植物中谷氧还蛋白研究进展

植物在其生长发育过程中会遭受到各种各样的逆境胁迫，其中包括了生物胁迫和非生物胁迫。然而，植物在亿万年的演变中已经进化出多重防御体系来响应不同的逆境胁迫。通常植物在遭受胁迫早期时，最直接的反应就是活性氧(Reactive oxygen species，ROS)爆发。研究表明，ROS作为重要的信号分子，在植物的各个生物学过程中都起到一定作用，尤其是在植物抗逆过程中起到了很关键的作用[1]。

通常植物体内的ROS代谢处于动态平衡，然而当植物处于逆境时，ROS浓度会发生爆发。植物体内的ROS具有双重作用，低浓度时会作为第二信使把信号传导出去，激活一系列防御反应，而高浓度的ROS会对植物细胞造成氧化胁迫，帮助植物杀死受损伤或受病菌侵染的细胞或细胞器以保证其他健康细胞的正常生长发育，但同时对于正常的细胞也具有一定毒害作用。这时候，植物为了避免由于过多的ROS引起的自身体内核酸和蛋白质等生物大分子的降解、失活以及细胞内质膜、叶绿体、线粒体等各种组分的过度氧化损伤，甚至导致细胞死亡的情况发生，在长期的进化中形成了多种抗氧化系统来维持和平衡植物细胞内蛋白质的氧化还原状态。植物体内氧化还原系统主要由抗坏血酸谷胱甘肽循环系统(Ascorbic acid glutathione circulatory system)、硫氧还蛋白系统(Thioredoxin system)和谷氧还蛋白系统(Glutaredoxin system)等构成。抗坏血酸谷胱甘肽循环系统在植物调控氧化还原状态中的作用较为重要，除此之外还可以通过另外2个系统调节巯基的氧化还原状态，从而调控植物氧化还原状态的平衡。硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白(Thioredoxin，TRX)、还原型辅酶Ⅱ(Triphosphopyridine nucleotide，NADPH)和硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TR)，谷氧还蛋白系统主要包括 NADPH、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)、谷氧还蛋白(Glutaredoxins，GRX)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)[2-3]。

GRX广泛存在于生物体中，属于TRXs超家族，具有巯基转移酶的活性。在GSH存在条件下，GRX催化底物蛋白二硫键的还原，可通过单巯基或者双巯基机制来实现，反应中生成的GSSG可通过NADPH依赖的谷胱甘肽还原酶系统重新生成GSH。目前，GRX在人体以及动物中研究较多且更深入，然而在植物中的研究相对较少，随着研究的逐渐深入，GRX被发现参与了植物细胞生命活动的诸多进程，GRX通常被认为在植物发育调控、合成DNA、信号转导以及植物响应逆境胁迫中发挥作用。本研究将着重对GRX的命名、分类、作用机制以及功能进行阐述。

1 谷氧还蛋白的命名及分类

1976年，Holmgren等发现谷氧还蛋白可恢复大肠杆菌硫氧还蛋白(TRX)突变体的生长发育。GRX最开始被认为是核糖核酸还原酶(Ribonucleotidereductase，RNR)的电子供体。在这之后，GRX逐渐在大肠杆菌、酵母、哺乳动物及植物中有所研究。随着GRX的不断发现和克隆，其种类和数量开始不断增加，就需要对GRX进行统一规范的命名，植物中对于GRX的命名通常是基于其序列活性位点基序(CxxC或CxxS)第4位的半胱氨酸(Cys)或丝氨酸(Ser)。根据对先前拟南芥基因组进行的分析，鉴定出了14个具有CxxC活性位点的GRX和17个具有CxxS活性位点的GRX。因此，这些蛋白质分别被命名为GRXC1-C14和GRXS1-S17[4]。

GRX根据活性位点的氨基酸保守序列，可以划分为3个主要类型：CPYC型、CGFS型以及CC型[5]。其中前2个类型为真核生物所共有，而CC型为陆生植物所特有[6-8]。

