水稻(Oryza sativa)是人类赖以生存的重要粮食作物。由子囊真菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(Rice blast)，是水稻生产中的主要病害，全球至少有80个国家报道了稻瘟病的发生[1]，近年来我国稻瘟病年发生面积约500万hm2[2]。稻瘟病危害不仅减产，而且防治稻瘟病大量使用杀菌剂也增加了水稻的生产成本，同时破坏水土生态环境。因此，利用已鉴定的抗性基因培育推广抗病水稻品种，是防控稻瘟病最经济有效和绿色环保的对策。广谱持久抗稻瘟病基因Pi9来源于小粒野生稻(Oryza minuta)，经远缘杂交导入到籼稻品系75-1-127，之后被精细定位到水稻6号染色体的Pi2/9位点，并被成功克隆[3-4]。而分子标记辅助选择育种的选择效率高、操作较简单、相对成本较低，通过筛选还能获得农艺性状、产量和品质性状都比较优良的后代，因此，尤其备受育种家们青睐。目前，Pi9基因已被广泛应用于水稻稻瘟病抗性改良的育种实践，如李永聪等[5]利用Pi9基因通过MAS回交育种改良水稻恢复系R389的稻瘟病抗性。本研究以75-1-127为Pi9基因供体，先后用三系保持系丰源B及其不育系丰源A为受体亲本，利用Pi9基因内特异功能标记，通过分子标记辅助选择(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)，定向改良丰源A及其保持系丰源B的稻瘟病抗性。
1 材料和方法
1.1 试验材料
水稻材料：籼稻品系75-1-127，Pi9基因供体；三系不育系丰源A及其保持系丰源B，Pi9基因受体；水稻品系CO39，稻瘟病感病对照。
稻瘟菌：33份来自国内外的稻瘟菌菌株，用于抗菌谱分析。
1.2 试验方法
1.2.1 稻瘟病抗性表型鉴定与抗菌谱分析 稻瘟病室内人工接种：分别用33份稻瘟菌菌株接种丰源B、丰源A、75-1-127和CO39，调查苗瘟抗性表型、分析抗菌谱。接种方法及抗性分级分类标准参考廖花等[6]的方法，用33份国内外不同稻区的稻瘟菌菌株，人工气候室内接种丰源A、丰源B和75-1-127，并以CO39作感病对照。在人工气候室内用塑料育苗盘播种供试水稻材料，温度控制在 26～28 ℃，待水稻苗长至3叶1心时期，用 0.025%的Tween20水溶液将稻瘟菌分生孢子配制成密度约为1×105个/mL的单菌株孢子悬浮液进行喷雾接种。先在避光、保湿、26 ℃条件下培养 24 h；然后在12 h光照、高湿条件下诱导发病 5～6 d,调查发病情况。其中0～2级划为抗病类型，3～5级划为感病类型。
田间病圃苗瘟鉴定：参考廖花等[6]的方法，试验于2020年5月中旬，将供试水稻材料播种于湖南浏阳大围山稻瘟病病圃，6月13日调查苗瘟抗性，鉴定筛选优异抗病纯系。供试水稻材料包括亲本、改良保持系和改良不育系，用CO39作诱发品种和感病对照。
1.2.2 标记基因型分析 PCR模板DNA提取：用2 mL灭菌离心管取候选水稻单株小分蘖叶片约0.2 g，液氮研磨后CTAB法提取总DNA[7]。具体操作步骤如下：将所取叶片用液氮速冻后研磨成粉，加入预热至65 ℃左右的600 μL CTAB混合液，摇匀后65 ℃温浴30 min。再加入600 μL氯仿，并放入离心机中以12 000 r/min转速离心10 min，取上清液转移至加有600 μL异丙醇的1.5 mL离心管中，随后放到-20 ℃冰箱冷藏20 min，12 000 r/min转速离心机中离心10 min后倒掉上清液，加入75%乙醇600 μL，离心洗涤2次。最后置于超净台上吹干或者静置2～3 h风干后，用100 μL蒸馏水溶解，藏于-20 ℃保存备用。
标记基因型鉴定：用本团队开发的InDel共显性专利标记ClonDF1R1，鉴定各单株标记基因型。PCR体系(10.0 μL)：模板DNA 1.0 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR热循环参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
1.2.3 分子标记辅助选择育种实践 用丰源B作母本及轮回亲本，75-1-127作父本，2009-2015年在长沙和三亚两地开展分子标记辅助选择连续回交育种，用ClonDF1R1(F：5′-ATCCACGAAACATCCACC
ATCC-3′；R：5′-GATTCGACAGATGGTGCAACA-3′)标记基因型做Pi9基因前景选择，用田间主要农艺产量性状代替单株基因组背景选择，于2015年夏季获得性状整齐稳定、高抗稻瘟病的BC6F4群体(株系)。2016年起，用丰源A作母本，用优异改良丰源B保持系作父本及轮回亲本，结合分子标记辅助选择，于2019年获得稳定的BC5F1群体，2020年经稻瘟病抗性、田间农艺产量性状和不育特性鉴定分析，育成优异改良抗病丰源A不育系。
