生长素作为最早发现的一类植物激素，参与调控植物多种生长发育过程，如根的发育[1]、顶端优势、向性反应和形态建成[2]等。生长素调控通路中关键蛋白主要包括生长素/吲哚乙酸蛋白(Aux/IAAs)、SCF复合系统和生长素响应因子(ARFs)[3]。生长素响应因子是能与生长素应答元件(AuxRE)TGTCTC序列特异结合，调节生长素反应基因的一类转录因子，最先在模式植物拟南芥中被鉴定出来[4]，该家族共有23个基因[5]。其中ARF1/ARF2功能的缺失通过增加拟南芥中Aux/IAA基因的转录进而调控叶片衰老和开花时间[6]；ARF3/ARF4主要调控侧生器官的结构发育[7]，ARF3直接与细胞分裂素基因AtIPT5启动子结合，负调控AtIPT5的表达，介导生长素与细胞分裂素相互作用，影响新生芽的再生[8]；ARF5通过调控AMP1的表达影响胚和维管组织的形成[9]；arf6、arf8突变体雄蕊发育迟缓，而arf6/arf8双突变体则不能形成成熟的花，表明ARF6、ARF8共同参与花的形态建成[10]，同时，ARF8还负调控果实的起始发育[11]；ARF7/ARF19可直接激活下游基因LBD/ASLs的表达来影响侧根形成[12]；ARF10/ARF16则是在miR160下游调控根冠发育及根的向地性[13]。
单子叶植物水稻ARF家族中有25个成员[14]。OsARF1是水稻中第一个被发现的ARF基因[15]，它与胚芽鞘的向性有关；之后的研究表明，OsARF1对营养生长和种子发育至关重要[16]；OsARF4能与OsGSK41/OsGSK互作且被后者磷酸化，调控水稻籽粒大小及千粒质量[17]；OsARF16参与细胞分裂素介导的水稻磷酸盐转运和信号传递通路，且敲除株系对外源细胞分裂素不响应[18]。OsARF17和OsARF19通过调节生长素和BR信号来控制水稻叶夹角大小[19-20]。然而，目前对水稻ARF家族的研究大多集中在籽粒发育和叶夹角等方面，ARFs其他成员对水稻农艺性状的影响尚不明确。
CRISPR/Cas9是第3代基因编辑技术，相比其他编辑技术具有成本低、快速高效等优点，已经成为目前最主流的基因编辑系统[21]。近年来，大量研究人员通过CRISPR/Cas9技术对水稻基因编辑，研究水稻基因的功能，也取得了重要进展[22]。本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻生长素响应因子OsARF12第1个和第2个外显子靶位点进行编辑，独立转化粳稻品种日本晴，通过对2个外显子不同突变位点的KO-ARF12-1和KO-ARF12-2突变体进行测序、表达量鉴定、表型性状调查，研究OsARF12对水稻农艺性状的影响。
1 材料和方法
1.1 试验材料
转基因受体材料为：粳稻品种日本晴(Oryza sativa spp. japonica cv. Nipponbare)。CRISPR/Cas9载体为：pOs-gRNA、pH-Ubi-CAS9。试验所需引物(表1)合成与测序分析均由上海生工生物工程股份有限公司完成。
表1 试验所用引物
Tab.1 Primers used in this test
引物名称Primer name引物序列(5′-3′)Primer sequence(5′-3′)ARF12 Crispr1_FGGCGGAACGATGCGTACCTTCCCGARF12 Crispr1_RAAACCGGGAAGGTACGCATCGTTCARF12 Crispr2_FGGCGTTCACACCCGGATATCGGTTARF12 Crispr2_RAAACAACCGATATCCGGGTGTGAACrispr ARF12-1_FCTGACTTGGGCTGGCAATTTCrispr ARF12-1_RGAGGCTGCTGTGTGAAATCCCrispr ARF12-2_FTTTCCTCCCCATGTACACCGCrispr ARF12-2_RATAATGGGGTGATGTCCTGACOsARF12_F定CTGACTTGGGCTGGCAATTTOsARF12_R定TCGACGAATACAAGCTGCCAGCactin_FGGAAGTACAGTGTCTGGATTGGAGactin_RTCTTGGCTTAGCATTCTTGGGT
1.2 试验方法
