近年来，设施蔬菜产业发展迅猛，2016年种植面积达370万hm2，年产量2.5亿t，占全国蔬菜总产量34%[1]，解决了反季节蔬菜供应不足的难题，但同时设施蔬菜生产中氮肥施用普遍过量，导致了一系列严重的生态环境问题[2] 。氮是植物生长的必需的重要养分之一，是与产量最密切的营养元素[3]，然而大量人为调动活性氮向大气和水体过量迁移，严重破坏了氮循环 [4-7]。Gärdenäs等[8]将温室气体的土壤排放控制和根际启动对N循环的影响都放在了重要的首位，而人类活动造成的温室气体排放中14%来源于农田生态系统 [9]，农田过量施肥导致氧化亚氮排放(N2O)、氨挥发(NH3)及氮氧化物(NOx)等氮源气体排放增加，致使全球气候变化和空气质量下降。农田施肥相关过程所排放的N2O约占全球年排放总量的75%[10]。菜田系统N2O的排放强度和峰值出现频率远高于大田系统，其N2O的排放量占了全国农田N2O直接排放量的20%[11]。其中设施N2O的排放量比一般旱田高约5倍[12]。杨凌霄等[13]研究表明，
等是PM2.5水溶性离子的主要组分，其总和占PM2.5质量的38%。我国农田、特别是菜田氮肥效率低下，尽量降低农田施氮的环境风险[14-15]，减少氮源气体排放已引起各界高度关注。
菜田氮养分调控是减施肥料增效的核心关键，其中微生物在氮元素的循环中发挥了重要作用[16-17]。近几年，利用硝化抑制剂调控氮素循环的研究方兴未艾。由于其效果好、成本低、对环境的危害小等优点在农业中广泛应用，常用的硝化抑制剂有双氰胺(DCD)、2-氯-6三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)、3-4甲基吡唑磷酸盐(DMPP)等。它们在新西兰高氮草地、中国南方酸性水稻土及亚热带蔬菜土壤中提高土壤氮肥效率、减少硝酸盐淋失、降低温室气体排放以及提高作物产量等方面已有些报道[18-27]。然而，在我国华北集约化菜田的石灰性土壤中，运用硝化抑制剂减少氮源气体，特别是氮氧化物(NOx)的排放报道较少，尤其是与氨氧化古菌AOA的作用关系更是鲜见报道。本试验深入研究并明晰了硝化抑制剂施用和肥料减施对减少设施菜田NOx、N2O等氮源气体排放及与氨氧化古菌AOA的作用关系，并应用高通量Illumina MiSeq平台测序，利用PICRUSt对16S rDNAV3-V4区基因系列数据进行分析，基于KEGG数据库对与氮代谢相关的功能基因进行了鉴定。为提高华北设施菜田养分利用率，有效防控农业面源污染，切实保障蔬菜食品安全和生态环境安全，促进我国农业高质量绿色发展提供有力的科学依据。
1 材料和方法
1.1 供试土壤
本试验设置于国家农业部鹿泉农业环境科学观测实验站-石家庄市鹿泉市大河镇河北省农林科学院试验站内温室中，开始于2015年，连续种植至今。该地属于河北山前平原区、温带大陆性季风气候，土壤类型为石灰性褐土，其表层土壤(0～20 cm)基础理化性质如下：硝态氮60.2 mg/kg，铵态氮1.01 mg/kg，有效磷28.37 mg/kg，速效钾73.50 mg/kg，全氮1.14 g/kg，全磷0.82 g/kg，全钾19.19 g/kg，有机质14.32 g/kg，pH值8.2，容重1.45 g/cm3。
1.2 试验材料
供试植物为黄瓜，品种为津优1号。DCD为双氰胺分析纯化学试剂，国药集团化学试剂有限公司出品；吡啶为2-氯-6-三氯甲基吡啶，活性成分含量为200 g/L，美国陶氏益农公司出品；供试氮磷钾肥料分别为尿素 (N 含量 46%)、重过磷酸钙 (P2O5含量46%)、氯化钾 (K2O含量60%)。
1.3 试验设置
试验共设计5个处理：不施肥的空白对照(处理CK)，农民常规施肥(处理FT)，常规施肥增施硝化抑制剂DCD(处理In-1)，常规施肥增施硝化抑制剂吡啶(处理In-2)，常规施用量的基础上减量25%施肥(处理OPT)，每个处理设置3次重复，各处理的施肥方案如表2所示，DCD和吡啶用量均为施氮量的15%[27]。作物统一管理，肥料总施用量如表1，有机肥随底肥一次性施入，化肥在底肥时期施入总投入量的60%，后期分别在花期追肥1次(为总投入量的10%)，果期追肥2次(先后分别为总投入量的20%和10%)。硝化抑制剂随化肥一同通过追肥罐随水施入。灌水采用滴灌方式，用土壤时域反射仪TDR(Time Domain Reflectometry)进行土壤水分的监测，保持田间持水量70%，每一生长季共灌溉5次，全生育期总灌溉量约为3 375 m3/hm2。作物生长周期均为120 d。
表1 不同施肥处理氮调控试验的肥料施用量
Tab.1 The different treatments with different fertilizer
