TCP(TEOSINTE BRANCHED 1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR)转录因子由Cubas等[1]在1999年正式提出，该类型转录因子在植物中广泛存在。其中，Teosinte branched 1(TB1)基因最开始在玉米中发现，能抑制腋芽分生组织的生长并能促进雌性花序的形成[2-3]。Cycloidea(CYC)基因来源于金鱼草，该基因控制着金鱼草花的对称性[4]。PROLIFERATING CELL FACTOR(PCF)是在水稻中发现的转录因子，研究发现PCF1和PCF2能结合水稻增殖细胞核抗原(PCNA)基因的启动子，从而调控分生组织的特异性表达[5]。TCP转录因子是植物所特有的一类蛋白质，在多细胞藻类中也有TCP蛋白的存在，仅在单细胞藻类中未发现[6]。TCP转录因子家族保守结构域是一个非典型的碱性氨基酸-螺旋-环-螺旋(basic-Helix-Loop-Helix, bHLH)结构，根据该结构域的差异可分为classⅠ和classⅡ 2个亚家族，classⅠ和classⅡ识别不同的顺式作用元件site IIa (GGNCCCAC)和site IIb (GTGGNCCC)[1, 7]。
TCP转录因子广泛参与植物生长发育调控和环境信号应答的过程。在拟南芥和玉米中发现，与TB1s同源的AtBRC1(AtTCP18)和ZmTB1对分枝的形成表现为负调控作用，通过抑制腋芽分生组织的生长从而抑制分枝的形成[2, 8-9]。菊花CmTCP7基因属CYC类TCP转录因子，研究发现，该基因在菊花小花花芽分化时期和舌状花花瓣中高表达，表明该基因可能参与形成两侧对称的舌状花[10]。水稻OsTB1是一个ZmTB1同源基因，研究发现在Ostb1突变体中水稻分蘖数增加，在过表达OsTB1水稻中分蘖数减少[11-12]。在金鱼草和拟南芥中发现，一些TCP基因能抑制叶片生长，抑制这些基因的表达后出现叶片边缘过渡生长而产生褶皱、锯齿的表型[13-14]。研究发现，拟南芥转录因子TCP14与TCP15参与GA3信号转导过程，响应GA信号后激活相关基因的表达从而正向调控种子萌发[15]。此外，ⅰlhan等[16]在菜豆中鉴定出了27个TCP基因，并通过启动子分析和荧光定量PCR技术发现，有10个菜豆Pvul-TCP基因表达受盐胁迫调控。还有研究表明，转BpTCP7基因能提高白桦的耐盐碱能力[17]。综上所述，TCP转录因子参与了植物分枝形成、花形态建成、叶片生长、种子萌发、逆境响应等过程。
目前，前人分析鉴定出了31个马铃薯TCP转录因子成员，发现在200 mmol/L NaCl胁迫条件下有6个StTCPs基因成员表达差异显著，但其功能尚不明确[18]。因此，本研究基于转录组数据，采用同源克隆的方法克隆出1个马铃薯TCP基因，根据同源性将其命名为StTCP13，实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)测定该基因的表达模式，并构建原核表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，通过观察大肠杆菌在不同浓度NaCl盐胁迫条件下的生长表型，初步探究该基因的功能。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 供试材料为马铃薯品种费乌瑞它(Solanum tuberosum L. Favorita)，无菌苗由四川农业大学马铃薯研究与开发中心提供。取(21±1) ℃光照培养箱(16 h光/8 h暗)中培养30 d的费乌瑞它无菌苗，整株液氮速冻后于-80 ℃保存，用于总RNA提取。
1.1.2 主要试剂 DNA凝胶纯化回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、TRIzol、2× Taq PCR Master Mix、感受态大肠杆菌DH5α和BL21等购自天根公司；限制性内切酶、T4连接酶、cDNA合成试剂盒、克隆载体pMD19-T等购自TaKaRa；DNA Marker、蛋白Marker、Loading Buffer等购自Solarbio；原核表达载体pGEX-6P-1由本实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 马铃薯StTCP13基因克隆 采用同源克隆法，参考NCBI收录的马铃薯(S. tuberosum)TCP13基因CDS序列，登录号为XM_006365599.2，设计基因5′端为BamH Ⅰ、3′端为Xho Ⅰ 酶切位点，Primer 5.0软件设计引物(5′-3′)为：F-CGGGGATCCATGATA CAAAAGATGATTACTAGAGAAG;R-CGGCTCGAGCT AATTATGTGGATTGAAAAAATATTGT。PCR扩增程序为95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环; 72 ℃延伸2 min 30 s，12 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测结果，目的片段纯化回收后连接T载体，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR法筛选阳性单克隆送至生工生物测序。
1.2.2 马铃薯StTCP13蛋白结构域分析与系统进化树 采用DNAMAN软件进行氨基酸序列分析与同源性比对，NCBI 数据库的CDD软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)分析结构域，MEGA10和iTOL软件构建系统进化树。
1.2.3 马铃薯StTCP13基因的表达模式分析 取样费乌瑞它原原种愈伤后的顶芽芽眼、常温(16±2)℃储藏至发芽芽长为2 mm的顶芽，以及出苗后30 d植株的根、直立茎、叶片进行取样，液氮速冻后-80 ℃保存备用。TRIzol法提取RNA并进行反转录，qRT-PCR测定其相对表达量。从数据库Spud DB(http://potato.plantbiology.msu.edu/)获得StTCP13基因在不同胁迫条件下的FPKM值，Excel整理、TBtool软件分析作图。