1.2.1 OsARF12靶位点设计和表达载体构建 根据CRISPR/Cas9原理，在RAP-DB网站(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)上获取水稻OsARF12外显子序列，分别选取第1个外显子PAM序列(CGG)前20 bp(5′-GAACGATGCGTACCTTCCCG-3′)及第2个外显子PAM序列(GGG)前20 bp(5′-TTCACACCCGGATATCGGTT-3′)为靶位点(图1)。分别在2个靶位点5′端前加上Bsa Ⅰ限制性内切酶的黏性末端接头GGCG，即为ARF12 Crispr1_F、ARF12 Crispr2_F(表1)；将选取的2个靶序列分别反向互补并在其5′端前加上Bsa Ⅰ限制性内切酶的黏性末端接头AAAC，即为ARF12 Crispr1_R、ARF12 Crispr2_R(表1)。将2对加过接头的序列送往上海生工生物工程股份有限公司合成后，经磷酸化修饰和退火形成双链，用T4 DNA连接酶与经过限制性内切酶Bsa Ⅰ酶切过后的中间载体sgRNA连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，随后进行菌落PCR检测与测序，并用阳性质粒与Cas9终载体进行LR重组，转化DH5α，经菌落PCR和测序检测，将阳性质粒转化农杆菌EHA105。利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，获得转基因植株。
1.2.2 植株DNA和总RNA的提取 在野生型和各转基因植株抽穗前取叶片样品，并立即置于液氮中，-80 ℃冰箱保存。采用CTAB法提取叶片DNA；TRIzol法提取总RNA。
1.2.3 反转录 使用天根生化科技有限公司FastKing RT Kit(KR118-02)反转录试剂盒将1 μg总RNA反转录成cDNA。
sgRNA-1. OsARF12第1个外显子靶位点；sgRNA-2. OsARF12第2个外显子靶位点。
sgRNA-1. The first exon target site of OsARF12；sgRNA-2. The second exon target site of OsARF12.
图1 OsARF12靶位点设计
Fig.1 Design of target sites of OsARF12
1.2.4 OsARF12表达量分析 将cDNA稀释10倍，使用天根生化科技有限公司定量检测试剂盒SYBR Green(FP209)，Actin基因作为内参，采用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR分析。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。
1.2.5 数据分析 采用Microsoft Excel 2016对试验数据进行整理和作图，利用SPSS 24进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 KO-ARF12-1/-2 T0突变体鉴定
将携带CRISPR/Cas9-ARF12-1和CRISPR/Cas9-ARF12-2质粒的农杆菌侵染水稻品种日本晴，得到KO-ARF12-1 T0再生苗5株，KO-ARF12-2 T0再生苗15株。利用CTAB法提取各单株叶片的DNA，并根据OsARF12的序列分别设计2个不同靶位点引物：Crispr ARF12-1_F、Crispr ARF12-1_R和Crispr ARF12-2_F、Crispr ARF12-2_R(表1)，用对应的引物对转基因植株的DNA进行扩增(图2)，并将扩增产物送往公司测序。通过对T0测序结果比对发现：KO-ARF12-1-1为1条链缺失1 nt、互补链缺失7 nt的双等位突变体；KO-ARF12-1-2和KO-ARF12-1-3为1条链缺失4 nt、互补链缺失7 nt的双等位突变体，KO-ARF12-1-4和KO-ARF12-1-5 2条链均未突变(表2)。
M.2 kb DNA 标准分子质量。图3-4同。
M.2 kb DNA Marker. The same as Fig.3-4.