Ⅰ类为CPYC型，即活性位点为C[P/G/S][Y/F][C/S]基序，该类型GRX是经典的双巯基GRX，大肠杆菌GRXC1和GRXC3、酵母GRXC1和GRXC2以及哺乳动物GRXC1和GRXC2都属于这一类，拟南芥中主要包括GRXC1、GRXC2、GRXC3、GRXC4、GRXC5和GRXS12。

Ⅱ类为CGFS型，该类型为单巯基GRX，具有严格保守的CGFS活性位点序列，包括了与酵母GRXC3、GRXC4和GRXC5以及大肠杆菌GRXC4同源的GRX。越来越多的证据表明，单巯基GRX可能在线粒体铁硫簇的组装、细胞毒素解毒、细胞生长和增殖、铁稳态调节、Ca2+信号转导、蛋白激酶C(PKC)介导的应激反应和蛋白质氧化保护中发挥作用[9-11]。植物在这一组中通常有4个不同的成员(GRXS14～GRXS17)，预测GRXS17定位于胞浆/细胞核，GRXS14和GRXS16定位于叶绿体、GRXS15定位在线粒体。其中GRXS14、GRXS15以及GRXS16的定位已得到试验证实。GRXS14和GRXS15是小分子蛋白(约170个氨基酸)，具有GRX模块的单一重复序列，GRXS16较大(约290个氨基酸)，GRXS17在N端部分有一个类似TRX的模块，根据生物体的不同，有2到3个GRX结构域[12]。

Ⅲ类活性位点为CC[M/L][C/S/G/A/I]。其中GRXC7、GRXC9和GRXS10属于这一类。就目前为止，Ⅲ类仅限陆地植物，它在低光合生物中不存在，在细菌和哺乳动物中也不存在。对于大多数CC型GRX亚细胞定位的预测表明是胞浆型，一些Ⅰ类的GRX也是如此，到目前为止尚未研究的其他CC型家庭成员被命名为ROXY2～ROXY21[13]。

在拟南芥中鉴定出的31个GRX基因中，有21个属于CC型。在进化信息丰富的植物物种中对GRX亚型组成的比较表明，在陆地植物的进化过程中，只有CC型类别的规模扩大了，表明这些GRX可能已经更多地参与高等陆地植物进化[14]。此外，还有一类在拟南芥和水稻中活性位点不那么保守的GRX，被称为GRX-Like(GRL)[15]。表1为部分不同亚型GRX的活性位点、亚细胞定位及功能统计的情况。

其中，除上述提到的GRXC1、GRXS12、GRXS14、GRXS15以及GRXS16的定位被证实外，其他GRX的定位是基于预测的结果得到的。

2 谷氧还蛋白的结构

目前，植物中只有杨树GRXC1和GRXC4 2个GRX结构被确定[19-20]。从核磁共振的结果来看，具有CPYC活性中心的GRXC4展示出典型的硫氧还蛋白(TRX)折叠，它在单体和二聚体之间处于平衡状态；自缔合表面包括活性中心和GSH结合位点。在二聚体中，这个结构构建了一个小的没有被活性位点的侧链封闭的自由空间，它可以容纳辅基的存在，如铁硫簇。这一观察结果被后来杨树的GRXC1(活性位点CGYC)二聚体在其活性位点周围架起一个铁硫簇(ISC)所证实。这2种GRX在单体和二聚体之间转换。在GRXC4中，单体以头到尾的方向排列，而在GRXC1中，它们呈镜像构象，2个亚基由[2Fe-2S]簇桥接。在GRXC4中，活性部位脯氨酸残基的侧链(在GRXC1中被甘氨酸取代)可能阻止了铁硫簇的结合[12]。

3 谷氧还蛋白的作用机制

GRX能在谷胱甘肽分子的帮助下还原二硫键或蛋白质谷胱甘肽结合物，GRX分为单巯基和双巯基2种，由于GRX的作用机制与其具有的巯基数量相关，因此，也有2种作用机制[12]。