1.2.4 马铃薯StTCP13-pGEX6P1原核表达载体的构建 使用BamHⅠ和XhoⅠ 2种限制性内切酶将目的片段从重组T载体上切下，并将pGEX-6P-1载体双酶切线性化，分别纯化回收后用T4连接酶将目的片段与6P-1载体进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，随机挑选单克隆菌落扩大培养后提取质粒，双酶切鉴定法筛选阳性单克隆送至生工生物测序。
1.2.5 马铃薯StTCP13-GST标签融合蛋白的原核表达 提取StTCP13-pGEX6P1重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21，菌落PCR法筛选阳性单克隆。取1个新鲜的阳性单克隆接种于10 mL含氨苄抗性(Amp+)的LB培养液中，37 ℃摇床200 r/min培养至OD600为0.5，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导剂诱导0，2，4，6 h，每次取样1 mL菌液于4 ℃保存。样品于12 000 r/min离心集菌1 min，加入80 μL PBS和20 μL 5×Loading Buffer混匀并煮沸8 min，再次12 000 r/min离心1 min，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳。
1.2.6 转StTCP13大肠杆菌BL21盐胁迫表型分析 设置阴性对照为转pGEX-6P-1空载体大肠杆菌BL21，分别挑取阴性对照和转StTCP13大肠杆菌BL21的1个新鲜单克隆，接种至5 mL含Amp+的LB培养液中，37 ℃摇床200 r/min培养至OD600为0.5。4 ℃低温12 000 r/min离心1 min集菌，1 mL无菌超纯水重悬洗涤，重复2次。用无菌超纯水调OD600为0.03，稀释倍数1×、10×、100×、1 000×、10 000×，分别取3 μL在空白对照和盐胁迫处理培养基上点斑。盐胁迫处理培养基为额外添加200，250 mmol/L NaCl的含Amp+LB培养基，空白对照为不额外添加NaCl的含Amp+LB培养基，设置3次重复。37 ℃恒温培养箱倒置培养8 h观察表型。
2 结果与分析
2.1 马铃薯StTCP13基因克隆
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图1。在500～750 bp，有单一清晰条带。将该片段回收纯化后连接T载体并转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR法鉴定阳性单克隆，随机挑选3个阳性单克隆测序。单克隆测序结果一致，测序得到马铃薯StTCP13基因CDS全长669 bp。
M.2000 bp Marker; 1.StTCP13基因。
M.2000 bp Marker; 1.StTCP13 gene.
图1 StTCP13基因克隆
Fig.1 Cloning of StTCP13 gene
2.2 马铃薯StTCP13蛋白结构域分析
马铃薯StTCP13蛋白结构域预测结果如图2-A所示，在第39-105位氨基酸发现一个典型的TCP超家族结构域。玉米ZmTB1、水稻OsPCF1和OsPCF2是早期发现的TCP转录因子，从NCBI数据库获取ZmTB1(NM_001382583.1)、OsPCF1(XM_015778101.2)、OsPCF2(XM_015792844.2)氨基酸序列，利用DNAMAN软件进行多序列比对，结果如图2-B所示，StTCP13氨基酸序列存在一个非典型的bHLH结构，说明StTCP13可能编码一个由222个氨基酸组成的TCP类蛋白。
图2 StTCP13蛋白结构域分析
Fig.2 Structure domain analysis of StTCP13 protein
2.3 马铃薯StTCP13蛋白系统进化树构建
运用NCBI网站的BlastP程序，检索StTCP13同源性的氨基酸序列，选择相似度不同20个物种的氨基酸序列，MEGA10和iTOL软件构建系统进化树，结果见图3。马铃薯StTCP13与潘那利番茄SpTCP13(XP_006365661.1)、甜椒CaTCP13(XP_016561903.1)、烟草NtTCP13(XP_016491074.1)等氨基酸序列相似度较高，与阔叶栎QlTCP13(XP_030953332.1)、相思子ApTCP13(XP_027358156.1)等氨基酸序列相似度较低。结果表明，StTCP13氨基酸序列保守性与物种进化关系一致。
2.4 马铃薯StTCP13基因的表达模式分析
利用qRT-PCR技术测定StTCP13基因在马铃薯根、茎、叶、芽、芽眼各组织的相对表达量，结果采用-2ΔΔCt法计算，LSD法进行显著性检验。组织表达模式见图4-A，该基因主要在马铃薯的根、叶片和芽中表达，在根中的相对表达量最高、芽眼中相对表达量最低，在根中的表达量是茎中表达量的57.28倍、是芽眼中的224.93倍。整理Spud DB数据库中StTCP13基因的FPKM值，对StTCP13基因的胁迫条件下的表达模式进行分析，结果如图4-B。在150 mmol/L NaCl、50 μmol/L ABA、260 μmol/L甘露醇处理条件下，该基因相对表达量不同程度上调，甘露醇处理条件下表达上调显著，说明StTCP13基因的表达受高盐、ABA、干旱等非生物胁迫条件的诱导。
图3 StTCP13蛋白系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of StTCP13 protein
不同小写字母差异显著(P<0.05)。
Significant difference in different lowercase letters (P<0.05).