1.2.4 不育系不育特性调查 参考田芳慧等[8]的方法，观察调查丰源A和改良丰源A的不育特性：
柱头外露率：不育系抽穗扬花结束后，随机选取30穗，调查总颖花数和柱头外露颖花数(包括单边外露和双边外露)，计算柱头外露率。柱头单边外露率=柱头单边外露颖花数÷总颖花数×100%;柱头双边外露率=柱头双边外露颖花数÷总颖花数×100%；柱头总外露率=柱头单边外露率+柱头双边外露率。
自交结实率：不育系孕穗末期，随机取10株用羊皮纸袋套袋，15 d后调查不育株率自交结实率。不育株率=不育株数÷30×100%；自交结实率=总结实粒数÷总颖花数×100%。
花粉镜检：不育系开花盛期，随机取10个稻穗的混合花粉，1%I2-KI染色后镜检，观察花粉育性及败育类型。无花粉粒的即为无花粉型；有花粉粒的每个镜片观测3～5个视野，观测花粉粒300个以上，观察分析花粉育性及花粉粒类型，并计算花粉败育度。圆形蓝黑色的为正常花粉粒；圆形不染色的为圆败花粉粒，形状不规则且不染色的为典败花粉粒，两者均为败育花粉粒。
1.2.5 农艺产量性状调查 调查丰源B、丰源A、改良丰源B和改良丰源A群体的播始历期；每材料随机取10株，调查株高和有效穗数，以及主穗总颖花数、剑叶长和剑叶宽，计算相应平均值，记载标准参考应存山[9]：播始历期是计算水稻从播种到长出始穗的天数；株高是测量从泥面至上部最长叶尖的长度；有效穗数是计算每株的单穗实粒数不少于10粒的稻穗；主穗总颖花数是指计数每株主穗的颖花总数；剑叶长是测量剑叶从叶枕到叶尖的长度，而剑叶宽则是测量剑叶最宽处的宽度。
2 结果与分析
2.1 供试亲本材料的苗瘟抗性表型及抗菌谱
33份供试稻瘟菌菌株室内接种亲本材料的抗性表型及抗菌谱结果见表1。Pi9基因供体亲本75-1-127对日本菌株KOH、韩国菌株ROR1、中国菌株95097AZC13和X2007A-7 表现感病，对其余29份菌株表现抗病，抗性频率为87.9%。丰源B和丰源A对11份菌株表现抗病(CHL438、CHL440、CHL473、87-4、110-2、195-2-2、RB14、M2006123A1、CHNOS60-2-3、KOH、KJ105)，而对其余22份菌株表现感病，抗性频率为33.3%。2个受体亲本的抗性表型和抗菌谱非常吻合，说明这2个材料的稻瘟病抗性受细胞核基因控制、且两者核背景一致。有趣的是，4份对75-1-127致病菌株中的3份(X2007A-7、95097AZC13和ROR1)，对丰源B和丰源A也是致病的，但KOH对后者不致病，即供体亲本和受体亲本间存在交叉抗菌谱。感病对照CO39对33份供试菌株都表现感病。另一方面，田间病圃苗瘟抗性鉴定结果表明，75-1-127 表现高度抗病，而丰源B 和丰源A均高度感病(图1)。以上结果表明，Pi9基因的稻瘟病抗性水平高抗菌谱较广，并且与2个受体亲本间存在交叉抗谱，可望通过MAS育种实践，培育出抗性更好的新不育系及其保持系。
表1 亲本材料稻瘟病抗性及抗菌谱
Tab.1 Resistance and resistance spectrum of parental materials to 33 tested M.oryzae isolates
菌株Isolates来源Origin75-1-127CO39(CK)丰源BFengyuan B丰源 AFengyuan A菌株Isolates来源Origin75-1-127CO39(CK)丰源BFengyuan B丰源 AFengyuan ACHL329湖南RSSSCHL1743广东RSSSCHL438湖南RSRRRB4广东RSSSCHL440湖南RSRRRB5广东RSSSCHL446湖南RSSSRB6广东RSSSCHL471湖南RSSSCHL506福建RSSSCHL473湖南RSRRM2006123A1福建RSRRX2007A-1湖南RSSSRB20福建RSSS87-4湖南RSRRE2007046A2湖北RSSS110-2湖南RSRRCHNOS60-2-3中国RSRR193-1-1湖南RSSS95097AZC13中国SSSS195-2-2湖南RSRRKOH日本SSRR318-2湖南RSSSROR1韩国SSSSRB14湖南RSRRKJ201韩国RSSSX2007A-7湖南SSSSKJ105韩国RSRR236-1湖南RSSSGUY11法国RSSS236-2湖南RSSSES6西班牙RSSSCHL645贵州RSSS抗性频率/% Resistance frequency87.90.033.333.3
注：R、S分别表示抗病和感病。
Note：R，S mean resistant and susceptible respectively.