input in nitrification process regulation experiment
处理 Treatments化肥投入量/(kg/hm2)Chemical fertilizer input NP2O5K2O有机肥投入量/(kg/hm2)Manure inputCK0000FT7501805256 000In-17501805256 000In-27501805256 000OPT562.51353934 500
1.4 氮源气体及土壤样品采集及测定方法
在黄瓜完整生长周期内每次追肥和灌溉后，连续采集7～10 d的氮氧化物(NOx)、氧化亚氮(N2O)等氮源气体样品。氮源气体各年度数据规律趋同，本研究采用数据为2018年采集；氮肥偏生产力的数据为2015-2020年采集。
在黄瓜完整生长周期内的初花期、盛瓜期、末瓜期等各个时期，尤其是每次追肥和灌溉后，连续记录7～10 d的温度、湿度条件参数，开展了氧化亚氮(N2O)、氮氧化物(NOx)等氮源气体的定位监测，掌握不同处理的排放规律。
氧化亚氮(N2O)气体的采集与测定：采用密闭式静态箱法[28]，箱体由两部分组成：上部箱体为体积为长 0.5 m、宽0.5 cm、高0.5 m的不锈钢框架+亚克力面板，外面包裹保温棉制成，箱体顶部设一气体取样口，底部开口可罩在底座上；下部底座为结合部位为不锈钢框的正方形(横截面)U型(纵剖面)水槽内，底座插入 25 cm 土层中固定。抽气取样时，水封槽内注满水，然后将气密室密封罩扣入有水槽的底座上，形成一个密闭性气体空间，密闭后采用箱内的风扇将气体搅匀。底肥和每次追肥后(水肥一体化追肥，硝化抑制剂一同施入)，连续采样 7～10 d，采样时间为每天10:00-12:00，每次分别在 0，10，20 min收集密闭箱之气样，并记录采集气样的同步时间内采样箱内温度。利用针管采集35 mL气体到20 mL密封且提前抽真空的玻璃气瓶中，带回实验室后，用气相色谱(Agilent7890B，美国)进行气体样品N2O含量的测定。
氮氧化物(NOx)的采集与测定：方法与上述N2O的采集方法相同，将采集到的气体样品先转移到预先抽真空的容积为 200 mL 的气袋中，带回实验室后，采用化学发光法[29](Thermo 42i氮氧化物分析仪，美国)进行测定。
N2O/NOx排放通量计算公式：
其中：F为N2O或NOx排放通量(g/(hm2·d))，ρ为标准状态下被测气体的密度(g/L),H为箱子高度(cm)，P为采样点大气压强(100 kPa)，P标 为标准状态下大气压强(100 kPa)，ΔC/Δt为单位时间内被测气体质量分数变化速率(μg/(g·min))。
N2O/NOx排放总量计算公式：
其中：N2O/NOx排放总量Q单位为kg/hm2；F为N2O/NOx排放通量为g/(hm2·d)，i为按时间排序的采样，n为作物生育期总采样次数。
土壤样品采集与微生物功能基因测定：黄瓜收获以后，分别采集用于测定土壤常规理化指标的表层(0～20 cm)土壤样品2 kg，以及进行微生物多样性和功能基因分析的根际土壤样品适量。表层土壤样品采集，用“S”法均匀采取蔬菜采样点的根系土深度约为0～20 cm，土样充分混合后，四分法留取重量约为1 kg，鲜样0～4 ℃冷藏备测；风干样品，过2 mm筛备测。用于土壤理化指标包括铵态氮、硝态氮，有机质，pH值等的分析测定[30]。关于进行土壤微生物功能基因的样品采集，对于每棵黄瓜根系，都有大约20 cm深的土壤核心，将根际浮土进行人工抖动去除，用去离子水冲洗根际土每株根约100 mL并微波震荡，每棵植株的距离为15～20 cm。将每个小区连续采集3棵黄瓜植株根际土壤进行混合，这些根际土被用于DNA提取[31]。本研究采用的微生物功能基因数据为2020年采集的土壤样品测得。
对参与氮代谢的功能基因进行了PCR扩增，并在高通量Illumina MiSeq系统平台测序，氨氧化古菌AOA amoA基因引物信息如下：Arch-amoA26F:5′-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC-3′；Arch-amo
A417R:5′-GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG-3′[32]。
氮肥偏生产力的计算：根据作物经济产量和氮肥施用量计算氮肥偏生产力(Partial Factor Productivity of Nitrogen，PFPN)，公式为：PFPN(kg/kg)= 作物经济产量/肥料氮投入量[33]。
2 结果与分析
2.1 硝化抑制剂施用和肥料减施对设施黄瓜菜田氮氧化物排放的影响