图2 OsARF12 T0转基因植株鉴定
Fig. 2 Identification of OsARF12 T0 transgenic plants
表2 KO-ARF12-1 T0转基因植株突变类型鉴定
Tab.2 Identification of mutation types of KO-ARF12-1 T0 transgenic plants
株系Lines序列Sequence突变情况Mutations突变类型Mutation typesWTGCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCCCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-1GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCC-GCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-1双等位突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGT-------CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7KO-ARF12-1-2GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-4双等位突变GCTGTCGGTGGAACGATGCG-------CCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7KO-ARF12-1-3GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-4双等位突变GCTGTCGGTGGAACGATGCG-------CCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7KO-ARF12-1-4GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCCCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG未突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCCCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-5GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCCCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG未突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCCCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG
注：斜体碱基. OsARF12靶序列；下划线碱基. PAM序列；短线. 碱基缺失。表3-5同。
Note：Italicized bases are the target sites of OsARF12；Underline bases are the PAM sequence;Short lines are the base deletion；The same as Tab. 3-5.
KO-ARF12-2各转基因植株共有11种突变类型：KO-ARF12-2-12和KO-ARF12-2-15为2条链分别缺失了6 nt与5 nt的纯合突变体；KO-ARF12-2-5为1条链缺失2 nt，KO-ARF12-2-8为1条链插入1 nt，互补链均没有突变的杂合突变体；而其余8株均为双等位突变：KO-ARF12-2-1为1条链插入1 nt，互补链缺失4 nt；KO-ARF12-2-3为1条链缺失1 nt，互补链缺失6 nt；KO-ARF12-2-6、KO-ARF12-2-9和KO-ARF12-2-11为1条链插入1 nt，互补链缺失1 nt；KO-ARF12-2-7为1条链插入1 nt，互补链缺失7 nt；KO-ARF12-2-13为1条链缺失4 nt，互补链缺失5 nt；KO-ARF12-2-14为1条链缺失1 nt，互补链缺失5 nt；KO-ARF12-2-2、KO-ARF12-2-4和KO-ARF12-2-10 2条链均未突变(表3)。
表3 KO-ARF12-2 T0转基因植株突变类型鉴定
Tab.3 Identification of mutation types of KO-ARF12-2 T0 transgenic plants
株系Lines序列Sequence突变情况Mutations突变类型Mutation typesWTAAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGAT----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-4KO-ARF12-2-2AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT未突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-3AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATA------GGGATGCGGTTCAGGATGTT-6KO-ARF12-2-4AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT未突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-5AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTWT杂合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATAT--GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-2KO-ARF12-2-6AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1KO-ARF12-2-7AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGG-------TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-7KO-ARF12-2-8AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1杂合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTWTKO-ARF12-2-9AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1KO-ARF12-2-10AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT未突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-11AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1KO-ARF12-2-12AAGGCTGTTTTTCACACCCGG------GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-6纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGG------GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-13AAGGCTGTTTTTCACACCCGGAT----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-4双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGA-----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-5KO-ARF12-2-14AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGA-----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-5KO-ARF12-2-15AAGGCTGTTTTTCACACCCGGA-----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-5纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGA-----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT
注：红色加粗倾斜碱基为碱基插入。表5同。
Note: Red bold tilt bases are bases insertion. The same as Tab. 5.