图4 StTCP13基因的表达模式分析
Fig.4 Analysis of StTCP13 expression pattern
2.5 马铃薯StTCP13-pGEX6P1原核表达载体的构建
设计BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，将 StTCP13连接到pGEX-6P-1原核表达载体上，重组载体转化大肠杆菌，双酶切法鉴定阳性单克隆，结果如图5所示，在500～750 bp处有单一条带，将鉴定的阳性克隆送至测序，测序结果证明StTCP13-pGEX6P1原核表达载体正向构建成功。
2.6 马铃薯StTCP13-GST标签融合蛋白的表达
将构建成功的重组StTCP13-pGEX6P1原核表达载体导入大肠杆菌BL21中，以IPTG(终浓度0.5 mmol/L)为诱导剂，诱导StTCP13-GST标签融合蛋白表达，诱导0，2，4，6，8 h后取样进行SDS-PAGE电泳，预测StTCP13-GST融合蛋白大小约为51 ku，检测结果如图6所示。诱导2 h后，检测到StTCP13-GST融合蛋白的表达，且随诱导时间的增加，目的蛋白表达量上升，结果表明在大肠杆菌BL21中诱导表达了StTCP13-GST融合蛋白，蛋白大小约为51 ku。
M.2000 bp Marker; 1.pGEX-6P-1和StTCP13基因。
M.2000 bp Marker; 1.pGEX-6P-1 vector and StTCP13 gene.
图5 StTCP13-pGEX6P1载体构建
Fig.5 Vector construction of StTCP13-pGEX6P1
M.180 ku Marker; 0～8 h.诱导时间。
M.180 ku Marker; 0-8 h.Induction time.
图6 StTCP13-GST融合蛋白的原核表达
Fig.6 Prokaryotic expression of
StTCP13-GST tag fusion protein
2.7 转StTCP13大肠杆菌BL21盐胁迫表型分析
盐胁迫处理培养基为额外添加200，250 mmol/L NaCl的含Amp+ LB培养基，空白对照为不额外添加NaCl的含Amp+LB培养基，阴性对照为转pGEX-6P-1空载体大肠杆菌BL21，调OD600为0.03后稀释倍数1×，10×，100×，1 000×，10 000×，取3 μL在培养基上点斑，试验设置3次重复，37 ℃恒温培养箱倒置培养8 h观察表型。结果见图7，LB+200 mmol/L NaCl和LB+250 mmol/L NaCl试验组与对照组相比，表现为抑制大肠杆菌BL21生长，在LB+250 mmol/L NaCl条件下抑制更为明显；在空白对照培养基上(图7-A)，转StTCP13大肠杆菌BL21与阴性对照的生长状况无显著差异；在LB+200 mmol/L NaCl和LB+250 mmol/L NaCl培养基上(图7-B、C)，随稀释倍数的增加，转StTCP13大肠杆菌BL21表现为生长状况要优于对照组，当盐浓度为250 mmol/L时，表型更为明显。
A.LB培养基; B.LB+200 mmol/L NaCl; C.LB+250 mmol/L NaCl。
A.Medium of LB; B.LB+200 mmol/L NaCl; C. LB+250 mmol/L NaCl.