在单巯基的GRX反应中，通常只需要一个活性位点半胱氨酸来减少目标蛋白(P)和谷胱甘肽之间的混合二硫化物，从而使GRX和GSH之间形成混合二硫键，并产生GSSG(Oxidized glutathione)，而GSSG的后续转化需通过GR来完成，谷胱甘肽化的GRX形式由另一个谷胱甘肽分子再生。

另外一种双巯基GRX，氧化态时2个Cys残基的巯基均以分子内二硫键形式连接。在双巯基GRX的作用机制中，需要在2个活性位点半胱氨酸之间形成分子内二硫键，随后还可被还原型谷胱甘肽(GSH)还原，这类似于TRX所采用的机制[12]。

4 谷氧还蛋白的功能

GRX之前被定义为氧化还原调节剂。然而，新的研究表明，GRX家族成员可能参与了更多的生物学过程。虽然GRX家族的蛋白核心结构相似，但定位和表达的差异及在物种和个体之间的差异体现了其功能的多样化。有证据表明，不同植物的GRX具有不同的功能，包括参与生长发育、氧化应激反应、胁迫反应、氮反应、铁硫簇组装等。

4.1 参与生长发育

在鉴定roxy1突变体后，在拟南芥中首次描述了GRX在植物发育中的作用，该突变体表现出花瓣原基数减少和异常[21]。ROXY1基因被发现编码Ⅲ类CC型GRX。另一个GRX基因ROXY2的功能被发现与ROXY1部分重叠。单个roxy2突变体没有表现出明显的变化，但是，roxy-1-roxy2双突变体是不育的。研究表明，ROXY1和ROXY2也有重叠的组织表达模式，ROXY1和ROXY2的缺失会影响大量花药基因的表达[22]。

拟南芥AtGRXS17在植物响应铁缺乏胁迫和维持氧化还原稳态的能力中起着至关重要的作用。AtGRXS17能够抑制酵母ScGrx3/ScGrx4突变细胞中铁的积累。遗传分析表明，AtGRXS17表达降低的植株对铁缺乏非常敏感，并显示出成熟种子中铁的含量增加。AtGRXS17的缺乏会引起植物对外源氧化剂的敏感性，并在缺铁条件下增加了ROS的产生。添加还原型谷胱甘肽可以恢复生长，并减轻atgrxs17突变体对铁缺乏的敏感性。这些发现表明，AtGRXS17有助于整合氧化还原稳态和铁缺乏反应[23]。

GRXS17也参与植物的发育。尤其是在高温条件下，在拟南芥grxs17突变体中，植物生长素的敏感性和生长素极性运输都受到干扰，从而导致细胞增殖和细胞周期控制受影响[24]。除此之外，grxs17突变体表现出更小的茎尖分生组织和延迟抽薹，这可能与温度和光周期信号的去调控有关[25]。

OsGRXC2.2的过表达干扰了水稻的正常胚胎发生，并导致谷物重量增加[26]。

以上试验结果证明，在拟南芥或者其他植物中，GRX在植物发育中起着关键作用。因此，操纵GRX有可能为作物引入理想的性状。

4.2 参与生物胁迫反应

植物对胁迫反应的一个共同特征是ROS的产生，ROS改变了细胞的氧化还原稳态并产生氧化胁迫。ROS是引发胁迫反应的重要信号分子，但高浓度的ROS在植物细胞中积累会引起毒害作用，例如诱导对脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。GRX被证明在氧化应激反应中起抗氧化作用。GRX能有效地催化蛋白质的S-脱乙酰基化[27]，也能催化蛋白质的S-谷胱甘肽化，谷胱甘肽化可以保护蛋白质的巯基不可逆失活，谷胱甘肽化被认为是在氧化应激期间保护敏感的巯基并通过GSH/GSSG比调节受影响的蛋白的活性而充当氧化还原信号网络的组成部分[5]，因此，GRX成为控制这种蛋白质修饰的关键因子，通过它们的二硫化物氧化还原酶活性，GRX还原和恢复对H2O2解毒的PRXs等酶，在氧化还原信号和间接清除ROS方面发挥作用。