2.2 KO-ARF12-1/-2 T1突变体鉴定
采用CTAB法提取OsARF12在T0发生突变的转基因株系叶片DNA，并用Crispr ARF12-1_F、Crispr ARF12-1_R和Crispr ARF12-2_F、Crispr ARF12-2_R对相应的转基因株系DNA进行扩增(图3，4)，将产物送往公司测序。测序结果进行比对发现，KO-ARF12-1各突变转基因株系T1 20个单株中，有3种纯合突变、2种双等位突变，共5种突变类型，分别为：1条链缺失1 nt、互补链缺失7nt的双等位突变体有4株；缺失1 nt的纯合突变体有1株；缺失7 nt的纯合突变体有3株；缺失4 nt的纯合突变体有7株；1条链缺失4 nt、互补链缺失7 nt的双等位突变体有5株(表4)。
图3 KO-ARF12-1 T1转基因植株鉴定
Fig.3 Identification of KO-ARF12-1 T1 transgenic plants
表4 KO-ARF12-1 T1转基因植株突变类型鉴定
Tab.4 Analysis and identification of mutation types of KO-ARF12-1 T1 transgenic plants
株系Lines序列Sequence突变情况Mutations突变类型Mutation typesWTGCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCCCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-1-1GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACCTTCC-GCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-1双等位突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGT-------CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7KO-ARF12-1-1-3GCTGTCGGTGGAACGCTGCGTACCTTCC-GCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-1纯合突变GCTGTCGGTGGAACGCTGCGTACCTTCC-GCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-1-4GCTGTCGGTGGAACGATGCGT-------CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7纯合突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGT-------CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-2-1GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-4纯合突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-2-4GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-4双等位突变GCTGTCGGTGGAACGATGCG-------CCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7KO-ARF12-1-2-6GCTGTCGGTGGAACGATGCG-------CCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7纯合突变GCTGTCGGTGGAACGATGCG-------CCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-3-1GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-4纯合突变GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAGKO-ARF12-1-3-6GCTGTCGGTGGAACGATGCGTACC----CGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-4双等位突变GCTGTCGGTGGAACGATGCG-------CCGCGGAGATGGGGATAATGAGCAAG-7
图4 KO-ARF12-2 T1转基因植株鉴定
Fig.4 Identification of KO-ARF12-2 T1 transgenic plants
KO-ARF12-2各突变转基因株系T1 60个单株中，有6种纯合突变、1种杂合突变和4种双等位突变，共11种突变类型，分别为：缺失1，6，2，7，4 nt和插入1 nt的纯合突变体，分别为12，1，6，3，2，10株；1条链插入1 nt、互补链未突变的杂合突变体3株；1条链插入1 nt、互补链缺失4 nt，1条链插入1 nt、互补链缺失1 nt，1条链缺失4 nt、互补链缺失5 nt和1条链缺失1 nt、互补链缺失5 nt的双等位突变体分别为6，9，4，4株(表5)。
2.3 KO-ARF12-1/-2 T2突变体表达量分析
以T2 2种不同靶位点的6种不同基因型纯合突变体KO-ARF12-1-1-3(缺失1 nt)、KO-ARF12-1-2-1(缺失4 nt)、KO-ARF12-1-2-6(缺失7 nt)及KO-ARF12-2-5-2(缺失2 nt)、KO-ARF12-2-11-4(插入1 nt)、KO-ARF12-2-15-5(缺失5 nt)(图5-A)为研究材料，选取大田正常生长条件下叶片样品提取总RNA，反转录并定量分析发现，除KO-ARF12-2-11-4，其他各突变体株系中OsARF12表达量与野生型相比均显著下降(P<0.05)(图5-B)。
表5 KO-ARF12-2 T1转基因植株突变类型鉴定
Tab.5 Analysis and identification of mutation types of KO-ARF12-2 T1 transgenic plants
株系Lines序列Sequence突变情况Mutations突变类型Mutation typesWTAAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-1-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGAT----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-4KO-ARF12-2-3-2AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-3-5AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATA------GGGATGCGGTTCAGGATGTT-6纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATA------GGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-5-2AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATAT--GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-2纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATAT--GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-6-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1KO-ARF12-2-7-4AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-7-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGG-------TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-7纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGG-------TTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-8-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1杂合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTWTKO-ARF12-2-8-2AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-9-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT
表5(续)
株系Lines序列Sequence突变情况Mutations突变类型Mutation typesKO-ARF12-2-9-2AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-11-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-11-2AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1KO-ARF12-2-11-4AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT+1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCGAGTTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-13-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATAT----TGGGATGCGGTTCAGGATGTT-4纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATAT----TGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-13-5AAGGCTGTTTTTCACACCCGGAT----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-4双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGA-----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-5KO-ARF12-2-14-1AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1纯合突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTTKO-ARF12-2-14-5AAGGCTGTTTTTCACACCCGGATATCG-TTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-1双等位突变AAGGCTGTTTTTCACACCCGGA-----GTTGGGATGCGGTTCAGGATGTT-5
A. 突变体突变类型；B. 野生型和突变体中OsARF12表达量；不同字母表示不同株系间达到5%显著差异水平。图6同。
A. Mutation types of mutants；B. Expression levels of OsARF12 in wild type and mutants；
Different letters indicated that significant difference among different lines(P<0.05).The same as Fig. 6.
