苎麻是重要的天然纤维原料，其纤维具有防臭抑菌、透气抗电、清凉舒爽等优良品质，其他纤维无法替代。苎麻原料中除含有天然纤维外，还包含许多果胶等“胶质”成分。要获得苎麻中的纤维，必须经过“脱胶”处理[1]。传统的沤麻工艺效率低，对环境污染严重、水资源严重浪费，化学脱胶工艺能耗高、成本高、纤维品质劣化，而生物脱胶具有节能、环保、高效的优点，为苎麻脱胶的发展方向[2-3]。
生物脱胶需要一系列酶协同完成，其中果胶酶是苎麻生物脱胶关键因子之一，而脱胶果胶酶的主要成分是果胶裂解酶(Pectate lyase，PEL，EC 4.2.2.2)[2]。PEL对果胶底物的亲和力与果胶甲酯化程度呈正相关，可直接通过反式消除作用随机切割甲酯化果胶的α-1，4糖苷键，在果胶非还原性末端的C5处消去一个氢原子到还原性末端的C1处生成羟基，非还原性末端生成带不饱和双键的聚半乳糖醛酸[4]。据报道，Bacillus licheniformis HDYM-03、Paenibacillus polymyxa KF-1、Pectobacterium carotovorum HG-49和Dickeya dadantii DCE-01是目前可用于工业化苎麻生物脱胶的微生物[5-8]。从这些苎麻脱胶微生物中发掘优良果胶裂解酶并使其高效表达，是一条提高脱胶果胶裂解酶研究效率的有效途径。多基因家族编码的PEL广泛存在于微生物中，且降解来源不同果胶的功能特性存在明显差异[9-11]。因此，PEL脱胶功能特性与脱胶机制一直是生物脱胶领域关注的热点，但在苎麻生物脱胶功能特征上的研究报道[12]相对较少[12]。本研究拟在筛选得到苎麻高效脱胶菌株D. dadantii DCE-01[1]，并将其PEL基因pelG403克隆至质粒pEASY-Blunt E1的基础上，将pelG403基因更换至质粒拷贝数更高的pET28a载体中，诱导其高效表达，同时对其进行相关生物信息学分析，探索苎麻脱胶果胶裂解酶基因pelG403高效表达的方法和途径，并为脱胶果胶裂解酶关键位点分析、分子改造奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株与载体 pEASY-Blunt E1-G403/BL21工程菌由中国农业科学院麻类研究所生物加工研究室构建与保藏；表达载体pET28a、原核克隆感受态E.coli TOP10与原核表达感受态E.coli BL21(DE3)均购自Novagen公司。
1.1.2 主要试剂 超强高保真PCR试剂盒Ultra HiFidelity PCR Kit、DNA Marker Ⅲ、IPTG、卡那霉素(Kan)、DNA回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自天根生物公司；其余常规化学试剂等商业化产品购自国药集团；引物合成和DNA序列测定由长沙擎科生物公司完成。
1.1.3 主要仪器 PCR仪，BioRad公司；凝胶快速成像仪，Vilber公司；冷冻离心机，Sigma公司；核酸电泳槽，北京六一公司；核酸浓度检测仪，Thermo Fisher公司；酶标仪，Thermo Fisher公司；振荡培养箱，上海知楚仪器公司。
1.2 试验方法
1.2.1 pelG403基因克隆 根据果胶裂解酶基因pelG403的碱基序列(GenBank登录号：JX964998)，利用生物信息学软件SnapGene设计引物。正向引物和反向引物分别带入限制性酶切位点Nde Ⅰ和Xho Ⅰ，正向引物F的序列：5′-CGCATATGATGCCCATCTCACA
TTTTTC-3′(划线部分为Nde Ⅰ酶切位点)，反向引物R的序列：5′-CCTCGAGTTATTTACAAGCTGAGCTGG-3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点)。
以pEASY-Blunt E1-G403重组质粒进行PCR扩增。PCR反应体系：质粒模板1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.75 μL，2×UltraHiFi Mix 12.5 μL，用ddH2O补足至25 μL。PCR参数设置：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，35个循环；68 ℃，5 min。凝胶电泳检测PCR 产物后回收目的片段，用限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ分别对回收的目的片段和pET28a质粒进行酶切；回收酶切后的pelG403目的片段和pET28a载体片段，加入T4 DNA 连接酶过夜，获得重组质粒pET28a-G403(图1)。将重组质粒转化E.coli TOP10克隆感受态细胞，经Kan抗性平板培养16～20 h；挑选典型单菌落，经PCR鉴定后送至长沙擎科公司进行核酸测序验证。
图1 果胶裂解酶重组子构建
Fig.1 Schematic diagram of expression vector for pectate lyase gene