2.2 ClonDF1R1标记辅助选择育成抗病不育系丰源A-Pi9-5
根据Pi9基因序列信息开发了1个共显性InDel标记ClonDF1R1。该标记从75-1-127基因组中扩增出一条320 bp的亮带，而对丰源B和丰源A基因组的扩增产物大小均为450 bp左右(图2)。利用ClonDF1R1开展连续多年的MAS育种实践，于2015年夏季获得性状整齐稳定、高抗稻瘟病的丰源B改良BC6F4群体(株系)17个，综合各改良株系的农艺产量性状，筛选出1个稳定的优异抗病系丰源B-Pi9-5(图1，2)。在此基础上，用丰源B-Pi9-5与丰源A杂交并连续回交，经ClonDF1R1标记基因型鉴定，于2019年夏季获得农艺和遗传性状稳定的BC5F1群体(系)，2020年经病圃苗瘟抗性鉴定和农艺产量性状及不育特性调查分析，育成丰源B-Pi9-5的改良抗病不育系丰源A-Pi9-5(图1，2)。
图1 改良抗病不育系及其保持系的病圃苗瘟抗性
Fig.1 Seedling blast resistance of improved sterile line and its maintainer in nursery
A.ClonDF1R1的标记基因型；M.DNA ladder；1.75-1-127；2.丰源B；
3.丰源A；4-12.丰源B-Pi9-5的随机单株；13-24.丰源A-Pi9-5的随机单株；B.苗瘟抗性表型；R.抗病；S.感病。
A.Genotype of ClonDF1R1；M.DNA ladder;1.75-1-127；2.Fengyuan B；3.Fengyuan A；4-12.Randomly sampled plants from
Fengyuan B-Pi9-5；13-24.Randomly sampled plants from Fengyuan A-Pi9-5；B.Seedling blast resistance；R.Resistant;S.Susceptible .
图2 改良抗病不育系及其保持系的标记基因型鉴定
Fig.2 Marker genotype identification of improved resistant sterile line and its maintainer
2.3 丰源A-Pi9-5不育特性
本试验结果表明，丰源A-Pi9-5与对照丰源A的不育株率均为100%，套袋自交结实率均为0；丰源A-Pi9-5的柱头外露率为65.6%，与对照丰源A非常相近(67.1%)；2个不育系的花药大小颜色非常相似，短小呈浅白色；花粉镜检表明，2个不育系花粉粒少，且均以典败为主，碘染率均为0。相应地，2个保持系丰源B-Pi9-5和丰源B田间结实正常，花粉育性正常(图3)。可见，改良抗病不育系丰源A-Pi9-5不育性稳定彻底，异交习性好，为实现三系配套应用打下了基础。
图3 不育系和保持系花粉育性镜检鉴定
Fig.3 Pollen fertility microscoping of sterile lines and maintainers by I2-KI
2.4 改良抗病不育系及其保持系主要农艺产量性状
主要农艺及产量性状的调查结果见表2。丰源A-Pi9-5及其保持系丰源B-Pi9-5的播始历期为86 d，比受体不育系丰源A及其保持系丰源B长2～3 d。改良不育系及其保持系的株高比相应对照略有降低，但还是有90 cm左右、稍微偏高。两组材料的叶形整体相似，叶片上举。此外，丰源A-Pi9-5和丰源B-Pi9-5的田间株形紧凑。产量性状方面，两组材料的单株有效穗数和主穗长都很接近；而改良不育系(保持系)的单穗颖花数，比受体不育系(保持系)增加较明显。可见，经过多年多代连续回交，两组材料在主要农艺性状上整体一致，产量性状更好，实现了定向改良稻瘟病抗性的育种目标。
表2 不育系和保持系主要农艺产量性状
Tab.2 Main agronomic and yield traits of sterile lines and maintainers