由图1显示，在基肥施入播种后的7 d以及追肥后的7 d，均为农田氮氧化物NOx排放较高的时期，增施硝化抑制剂可显著抑制华北设施菜田氮氧化物NOx的排放。各施肥处理中以常规施肥(处理FT)下的NOx排放通量最大，峰值为139.3 g/(hm2·d)；与常规施肥(处理FT)相比，增施DCD(处理In-1)和吡啶(处理In-2)均使氮氧化物(NOx)排放量有明显降低，除不施肥的对照(处理CK)外，以增施DCD(处理In-1)的NOx排放通量最低。由图2可知，增施DCD(处理In-1)的NOx排放总量显著低于其他施肥处理，分别比农民常规施肥处理(FT)和减量施肥处理(OPT)的NOx排放总量减少了76.5%，71.8%。
图1 不同施肥处理对设施黄瓜菜田
氮氧化物(NOx)排放通量的影响
Fig.1 Effect of different fertilization treatments on NOx
emission flux in greenhouse cucumber field
不同字母表示不同施肥处理间在0.05水平上差异显著。图4-5同。
Different letters indicate that different treatments have significant
difference at 0.05 level. The same as Fig.4-5.
图2 不同施肥处理对全生育期
氮氧化物NOx排放总量的影响
Fig.2 Effect of different fertilization treatments on
nitrogen loss of NOx emission in greenhouse cucumber field
2.2 硝化抑制剂施用和肥料减施对设施黄瓜农田土壤N2O排放的影响
如图3所示，增施硝化抑制剂和减量施肥均能有效降低氧化亚氮(N2O)的排放，且基肥施用后N2O排放通量显著高于追肥。各施肥处理间，常规施肥(处理FT)的N2O排放通量最高，最大排放通量达108.3 g/(hm2·d)，以增施硝化抑制剂吡啶(处理In-2)下N2O排放通量最低，较常规施肥(处理FT)下降31.2%。由图4可见，设施黄瓜菜田全生育期各处理的氧化亚氮(N2O)排放总量差异显著，常规施肥(处理FT)排放总量最大，以减量施肥(处理OPT)最低；减量施肥(OPT)、施用硝化抑制剂DCD(处理In-1)和吡啶(处理In-2)三者的N2O排放总量显著低于常规施肥(处理FT)，降幅分别为28.4%，21.8%，20.6%，三者间差异不显著。
图3 不同施肥处理对设施黄瓜
菜田氧化亚氮(N2O)排放通量的影响
Fig.3 Effect of different fertilization treatments on N2O
emission flux in greenhouse cucumber field
图4 不同施肥处理对设施黄瓜菜田
全生育期氧化亚氮(N2O)排放总量的影响
Fig.4 Effect of different fertilization treatments on
nitrogen loss of N2O emission in greenhouse cucumber field
2.3 硝化抑制剂施用和肥料减施对氨氧化古菌AOA的影响及其与NOx排放量之间的作用关系
2.3.1 不同施肥处理对氨氧化古菌AOA的amoA基因拷贝数的影响 如图5结果显示，在第5年当季施入各处理投入品40 d时，土壤中氨氧化古菌AOA amoA基因拷贝数存在显著差异(P<0.05)。与常规施肥(处理FT)相比，在增施硝化抑制剂DCD(处理In-1)的调控下，土壤中氨氧化古菌AOA amoA基因拷贝数受到了抑制，仅为农民常规施肥(处理FT)的20%；增施吡啶(处理In-2)未对氨氧化古菌AOA的数量产生显著影响；而减量25%施肥(处理OPT)的氨氧化古菌AOA amoA基因拷贝数，与农民常规施肥(处理FT)相比均有明显下降，降幅分别达29.8%，但仍显著高于增施硝化抑制剂DCD(In-1)的处理。结果表明，施用肥料特别是有机肥，会使耕层土壤中氨氧化古菌AOA数量显著提升，但在相同施肥量的条件下，增施硝化抑制剂DCD(处理In-1) ，与常规施肥(处理FT)相比，会显著抑制土壤中氨氧化古菌AOA数量，从而达到了抑制氨氧化作用的目的，减少氮素在农田中的损失。
图5 硝化抑制剂和肥料减施调控下氨氧化古菌
AOA amoA基因拷贝数的差异
Fig.5 The difference of gene copies numbers of
Ammonia-oxidizing archaea(AOA)amoA with nitrification
inhibitor regulation and fertilizer reduction