此外，据报道，GRX能够直接减少H2O2和脱氢抗坏血酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)，增强细胞清除活性氧的能力[ 28-29]。

拟南芥GRXS13基因编码2个CC型GRX亚型。有趣的是，研究表明，敲除GRXS13基因会产生超氧自由基解毒功能缺陷的表型。这种缺陷可在基础条件下观察到，也可在甲基紫精(Methylviologen，MeV)处理和强光照射引起的光氧化应激下观察到。GRXS13.2的过度表达，是一种主要在基础条件下表达并由光氧化应激诱导的基因突变体，增强了对ASA(Ascorbate)/DHA比值增加相关的应激性损伤的保护作用。总之，这些结果表明，GRXS13基因的表达对于限制基础和光氧化应激诱导的ROS产生至关重要，对于保护拟南芥细胞免受氧化损伤至关重要[30]。分别定位于叶绿体和线粒体中的GRXS14和GRXS15参与了H2O2处理产生的蛋白质氧化损伤的保护。

此外，在拟南芥中GRXS17还参与植物对中度高温的耐受性，并保护根分生组织细胞免受热诱导的细胞死亡[31]。

在另外对水稻的研究中表明，GRXS15定位于线粒体和细胞核中，其转录是由白叶枯菌诱导的。组成型表达OsGRXS15的转基因水稻品系显示出对白叶枯菌和镰刀菌的抗病性增强，而基于CRISPR/Cas9的敲除突变体与野生型植株相比，抗性降低。在超表达OsGRXS15的植株中显著诱导了与病程相关(PR)基因的转录。水稻转录因子OsWRKY65被鉴定为结合伴侣，并直接与细胞核中的OsGRXS15相互作用。此外，发现OsGRXS15和OsWRKY65的相互作用导致OsPR1的上调[32]。

OsGRX20蛋白虽然定位于细胞核和胞质溶胶中，但其转录本主要在叶片中表达。试验数据表明，在感染白叶枯病菌后，OsGRX20在抗性水稻品种的叶片中的表达水平明显高于敏感品种。OsGRX20在敏感品种中的过表达显著增强了其对白叶枯病的抵抗力。相反，抗性品种OsGRX20的RNAi植株导致其对白叶枯病的敏感性增加。这表明，OsGRX20在水稻对生物胁迫的耐受性中起正调控作用，对于水稻抗病性的遗传改良具有重要意义[33]。

在草莓抗白粉病的研究中发现，FaGRXC9基因响应白粉病的侵染，在侵染后变化明显[34]。

在对番茄GRX的研究中发现，GRXS16可以介导油菜素类固醇(Brassinosteroids，BRs)诱导的质外体H2O2产生，促进番茄中的农药代谢。GRXS16在维持谷胱甘肽稳态和调节谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase，GST)活性方面起着重要作用。GRXS16在BRs诱导的质外体ROS的下游起作用，并通过介导氧化还原信号参与CHT(百菌清，一种广谱非系统性杀菌剂)代谢[35]。

此外，在香蕉中的研究也显示出MaGRX6/7/9/11/17/23/28和MaGRL3/16/19可能在调节果实成熟或响应低温和高温或枯萎镰孢菌感染中起重要作用[36]。

有试验证明，具有保守的ALWL基序的CC型GRX，如ROXY18和ROXY19，在病原体侵袭时被诱导，可能参与防御基因的调控[37]。

4.3 参与非生物胁迫反应

在三叶金牛座(Reaumuria trigyna)中，RtGRL1的过表达可以诱导非生物胁迫下谷胱甘肽生物合成和脯氨酸含量增加相关基因的表达，并且提高了植物对活性氧(H2O2)的谷胱甘肽依赖性排毒的能力，维持了谷胱甘肽池平衡，降低叶片Na+含量，并增加保水能力[38]。