图7 转StTCP13大肠杆菌BL21盐胁迫表型分析
Fig.7 Phenotypic analysis of transgenic E.coli BL21
of StTCP13 gene in salt stress
3 讨论
TCP是植物所特有的一类转录因子，调控植物细胞分裂、影响分生组织的生长[1]。近年，随着测序技术的发展，有更多植物的TCP转录因子被鉴定出来，在烟草中有61个[19]，辣椒30个[20]，高粱27个[21]，芥菜53个[22]，葡萄18个[23]。本研究从马铃薯费乌瑞它中克隆出一个TCP转录因子，依据同源性将其命名为StTCP13，该基因编码区全长669 bp，与预测结果一致，可能编码一个由222个氨基酸残基组成的蛋白质。TCP结构域为一个非典型的bHLH结构域，大约由60个氨基酸组成，根据该结构域的差异又分为classⅠ和classⅡ 2个亚家族，与classⅡ相比classⅠ的TCP结构域缺少了4个氨基酸[1,5,7]。蛋白结构域分析结果表明，StTCP13蛋白的第39-105位氨基酸为一个典型的TCP结构域，该结构域是TCP转录因子的重要功能域，识别并结合基因启动子序列[5]。进一步分析其氨基酸序列发现，该TCP结构域不存在4个氨基酸的缺失，说明StTCP13编码蛋白为TCP转录因子超家族classⅡ亚族成员。系统进化树分析结果表明，马铃薯StTCP13与潘那利番茄、甜椒、烟草等TCP13蛋白在同一进化分支上，说明TCP13蛋白在物种亲缘关系上的保守性，同时也暗示了其功能相似性。
研究表明，番茄SlTCP7基因在根、茎、叶、花、果实等组织中均有表达，但表达丰度存在差异，该基因在番茄茎中表达量最高[24]。在对海岛棉TCP转录因子的研究中发现，海岛棉GbTCP14和GbTCP27基因存在组织表达特异性，在花瓣和花萼中表达量较高，并且在开花后5～20 d其表达量存在差异，该时期为棉纤维伸长分化的关键期，表明该基因与棉花纤维伸长分化有关[25-26]。还有研究发现，马铃薯StBRC1a属CYC/TB1类TCP转录因子，该基因在腋芽部位特异高表达，在纯合突变体中植株表现为分枝增多的表型[27]。组织表达模式结果与前人研究一致，StTCP13基因具有组织表达特异性，在马铃薯根、茎、叶、芽、芽眼中的相对表达丰度有显著差异，主要在根、叶片和芽中表达，而在块茎愈伤后的芽眼中相对表达量极低，表明该基因可能与马铃薯根系、叶片和芽生长过程相关。TCP转录因子主要参与调控植物生长和信号响应等多种生理生化过程，包括植物对非生物胁迫逆境的响应。在马铃薯TCP转录因子家族的鉴定中发现，200 mmol/L NaCl处理条件下StTCP20、StTC21等基因表达量显著上调[18]。番茄SlTCP7基因在100 mmol/L NaCl处理3 h后，表达量显著上升，随后下降并维持在一个相对稳定水平，表明该基因可能参与番茄盐胁迫响应过程[24]。还有研究表明，大豆TCPs基因能响应热、干旱、高盐、ABA等非生物胁迫[28]。相关研究表明，TCP转录因子的表达与盐胁迫等逆境有关，基于FPKM值分析马铃薯StTCP13胁迫表达模式发现，该基因可能响应高盐、ABA、干旱等非生物胁迫。
为了进一步探究StTCP13基因响应盐胁迫逆境的功能，本研究构建了StTCP13-GST标签融合蛋白的pGEX-6P-1原核表达载体，将重组载体导入大肠杆菌BL21中，并成功诱导表达了StTCP13-GST融合蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明，在诱导8 h后StTCP13蛋白表达量较高。转StTCP13大肠杆菌BL21盐胁迫表型分析结果表明，在LB+200 mmol/L NaCl和LB+250 mmol/L NaCl盐胁迫条件下，大肠杆菌的生长受到一定抑制，而导入了StTCP13基因的大肠杆菌生长状况要优于对照，结果表明，高盐胁迫可能诱导StTCP13的表达，其表达能一定程度上提高大肠杆菌对盐胁迫的耐受性，说明StTCP13在响应盐胁迫逆境中发挥一定功能。
从马铃薯品种费乌瑞它中克隆得到StTCP13基因，成功构建了StTCP13-GST标签融合蛋白的pGEX-6P-1原核表达载体，并在大肠杆菌BL21诱导表达了目的蛋白。该基因CDS区全长669 bp，编码由222个氨基酸组成的蛋白质，StTCP13-GST融合蛋白大小约为51 ku。蛋白结构域分析结果表明，StTCP13蛋白属于TCP超家族中classⅡ亚族成员，系统进化树表明StTCP13蛋白与潘那利番茄SpTCP13和甜椒CaTCP13同源性较高。表达分析结果显示，马铃薯StTCP13基因在根中相对表达量最高，在芽眼中相对表达量最低，并且其表达受盐胁迫诱导。转StTCP13在一定程度上提高了大肠杆菌BL21对高盐胁迫的耐受性。
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