组后，每组内次要等位变异频率均小于25%。因此，以选择基因型群体为作图群体，可能更容易发觉到重要的稀有等位变异[27]。

这2个区间在驯化和育种选择过程中，经受了不同的选择压力。其中，HAP_11_1区间，野生大豆与地方品种之间的分化系数Fst平均值为0.042，地方品种和育成品种间的分化系数Fst平均值为0.151；HAP_12_1区间，野生大豆与地方品种之间的分化系数Fst平均值为0.759，地方品种和育成品种间的分化系数Fst平均值为0.001 [16]。表明驯化过程造成HAP_12_1区间基因频率显著性改变。由此推论，在挖掘利用这2个区间的蛋白含量优异基因过程中，针对HAP_11_1区间，可以首先尝试在育成品种和地方品种里寻找优异基因；而针对HAP_12_1区间，则有必要回到野生资源里寻找优异基因。其他的品质相关性状经受驯化、选择压力也有类似报道[28]

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Detecting QTL Underlying Wild Soybean Protein Content Through Genome Wide Association Study

GAO Qian1，2，FENG Yan1，YANG Yahua3，ZHAO Qingsong1，LEI Yakun4，LIU Bingqiang1， ZHANG Mengchen1，SHI Xiaolei1，YANG Chunyan1

(1.Institute of Cereal and Oil Crops，Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Shijiazhuang Branch Center of National Center for Soybean Improvement，Huang-Huai-Hai Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，The Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding，Shijiazhuang 050035，China；2.Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050035，China；3.Institute of Coastal Agriculture，Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Tanghai 063202，China；4.Institute of Agricultural Information and Economy，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，China)

Abstract： Wild soybean was useful gene pool for soybean protein content improvement.In order to detect the QTL underlying wild soybean protein content through genome wide association study，508 wild soybean accessions，collected from China，Korea and Japan and covered mature group Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ and Ⅷ，were evaluated for protein content using Kjeldahl method in two years，as well genotyped using Illumina Infinium SoySNP50K BeadChip consisting of 52 041 SNPs in the present study.The phenotypic data was download at Germplasm Resources Information Network and the genotypic data was download at Soybase.As results，the protein content of the wild soybean accessions showed normal distribution，ranging from 38.1% to 56.9%，with the average 48.1%(SD=2.71%).Based on the STRUCTURE analysis，the 508 wild soybean accessions could be divided into three groups.There were 271，111，126 accessions were deposited in 3 groups，respectively.Totally，74 SNPs associated with protein scattered on 19 chromosomes were identified via MLM method.The 74 SNPs belonged to 60 haplotype blocks.The average LOD of the 74 SNPs was 3.47，and BARC_1.01_Gm_01_54656209_A_G yield the highest LOD 5.18.Two genomic regions were considered as the reliable genomic region since they yield more significant SNP in one haplotype block.The first region(named as HAP_11_1)was from 15 128 832 bp to 15 253 199 bp on chromosome 11.BARC_1.01_Gm_11_15167305_G_A was the SNP that yielded highest LOD(3.80)at HAP_11_1，and it explained 2.88% of the phenotypic variation.The second one(named as HAP_12_1)was from 26 842 687 bp to 27 818 244 bp on chromosome 12.The LOD of BARC_1.01_Gm_12_27563620_C_T was 4.12，the highest one at HAP_12_1，and this SNP explained 3.23% of the phenotypic variation.The SNPs discovered in this study were helpful to introduce high protein content related gene from wild soybean to cultivated soybean via MAS.

Key words： Wild soybean;Protein content;GWAS;SNP;Haplotype

收稿日期：2021-09-22

基金项目：国家自然科学基金项目(31871652)；河北省重点研发计划现代种业科技专项(19226356D)；河北省高层次人才资助项目(A201802010)；河北省农林科学院基本科研业务费项目(2018060301)；河北省农林科学院创新工程项目(2019-4-3-1)；国家大豆产业技术体系(CARS-04)；河北省现代种业科技创新专项(21326313D)

作者简介：高 倩(1982-)，女，河北平山人，副研究员，硕士，主要从事农业信息数据挖掘研究。高倩、冯燕为同等贡献作者。

通讯作者：

史晓蕾(1979-)，女，河北宁晋人，副研究员，博士，主要从事大豆遗传育种研究。

杨春燕(1966-)，女，黑龙江密山人，研究员，硕士，主要从事大豆种质资源研究。

中图分类号：S565.03

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2021)增刊-0023-08

doi：10.7668/hbnxb.20192274