研究显示，GRX参与植物抵抗重金属胁迫的反应。在对砷处理后的旱稻转录组分析表明，GRX等的基因大部分被下调，这个试验显示出了在旱稻中，GRX对砷胁迫的响应[39]。

在拟南芥中，AtGRXS15也显示其具有砷耐受性[40]。转基因拟南芥中OsGRXC7和OsGRXC2.1的过量表达增加了砷耐受性。转基因OsGRXC7和OsGRXC2.1的拟南芥表现出维持细胞内的谷胱甘肽库，参与降低砷的积累。总的来说，OsGRXC7和OsGRXC2.1可能代表参与砷胁迫反应的GRX家族蛋白，并且可更好地理解砷诱导的胁迫途径，设计用于提高砷胁迫耐受性以及降低作物中砷含量的策略[41]。

鹰嘴豆中的GRX(CaGRX)通过在拟南芥中过表达，减少金属积累并改善抗氧化防御系统以此提供对重金属的耐受性[42]。

此外，GRX还被证明参与干旱胁迫。玉米ZmGRXCC上游区域共鉴定出21种主要调控元件，其中发现了可能对干旱胁迫和/或ABA激素信号产生响应的几种基序。值得注意的是，大多数ZmGRXCC基因启动子都包含ABRE基序。ABRE是涉及ABA诱导的基因表达顺式元件，并且发现它需要偶联元件(CE)才能实现ABA诱导。该研究发现12个ZmGRXCC启动子同时包含ABRE以及CE3基序，表明这些基因可能在ABA介导的干旱信号通路中起作用[43]。更重要的是，在21个ZmGRXCC启动子中，有17个包含JA响应元件，意味着这些基因也可能参与了茉莉酸信号通路。综上所述，ZmGRXCC基因响应干旱胁迫的机制可能是通过ABA和/或JA介导的途径。重要的是，ZmGRXCC14和ZmGRXCC17的水稻直系同源基因也被植物激素和非生物胁迫诱导，表明这些基因可能是玉米抗旱的关键介体。

对木薯中GRX的研究表明，MeGRX785基因在木薯中过表达的植株对干旱更加敏感，而MeGRX785基因的RNAi植株抗旱能力更强。然而在木薯中另一个GRX基因MeGRX058表现出的结论却正好相反，MeGRX058基因过表达的木薯植株抗旱能力更强，而RNAi植株表现出对干旱更为敏感的症状[44]。另外，通过对OsGRX17进一步研究表明，沉默OsGRX17后的植株保卫细胞内H2O2的产生增加，对ABA的敏感性增加，气孔孔径减小。这一发现显示出OsGRX17与气孔关闭之间的深刻联系，有助于增强植物对干旱反应机制的进一步理解[45]。

有趣的是，Ⅲ这类GRXs在被子植物中具有特殊的CCxx活性位点，对于耐受胁迫也可能很重要。OsGRX8(CC型水稻GRX基因)的过表达提高了拟南芥对盐和渗透胁迫的耐受性。此外，OsGRX8沉默的水稻植株对多种胁迫表现出更高的敏感性。同样，在超表达OsGRX8的拟南芥中大量与胁迫相关的基因显示出表达水平的改变。编码2个CC型GRX亚型的AtGRXS13在光氧化胁迫耐受性中也发挥着作用。AtGRXS13.2的过表达表明其对强光的耐受性增强，表明AtGRXS13对于限制光氧化损伤至关重要[46]。

有研究发现，GRX10被磷酸化后可以调节谷胱甘肽活性，进而增强水稻耐冷性[47-48]。

4.4 参与氮代谢

在拟南芥中，有研究表明Ⅲ类GRX还参与了植物氮代谢。绝大部分的Ⅲ类GRX的转录受硝酸盐的调节。其中11个成员被硝酸盐上调，6个成员被硝酸盐下调。受硝酸盐抑制的3个GRX基因AtGRXS11(ROXY6/CEPD1)、AtGRXC13(ROXY9/CEPD2)和AtGRXC14(ROXY8/CEPDL2)编码的蛋白质充当氮饥饿的移动信号，从缺氮植物的茎部移动到根部，并激活高亲和力的硝酸盐转运蛋白。