1.2.2 果胶裂解酶PelG403的诱导表达 取测序检验正确的工程菌pET28a-G403/TOP至Kan抗性LB培养基，37 ℃，220 r/min，培养12 h后抽提质粒。将重组质粒pET28a-G403转化E.coli BL21(DE3)表达感受态中，经Kan抗性平板筛选，挑选典型阳性克隆接种于Kan抗性筛选的LB培养基，37 ℃，200 r/min培养至菌体OD600为0.4～0.6，加入IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)，28 ℃，150 r/min诱导PelG403表达。
1.2.3 重组蛋白的检测分析 SDS-PAGE检测：取 1 mL 的诱导成熟的工程菌菌液，5 000 r/min 10 min，弃废液，生理盐水重悬洗涤菌体后用40 μL灭菌ddH2O充分混匀，加入 10 μL 5×Loading Buffer，煮沸3～5 min，以未导入目的基因的pET28a/BL21菌株做相同处理作阴性对照；各取10 μL上样SDS-PAGE预制胶，电压130 V电泳60 min，考马斯亮蓝染色观察蛋白条带。将染色后的SDS-PAGE胶浸于缓冲液中，剪取NC 膜和滤纸一起放入缓冲液中平衡，湿转，封闭，孵育一抗，孵育二抗，TMB显色进行Western Blot 鉴定[13-14]。
1.2.4 果胶裂解酶活力测定 用0.05 mol/L的Gly-NaOH的缓冲液(pH值9.0)配置聚半乳糖醛酸钠底物溶液(5 mg/mL)。添加适量工程菌发酵液上清至1 mL底物溶液，摇匀后50 ℃酶解反应10 min，加2 mL DNS，沸水浴显色5 min；以灭活相同酶做阴性对照，测定OD520[15]。酶活力定义：底物1 min分解出1 μmol不饱和还原性物质需要的酶量为1个酶活力单位，以U表示。
1.2.5 PelG403生物信息学分析 利用生物信息学在线网站Expasy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析PelG403序列的基本理化性质；SignalP-5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测其信号肽；用Pfam(http：//pfam.xfam.org/search/sequence)对PelG403的结构域进行分析。
用生物信息学软件Mega 7.0对来源于DCE-01菌株的PelG403氨基酸序列与其他微生物来源的PEL氨基酸序列进行聚类分析，随后ClustalW软件分别进行双序列比对；用计算机在线软件PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测果胶裂解酶PelG403的二级结构；利用瑞士生物信息学中心在线工具SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)对果胶裂解酶PelG403进行同源建模，VMD进行作图分析，并利用Verify-3D对模型进行评分[16]。
2 结果与分析
2.1 pelG403基因扩增
对引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的目的基因进行检验，图2结果表明，其片段约为1 200 bp，这与预期的1 179 bp(pelG403目的基因片段与引入的酶切位点之和)相符。
2.2 菌落PCR鉴定
随机挑取4个单菌落，进行PCR鉴定。图3结果表明：4个转化子的PCR产物均有一特异条带，其分子量(约1 200 bp)与预计大小(1 179 bp)基本一致。
2.3 PelG403表达效果分析
2.3.1 SDS-PAGE分析 将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至pET28a载体后，收集诱导成熟的pET28a-G403/BL21菌体，对PelG403表达效果进行SDS-PAGE分析。图4结果表明，基因工程菌菌体样品在35 ku上方有较清晰的专一蛋白条带，但与预测带有20个氨基酸的His标签的融合蛋白分子量(43.6 ku)相比略小。
M.DNA Marker Ⅲ；1. 扩增的pelG403基因。
M.DNA Marker Ⅲ；1.Amplified pelG403 gene.
图2 pelG403基因PCR扩增
Fig.2 PCR amplification of pectate gene pelG403
M. DNA Marker Ⅲ；1-4. 4个阳性克隆的PCR产物。
M. DNA Marker Ⅲ；1-4.PCR products of four positive clones.
图3 阳性克隆鉴定
Fig.3 Identification of positive clones
Western Blot对菌体蛋白进一步分析，图4结果表明，在34～43 ku有明显信号条带。其分子量也比预期融合蛋白分子量43.6 ku略小。
A.SDS-PAGE分析: M.Protein Marker；1.阴性对照；2-4.诱导样品。
B.Western Blot分析: M.Protein Marker；1.诱导样品。
A.SDS-PAGE analysis：M.Protein Marker；1.Negative control；2-4.Induced
samples：B.Western Blot analysis： M.Protein Marker；1.Induced samples.
