植物中有些RNA分子可以通过胞间连丝或植物韧皮部进行长距离移动。在外界环境刺激下，这些可移动的RNA在源(Source)中转录，然后通过韧皮部运输到库(Sink)中并发挥作用[1-4]。目前发现3类可移动的RNA分子存在于韧皮液内，外源类病毒或RNA病毒，植物内源mRNA以及非编码小RNA[5]。植物病毒侵入寄主细胞后，通过胞间连丝和韧皮部筛管分别实现细胞间转运和长距离转运，从而对植物系统实现侵染[6]。病毒RNA是最早被证实可以在植物韧皮部进行长距离运输的RNA，其在韧皮液的运输机制为研究植物内源mRNA提供了重要参考。通过对植物韧皮液转录组分析发现了数千种mRNA，它们所编码的蛋白质参与信号转导等功能[7-8]。然而并非所有韧皮液中发现的RNA均进行长距离移动。目前已在嫁接植物体中发现了些许可移动mRNA，研究表明，这些长距离运输的mRNA可以作为信号分子对植物的生长发育进行调控[9-12]。最近的一项研究通过大豆和菜豆的异缘嫁接试验证明，地上部产生的很大一部分小RNA被运输到根部，然而mRNA在地上部和根部之间的移动非常有限，推测小RNA才是远程通信的“信使”[13]。尽管越来越多的试验表明，可移动RNA分子可作为活跃的信号分子在细胞间转移，但目前对可移动RNA运输的机制了解有限。因此，移动的RNA是如何转移到其他细胞当中还仍待研究。
在RNA实时成像系统中，利用荧光标记的RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)进行间接RNA标记[14-15]。利用GFP融合MS2噬菌体外壳蛋白(MS2-GFP)，将目标RNA融合到MS2识别RNA茎环(Stem loop，SL)的串联重复序列上，MS2-GFP与RNA-SL之间的相互作用可以使活细胞中的RNA可视化。利用来自猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)的核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)将MS2-GFP限制在细胞核上，减少了来自MS2-GFP的胞质荧光背景，当MS2SV40-GFP与含有SL的RNA共表达时，MS2SV40-GFP与其RNA识别位点相连，RNA-蛋白复合物被保留在细胞质中从而形成荧光。该系统已成功应用于酵母、果蝇、哺乳动物和植物中mRNA的可视化[16-21]。然而来自SV40的NLS无法有效地将小的GFP融合蛋白限制在细胞核上，导致少量MS2SV40-GFP蛋白在细胞质中积累[22-23]。然而该系统在植物中使用时通常会在细胞质中产生大量的荧光背景，极大地干扰了RNA信号的检测。后来对MS2系统进行改进，用一种特异定位于拟南芥顶端分生组织细胞核的转录因子FD替代SV40作为核定位信号，大大减少了细胞质荧光背景[24-26]。本研究构建了含有RNA茎环串联重复结构的表达载体pSL24UbiK，基于MS2FD-GFP的RNA标记系统，噬菌体外壳蛋白MS2与RNA茎环串联重复结构识别，共聚焦显微镜观察GFP信号的亚细胞定位情况，可以鉴定RNA的可移动性，为今后可移动RNA的研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
野生型拟南芥(Col-0)和野生型本生烟草(Nicotiana benthamiana)均由长江大学农学院湿地作物微嫁接实验室提供，大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101由本实验室保存。质粒p1390-35S-MS2FD-GFP、p1390-35S-FT-SL24由“台湾”中央研究院植微所余天心博士提供，限制性内切酶Mfe Ⅰ、EcoRⅠ购于 New England Biolabs公司。本研究所用引物均由生工生物工程股份有限公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 pSL24UbiK表达载体的构建 利用引物SL24F1：TGATTAACAGCTCGCGGGCCCAAGCCCTAGGTAATACGACTCACTATAGG和SL24R1：CTTACTCAGTTAGGTCAATTGCACACTCGAGAATTAACCCTCACTAAAGG 从pCR4-24xMS2SL-stable质粒中扩增出含有SL24序列的片段，将该片段连入双元载体pUbiK，转化 DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌株扩繁，提取质粒，经酶切鉴定，并在测序结果比对正确后，最终得到pSL24UbiK载体。
1.2.2 RNA提取及cDNA合成 取幼嫩的野生型拟南芥叶片剪碎放入液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，充分研磨后采用TRIzol法提取RNA，RNA的浓度通过Nano Drop 2000(Thermo)测定，质量和完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。