图5 OsARF12突变体突变类型及表达量分析
Fig.5 Analysis of mutation types and OsARF12 expression levels of mutants
2.4 OsARF12对水稻株高的影响
为研究OsARF12对水稻农艺性状的影响，于灌浆期将突变体株系和野生型株系进行比较，结果表明，KO-ARF12-1/-2的株高均显著降低(图6-A、C)，各突变体株系株高与野生型相比分别减少了16.59%，16.63%，16.06%和14.94%，13.15%，18.39%(图6-C)。进一步对水稻各茎节间长度进行统计分析发现，与野生型相比，KO-ARF12-1/-2显著降低了第3和第4茎节间长度，其中第4茎节间降低幅度最大(图6-B、D)，降低的幅度为23.46%(P<0.05)，其次为第3茎节间，降低的幅度为21.91%(P<0.05)，而第1和第2茎节间长度与对照无显著差异(P>0.05)。
A-B. OsARF12突变体和野生型表型对比；
C-D. 突变体和野生型株高、茎节间长度分析；D中不同茎节间长度的方差分析分开进行。
A-B. Phenotype comparison of OsARF12 mutants and wild type；C-D. Analysis of plant height and internode length of mutants and wild type；The analysis of variance of different internode length in D was carried out separately.
图6 OsARF12对水稻株高的影响
Fig.6 Effects of OsARF12 on plant height
3 结论与讨论
现代农业发展中，对突变体进行基因功能研究已经成为一种重要的研究手段。2013年CRISPR/Cas9技术成功应用于定点突变水稻基因[23]，2014年CRISPR/Cas9技术被证实可高效编辑水稻特异基因，并且基因突变能够稳定遗传[22]，极大地促进了水稻突变体库的建立。本研究利用CRISPR/Cas9技术分别对OsARF12的第1、第2个外显子靶序列进行定点编辑，获得了OsARF12多种类型的突变体。其中，KO-ARF12-1 T0 3种突变类型，T1 5种突变类型；KO-ARF12-2 T0 11种突变类型，T1 11种突变类型，为研究OsARF12对水稻农艺性状影响奠定基础。
通过对KO-ARF12-1/-2 2种突变体材料中OsARF12的表达量进行鉴定发现，CRISPR/Cas9基因编辑技术显著降低了OsARF12的表达量。且与对照相比，KO-ARF12-1/-2株高显著降低(P<0.05)，表明OsARF12在一定程度上正向调节水稻的株高性状。已有研究借助T-DNA插入或者是Tos17插入的arf12突变体研究发现，OsARF12可能介导根形态和磷诱导的生长素信号反应；Qi等[24]发现，OsARF12改变铁调节蛋白(OsMIR)和铁调节转运蛋白1(OsIRT1)的丰度，导致铁含量的改变。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制了OsARF12突变体，研究了其在调节水稻株高方面的重要作用，丰富了水稻生长素响应因子OsARF12的生物学功能。
水稻的株高受众多激素以及它们之间的相互作用调控，OsMADS57功能的缺失降低了GA的活性，导致株高降低[25]；OsMED14_1与转录因子YABBY5、TDR和MADS29互作，参与调节生长素的动态平衡，进而调控水稻株高[26]；miR1848靶向OsCYP51G3调节水稻中植物甾醇和BR的生物合成，影响水稻株高[27]。本研究通过CRISPR/Cas9技术对生长素响应因子OsARF12进行编辑，可能通过影响其生长素调控路径，进而导致株高降低。水稻株高由各茎节间长度组成，水稻抗倒伏能力与近基部茎节间长度呈负相关关系[28]。本研究表明，各突变类型的突变体与野生型相比，第1和第2茎节间长度无显著差异，第3和第4茎节间长度显著(P<0.05)降低，且第4茎节间降幅最大，表明突变体植株越靠近基部，其茎节间长度缩短幅度越大，这对提高水稻的抗倒伏能力有重要作用，但KO-ARF12突变体中不同节间长度改变的内在机制需要进一步研究。
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