水稻品系Rice lines播始历期/dSowing-headingperiod株高/cmPlant height剑叶长/cmSword leaf length剑叶宽/cmSwordleaf width剑叶长宽比Sword leaf length/Sword leaf width穗长/cmPaniclelength有效穗数Paniclesper plant单穗颖花数Spikeletsper panicle 丰源B Fengyuan B 8495.128.51.321.926.28.5206.7丰源A Fengyuan A8392.527.91.321.525.59.2205.0丰源B-Pi9-5 Fengyuan B-Pi9-58693.628.41.223.725.78.6219.8丰源 A-Pi9-5 Fengyuan A-Pi9-58689.528.21.223.525.49.4222.1
3 讨论与结论
水稻稻瘟病抗性是典型的质量-数量性状，抗病表型很大程度上受温湿度、光照、病原菌等因素影响，因而通过表型选择的传统抗病育种效率低。基于标记基因型鉴定的分子标记辅助选择(MAS)，能大大提高选择准确性和育种效率，近年来受到稻瘟病抗性育种者的青睐，如倪大虎等[10],利用分子标记辅助选择和田间/温室抗性鉴定,将广谱高抗白叶枯病的Xa21基因和高抗稻瘟病的Pi9(t)基因聚合到同一品系中,获得双基因纯合且农艺性状稳定的株系；殷所得等[11]利用Pi9基因结合田间农艺性状选择和分子标记辅助选择,培育出抗稻瘟病性优于亲本的杂交组合；Jiang等[12]利用辅助选择育种提高金23B的稻瘟病抗性；曹志等[13]以75-1-127(Pi9)、谷梅2号(Pi25)、谷梅4号(Pigm)、天津野生稻(Pi2-1和Pi51(t))、湘资3150(Pi47和Pi48)和魔王谷(Pi49)共6个广谱抗稻瘟病水稻品种为供体亲本，改良了水稻两用核不育系C815S的稻瘟病抗性。此外，还有许多育种家通过MAS育种培育出了大量抗病水稻新品系或新种质，如杨丰宇等[14]利用广谱持久抗瘟基因Pigm定向改良早籼稻1701的稻瘟病抗性，育成一个遗传背景与受体亲本相似的抗瘟水稻新品系1701-Pigm；张礼霞等[15]通过杂交、回交并结合分子标记辅助选择，将Pigm基因导入浙04B中以改良其稻瘟病抗性；Chen等[16]通过回交和基因聚合结合分子标记辅助选择(MAS)，将Pi49和Bph14、Bph15基因导入PTGMS系C815S中，最后构建了几个改良的PTGMS系C815S；姜思达[17]利用Pi9基因的供体亲本75-1-127与易感品种稻花香进行杂交，使杂交后代携带Pi9基因以改良稻花香的稻瘟病抗性；刘树芳等[18]采用回交的方法将2个广谱抗稻瘟病的基因Piz-t和Pi9导入农艺性状优良但稻瘟病抗性弱的云粳优5号、云资粳41号和楚粳28号这3个品种中，以改良它们的抗稻瘟病特性；文绍山等[19]将广谱高抗稻瘟病基因Pi-9(t)导入杂交水稻恢复系泸恢17中，并选育出2个株叶型、抗稻瘟病及配合力较好，且农业性状已稳定的株系WR1023和WR1056。丰源A是国内早前由邓应德等[20]培育出的一个育性稳定、配合力强、异交结实率高、米质较优、抗逆性较强的优良籼型三系不育系，但由于稻瘟病抗性差等原因，没有大面积推广应用。本研究利用已克隆的广谱持久抗稻瘟病基因Pi-9的序列信息，开发了共显性标记ClonDF1R1，能高效区分纯合体和杂合体。通过11a的连续回交MAS育种实践,先后获得高抗稻瘟病的新不育系丰源A-Pi9及其保持系丰源B-Pi9。通过田间不育系、异交习性和主要农艺产量性状分析，最终育成了综合性状优良的抗病不育系丰源A-Pi9-5及其配套保持系丰源B-Pi9-5为三系配套利用杂种优势奠定了坚实基础。
接下来，将在本研究成果基础上，利用获得的改良不育系/保持系进一步开展以下工作：使用更多的稻瘟菌菌株开展人工接种，进一步明确改良不育系/保持系的抗菌谱；在不同生态稻区做稻瘟病抗性鉴定，尤其是穗瘟抗性鉴定，明确改良不育系/保持系及杂交种的适宜种植区域；利用改良不育系广泛配组，尽快选配出抗病、优质、高产、广适性的强优势杂交组合应用于生产，同时分析改良不育系与受体丰源A的恢复源是否发生变化。此外，笔者还将继续利用Pi9基因改良其他骨干水稻亲本的稻瘟病抗性，并开展多基因分子聚合育种实践。
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