1.2.3 基因克隆 提取拟南芥DNA，以DNA为模板，对GUS基因进行PCR扩增；以上述合成的cDNA作为模板，对FT(FLOWER ING LOCUS T)基因进行CDS 全长序列的扩增(表1)。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，59 ℃/ 60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃总延伸5 min，4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检验，然后将PCR产物用纯化试剂盒进行回收。pSL24UbiK经限制性内切酶Mfe Ⅰ 37 ℃反应2 h后纯化备用。利用同源重组酶将克隆的2个基因片段分别连接到线性化载体pSL24UbiK上。取5 μL重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌株扩繁，提取质粒，经酶切(EcoR Ⅰ)鉴定，由公司测序。在测序结果比对正确后，最终得到pSL24UbiK-GUS和pSL24UbiK-FT载体。将构建好的质粒转化农杆菌 GV3101。
表1 本研究中用到的引物
Tab.1 Primer sequence used in this research
引物名称Primer name引物序列(5′-3′)Primer sequenceGUS-FTAATTCTCGAGTGTGCAATTGGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCGUS-RCTTACTCAGTTAGGTCACTGCCACTGACCGGATGCFT-FAATTCTCGAGTGTGCACAAATTAAAGAAGCAGAAACFT-RTTACTCAGTTAGGTCAATTGATAGGCATCATCACCGTTC
1.2.4 烟草叶片的瞬时表达及共聚焦激光显微镜成像 将含重组质粒的农杆菌500 μL加入至含有抗生素的20 mL LB液体培养基中，28 ℃过夜振荡培养5 000 r/min离心10 min，收集菌体倒掉上清液，用无菌水重悬菌体，使菌液浓度分别达到OD 600 ≈0.3。将pSL24UbiK-FT和p1390-35S-MSFD-GFP、pSL24UbiK-GUS和p1390-35S-MS2FD-GFP、p1390-35S-FT-SL24和p1390-35S-MS2FD-GFP的菌液分别等体积混匀，选取叶龄在35 d左右的本氏烟草，用2 mL注射器(去掉针头)在叶片背部注射菌液直至叶片组织空隙被液体填满，而后将注射后的烟草放置于25 ℃条件下培养，48 h之后用水将侵染过的烟草叶片清洗一遍，从侵染的叶片区域取出约0.5 cm2的样品制片，在Leica激光共聚焦显微镜TCS-SP8下对荧光信号(GFP)进行观察，激发光波长选择488 nm。
2 结果与分析
2.1 FT、GUS基因扩增
使用引物GUS-F/R、FT-F/R，对目的基因进行序列扩增，得到了大小符合、条带清晰且单一的PCR条带，其中GUS基因长度为430 bp；FT的CDS全长为675 bp(图1)。
A.GUS；B.FT；M.DL10000 DNA Marker。
图1 GUS、FT基因扩增的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of GUS and FT gene amplification
2.2 表达载体的构建
重组产物转化DH5α感受态细胞后，在抗性培养基上挑选阳性菌落进行质粒提取，经EcoRⅠ酶切pSL24UbiK、pSL24UbiK-FT、pSL24UbiK-GUS质粒结果如图所示(图2)。条带大小符合预期，初步判定pSL24UbiK、pSL24UbiK-FT、pSL24UbiK-GUS表达载体构建成功。送样测序后，通过序列比对，进一步确认表达载体构建成功。
A.pSL24UbiK经EcoR Ⅰ 酶切后产生的7 363,2 606,1 328,706 bp大小的片段; B.pSL24UbiK-FT经EcoR Ⅰ 酶切后产生的7 363,3 281,1 328,706 bp大小的片段; C.pSL24UbiK-GUS经EcoR Ⅰ 酶切后产生的7 363,3 036,1 328,706 bp大小的片段; M.Trans2K Plus DNA Marker。
A.The 7 363,2 606,1 328,706 bp fragments of pSL24UbiK after digestion with EcoR Ⅰ; B.The 7 363,3 281,1 328,706 bp fragments of pSL24UbiK-FT after digestion with EcoR Ⅰ; C.The 7 363,3 036,1 328,706 bp fragments of pSL24UbiK-GUS after digestion with EcoR Ⅰ; M. Trans2K Plus DNA Marker.