图4 PelG403表达效果分析
Fig.4 Expression identification of PelG403
2.3.2 酶活力检测 取诱导12 h的pET28a-G403/BL21工程菌发酵液，测定其果胶裂解酶活力，表1结果表明，果胶裂解酶活力达335.8 U/mL，较pEASY-Blunt E1-G403/BL21提高了3.05倍。
表1 工程菌的果胶裂解酶活力
Tab.1 Pectate lyase activity of engineering bacteria
菌株Strains果胶裂解酶活力/(U/mL)Pectate lyase activitypET28a/BL210pET28a-G403/BL21335.8pEASY-Blunt E1-G403S/BL2182.8
2.4 果胶裂解酶PelG403生物信息学分析
2.4.1 基本性质分析 对果胶裂解酶基因及其编码产物进行生物信息学分析，结果表明：该果胶裂解酶基因pelG403序列全长为1 164 bp，编码的果胶裂解酶PelG403含387个氨基酸，其N末端前35个氨基酸为信号肽序列，前体蛋白和成熟蛋白的分子量大小约为41.4，37.8 ku，其理论pI为7.64，半胱氨酸数量为4个，不稳定性指数为27.42；该蛋白含有典型的右手β-螺旋结构，属于Pec lyase C家族。
2.4.2 亲缘关系分析 将来源于DCE-01菌株的苎麻脱胶果胶裂解酶PelG403氨基酸序列与其他微生物来源的果胶裂解酶氨基酸序列进行比较，并用Mega 7.0采用邻接法构建进化树(图5)，结果表明：PelG403与同样来源于D.dadantii的果胶裂解酶(GenBank登录号：ADN00346)的亲缘关系最近，进一步用ClustalW软件将PelG403与进化树中亲缘关系较近的果胶裂解酶序列分别进行比对，目的序列与D.dadantii(ADN00346)、D.chrysanthemi(PDB：2EWE)和Pectobacterium versatile(ASN83858)相似性分别为95.9%，82.9%，82.0%。
图5 果胶裂解酶氨基酸序列进化树
Fig.5 Evolutionary tree of amino acid sequence of pectate lyase
2.4.3 二级结构分析 利用PSIPRED生物信息工具分析PelG403的二级结构(图6)，结果表明：在PelG403中，螺旋占总蛋白的10.2%；折叠占总蛋白的46.0%；卷曲占比43.8%。
图6 PelG403二级结构预测
Fig.6 Secondary structure prediction of PelG403
2.4.4 高级结构分析 从PDB数据库中选取了同源性最高的细菌来源PEL蛋白空间结构(PDB：2EWE)为模板，对PelG403进行同源建模，结果表明(图7)：PelG403主要由螺旋和卷曲构成，与二级结构预测的结果基本相符；且属于典型的右手β-螺旋结构，与Pfam结构域分析一致，表明PelG403经同源建模得到的蛋白三维结构可信度高。
图7 PelG403三维结构预测
Fig.7 Three-dimensional structure prediction of PelG403
3 讨论
果胶裂解酶参与生物脱胶时不需要果胶去酯化，可直接作用于甲酯化果胶，促进半纤维素酶类和其他脱胶因子的有效渗透，其催化能力是苎麻生物脱胶的限速步骤[17-20]。因此，对PEL进行高效表达有助于获得大量优良工业用果胶裂解酶，降低纯化难度，有助于PEL脱胶功能与酶学特性的研究。
构建原核表达系统时，重组蛋白的表达量受诸多因素影响，如密码子偏好、启动子强度和表达质粒的质粒拷贝数等，这些因素对于蛋白的过量表达具有关键作用[21]。贺扬等[22]研究发现，利用pGEX-2T 和pET28a 2种质粒对IGF-2蛋白进行原核表达，虽然两者均表达出具有生物学活性的IGF-2蛋白，但质粒拷贝数更高的pET28a表达体系的产量远高于pGEX-2T，本研究通过更换质粒拷贝数更高的pET28a表达载体，使PelG403高效表达，其酶活力提高了3.05倍。这与前人的研究结果一致。
pET28a-G403/BL21表达产物的分子量比预测带6×His标签的融合蛋白分子量(43.6 ku)略小，而PelG403预测信号肽为35个氨基酸，6×His标签有20个氨基酸，而表达产物的分子量正好与除去这55个氨基酸大小一致；推测可能由于目的蛋白分泌后，其携带His标签序列伴随着信号肽序列一同被降解[23]，有待进一步证实。
工业化脱胶加工时，需要相对高温高碱的反应环境，当PEL相应稳定性不够时，PEL的空间结构容易被破坏，果胶裂解酶的活性大幅度降低，甚至完全失活[24]。本研究利用三维结构建模、同源序列建树、氨基酸序列比、结合重要结构域对苎麻脱胶果胶裂解酶PelG403序列与结构进行分析，为该类酶的关键位点分析、分子改造及进一步揭示PEL脱胶功能特性奠定了基础。未来将进一步分析确定PelG403的催化位点及功能域，并结合其关键氨基酸位点进行定点突变，提高PelG403的比酶活和耐热耐碱性，为苎麻脱胶加工的酶制剂产业提供理想材料。
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