研究发现，AtGRXS8对根部的硝酸盐信号具有负调节作用，在过表达AtGRXS8的植物中，硝酸盐吸收和运输受到损害[49]，并且证明AtGRXS8蛋白可以与TGA1和TGA4转录因子发生物理相互作用[50]。

4.5 在铁硫簇组装中的作用

植物的叶绿体和线粒体需要大量的铁(Fe)。充足的Fe可以确保植物呼吸作用、光合作用的正常运行。

GRX和BolA蛋白之间的相互作用在酵母、人类和植物中是保守的。在所有这些真核生物中，已证明GRX和BolA结构域是通过[2Fe-2S]簇的结合而桥接的[51]。GRXS17也可以不依赖与BolA2相互作用结合Fe-S簇，通过形成Fe-S桥接同二聚体，并且它可以促进细胞质 Fe-S 酶的活性[52]。

研究表明，在植物中，Fe-S簇作为电子载体对光合作用、呼吸作用至关重要。此外，Fe-S簇是许多Fe-S蛋白质的一个修复组分，这些蛋白质在不同的细胞过程中发挥调节作用，例如对氧化应激的反应。再有，在Fe-S蛋白组装途径中显示缺陷的突变体表现出配子体转录调控和营养组织中非生物胁迫反应的异常。重组AtGRXS15能够调节和转运Fe-S蛋白，其过程依赖于还原型GSH[53-54]。在相关植物蛋白的晶体结构上对AtGRXS15进行的建模显示了对Fe-S簇配位至关重要的氨基酸残基。例如，乌头酸酶是一种重要的含铁硫簇的酶，而AtGRXS15中的K83/A突变会导致发育的严重迟缓以及乌头酸酶活性的显著降低。这项研究阐明了线粒体AtGRXS15在铁硫蛋白成熟过程中的关键作用，并证明了AtGRXS15是植物发育过程中的一种重要蛋白质。

AtGRXS16在其C-末端结构域(CTD)上存在一个与AtGRXS14和AtGRXS15结构类似的保守的GRX结构域，同时还存在一个推测的带有GIY-YIG核酸内切酶基序的N-末端结构域(NTD)，而其他已知的GRX则缺少这个结构域。这些功能域通过形成分子内二硫键而进行负调控。这种分子内连接对氧化应激条件下AtGRXS16的核酸内切酶和GRX活性(包括铁硫簇结合)产生抑制作用。一部分AtGRXS16以二聚体的形式存在，与单体形式相比，NTDs具有更高的DNA切割效率。AtGRX16NTD具有切割叶绿体DNA的核酸酶活性，这表明AtGRX16参与了DNA损伤修复。光合作用是一个ROS高产的过程，这种含有GIY-YIG基序的核酸内切酶可能有助于介导DNA修复和促进叶绿体基因组的稳定性[55]。

5 展望

植物在其生命周期中会受到来自外界各种逆境的胁迫，既包括极端温度(高温或者低温)、高盐和干旱，又包括了各种致病菌和虫害。为寻找出有效且广谱的抵抗逆境胁迫的物质，笔者致力于探究不同物种面对各种逆境的种种机制并利用基因工程等技术加以利用，使植物能够更好地抵抗逆境。一些GRX家族成员被报道在植物中具有多种功能。例如，AtGRXS17在生长素信号传导、分生组织发育、耐热和低温胁迫耐受中发挥作用，PvGRX5调节耐热和砷耐受，AtGRXS13在病原体和光氧化应激反应中发挥作用。这些研究证明或者有理由推测GRX在植物抵抗逆境胁迫中所起的重要作用。还需要通过基因组/蛋白质组学等多种技术手段来确认GRX在植物生长、铁稳态以及胁迫反应中的作用。此外，还需要了解GRX在细胞核中的作用，特别是确定它们的相互作用因子，如转录因子。只有更多地了解GRX的作用机制和功能，才能更好地利用它们。

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