2.3.2 氨氧化古菌AOA与设施菜田NOx排放量的关系 通过分析氨氧化功能基因与NOx排放量的相关性发现，氨氧化古菌AOA amoA基因拷贝数和设施菜田NOx排放总量之间存在显著的指数型方程关系(图6)，其方程如下：
Y= 121.18e3E-08x,R2=0.840 5, P<0.05
Y是设施菜田单位面积内NOx排放总量，x 是在当季施入各处理投入品40 d时所采集的土壤样品进行的qPCR扩增分析而得的氨氧化古菌AOA的数量。随着氨氧化古菌AOA种群数量的增加，设施菜田NOx排放总量方程锐升的趋势。
图6 设施菜田氧化古菌AOA amoA
基因拷贝数与NOx排放量的相关性
Fig.6 The correlation between gene copies numbers of
Ammonia-oxidizing archaea (AOA)amoA and
NOx emission from greenhouse vegetable soil
with nitrification inhibitor regulation
2.4 硝化抑制剂和减量施肥调控下微生物功能基因响应
图7所示，在硝化抑制剂和肥料减量施用的调控下，对丰度前50位已知的最小单元功能群类的直系同源基因簇进行聚类分析，以进行物种身份与功能通路对应关系比对，对该环境下物种组成功能基因挖掘具有重要意义。PICRUSt预测法分析的结果表明，红色条块代表在对应样本中丰度较高的功能类群，对照KEGG数据库的代谢功能，除不施肥的对照(处理CK)外，减量25%施肥(处理OPT)以及硝化抑制剂(处理In-2)下，烯酰水合酶(Enoyl-CoA hydratase，K01692)、底物结合蛋白(Substrate-binding protein，K02035)和转运系统ATP结合蛋白(Trans-port system ATP-binding protein，K09687)系统代谢通路相关的功能基因相对丰度高，是响应上述调控变化最为敏感的氮循环途径。该发现将为数百个未开发的氮循环功能微生物群落提供有用的见解，为下一步深入研究提高功能微生物的作用效率奠定了坚实基础。
图7 硝化抑制剂和肥料减施调控下土壤微生物
KEGG直系同源基因簇丰度热图
Fig.7 The orthologs gene cluster abundance heatmap of
soil microbe with nitrification inhibitor regulation and
fertilizer reduction based on KEGG Database
2.5 硝化抑制剂调控在设施黄瓜菜田系统下的肥料利用率方面差异分析
由表2可知，减量施肥(处理OPT)的肥料偏生产力是各施肥处理中最高的。5 a间，与常规施肥(处理FT)相比，减量施肥(处理OPT)的肥料偏生产力提升了32.1%～38.2%，且与其他处理差异显著，但后2 a有下降的趋势，有待后续试验观察；增施硝化抑制剂DCD(处理In-1)的偏生产力也较高，与常规施肥(处理FT)相比提升了17.8%～21.9%，且差异显著。结果表明，在该试验土壤肥力水平下，减量施肥和增施硝化抑制剂均可显著提高肥料利用率，其效果排序为减量施肥>增施DCD>增施吡啶。
表2 硝化抑制剂调控下设施黄瓜菜田肥料偏生产力差异分析
Tab.2 Analysis on the difference of partial factor productivity of fertilizer
with nitrification inhibitor regulation in greenhouse cucumber field kg/kg
处理Treatments肥料偏生产力Partial factor productivity of fertilizer20162017201820192020CK-----FT144.8±7.2c95.8±4.7c93.7±3.8c91.6±4.6c90.2±4.1cOPT191.3±7.6a126.6±5.1a129.5±6.4a121.3±5.4a119.8±5.3aIn-1176.6±8.1b113.1±4.5b110.4±3.7b108.9±3.7b106.7±4.2bIn-2171.3±6.9b100.4±3.2b105.2±5.1b101.8±4.5b103.4±3.7b
注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间在 0.05 水平时差异显著，且误差范围在±5%内。
Note：Different small letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level, the error range is within ±5%.