图2 pSL24UbiK表达载体的构建
Fig.2 Construction of pSL24UbiK expression vector
2.3 MS2FD-GFP的亚细胞分布
瞬时表达的GFP或MS2-GFP在细胞核和细胞质中均有定位，虽然将SV40 NLS插入到MS2-GFP(MS2SV40-GFP)中大大降低了MS2-GFP的细胞质背景，但仍然可以检测到的MS2-GFP细胞质背景，极大干扰了信号的检测[26]。将改造后的含有p1390-35S-MS2FD-GFP的农杆菌侵染烟草叶片，48 h后用倒置荧光显微镜观察到MS2FD-GFP定位在细胞核中(图3)，与MS2SV40-GFP相比大大减少MS2-GFP的细胞质背景影响，为后续试验的验证提供了良好的支撑依据。
图3 MS2FD-GFP的亚细胞定位
Fig.3 Subcellular localization of MS2FD-GFP
2.4 可移动RNA FT的亚细胞分布
在本氏烟草叶片中，通过农杆菌渗透法将p1390-35S-FT-SL24与p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染烟草叶片，MS2FD-GFP可与FT-SL24融合，在细胞核和胞质中均检测到GFP信号，并在细胞质附近显示出点状信号(图4)。与此同时，将成功构建的pSL24UbiK-FT与p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染烟草叶片，发现与对照试验中p1390-35S-FT-SL24与p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染结果一致(图4)。
图4 植物细胞中可移动RNA的亚细胞分布
Fig.4 Subcellular localization of mobile RNA in plant cells
2.5 不可移动RNA GUS的亚细胞分布
为了解释可移动RNA在细胞质附近检测出的点状信号，将不可移动RNA GUS融合载体pSL24UbiK上，将pSL24UbiK-GUS与p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染烟草叶片，48 h后用倒置荧光显微镜观察细胞中 GFP 的表达以及位置。结果发现，不可移动RNA GUS在细胞质附近没有检测到荧光信号，只在细胞核位置有荧光信号的出现(图5)。由此可以看出，通过将RNA融合到pSL24UbiK载体上经过该系统检测，若在细胞质附近检测到荧光信号则说明该RNA是可移动的，反之亦然。
图5 共聚焦显微镜下观察植物细胞中移动RNA和非移动RNA的亚细胞分布差异
Fig.5 The subcellular distribution difference of mobile RNA and non-mobile RNA in plant cells was observed under confocal microscopy
3 结论与讨论
可视化活细胞内RNA的实时运输是了解特定RNA细胞分布最有效的方法。在这些方法中，通过基因编码的荧光RBP进行间接RNA标记使特定组织中的RNA可视化[14-15，27]。尽管许多物种在RNA实时成像方面取得了显著进展，但在植物中的研究相对有限[15，28]。另外，依赖于MS2的RNA可视化系统的缺点之一是需要在目标RNA上多次重复MS2识别的SL结构。检测活植物细胞中的荧光信号至少需要重复24个SL序列，这与哺乳动物细胞的结果一致[29]。在目标RNA上插入大片段的MS2识别SL序列(SL序列的24个重复序列为870 bp)可能会干扰目标RNA的生物学功能。实时RT-qPCR和共聚焦显微镜分析表明，在目标FT RNA上插入SL序列不会极大地干扰RNA的转录和翻译[26]。但是，不排除在其他RNA上插入SL序列导致其功能破坏的可能性。FT RNA在光周期诱导的叶片中转录翻译，并且可以从叶片向茎尖移动，调控光周期敏感植物开花，可被作为典型的可移动的RNA进行研究[30-31]。本研究构建了含有24个茎环串联重复的RNA结构表达载体pSL24UbiK，利用不可移动RNA GUS作为阴性对照，观察了可移动RNA和不可移动RNA在细胞中的定位情况，验证了该方法的可行性，为今后研究可移动RNA的运输奠定了基础。
植物韧皮液内RNA分子长距离移动的发现具有重要意义，可移动RNA作为植物调控模式中的新信号，是植物界研究的新热点。目前，虽然已知植物韧皮液内存在上千种RNA，但是能进行长距离移动的只有小部分被验证，且明确功能的更少，对于其运输调控机制也仅停留在假说阶段。本鉴定方法可以快速验证RNA分子是否可以移动，避免了传统的复杂验证过程，极大地提高了工作效率，为科研人员节省了大量的时间和精力。
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