3 结论与讨论
3.1 讨论
对比此前文献报道，Di等[10,19]发现在新西兰高氮草地酸性土壤施用DCD可使放牧草场系统 N2O 气体排放量降低了 75%～80%。Menéndez等[24]在西班牙北部的一种混合的三叶草-黑麦草草场应用DMPP，使N2O和NO的排放量分别减少了29%和25%。Cui 等[25]的研究结果表明，在集约化的蔬菜生产系统的黄棕壤和潮土中，施用 DCD 使得N2O排放因子分别降低了83.8%和72.7%。本试验是在石灰性褐土中的结果，与上述报道的施用DCD可使N2O 气体排放降低趋势一致，而降低的排放量有所差异，推测与试验土壤的理化性质及作物不同相关。并且，本研究涉及的硝化抑制剂对华北石灰性菜田土壤氮氧化物排放(NOx)的作用效果鲜有报道，为本试验的创新性研究结果。
此前报道显示，Di等 [18]在新西兰高氮草地酸性土壤发现DCD可显著抑制氨氧化细菌AOB的数量，但对 AOA 无明显影响，He等[20]在我国南方酸性红壤水稻土发现DCD有显著抑制氨氧化古菌AOA的效果。本试验结果显示，在北方石灰性褐土设施黄瓜菜田中，增施DCD可显著抑制氨氧化古菌AOA种群数量，该结果既与高氮草地酸性土壤结果不同，又与我国南方酸性红壤的土壤性质不同，是对DCD在不同土壤类型pH值及有机质含量等理化性质不同的环境中作用效果的又一有力补充。推测其原因可能在于不同土壤中优势氨氧化菌群对不同硝化抑制剂的敏感性不同有关[21]。并且本试验创新性地揭示了氨氧化古菌AOA amoA基因拷贝数与土壤NOx排放通量之间的函数关系。
该试验创新性发现我国北方石灰性菜田土壤中，响应增施硝化抑制剂和肥料减量调控变化最为敏感的功能微生物氮循环代谢途径，与此前报道对比，虽在微咸水、冰川流及厌氧处理等不同生态系统环境[34-36]中参与氮循环的细菌代谢通路有所差异，但均证实了许多鲜为人知的、具有良好特性的功能细菌的存在。
该试验结果与此前报道的，在栽培基质中、棕壤中减量施肥以及黄棕壤中施用DCD的报道结果接近[25,37-38]。田间条件下上述试验结果的持续再现性如何，还有待进一步验证。
3.2 结论
第一，北方设施黄瓜-土壤菜田系统中，增施硝化抑制剂和减量施肥均能有效降低氮氧化物(NOx)和氧化亚氮(N2O)的排放，特别是在底肥施用期效果最为显著。增施硝化抑制剂DCD(处理In-1)与常规施肥(处理FT)和减量施肥(处理OPT)相比，每年向环境排放的氮氧化物(NOx)排放总量分别减少76.5%和71.8%，减量施肥(处理OPT)和增施DCD分别比常规施肥(处理FT)氧化亚氮(N2O)年排放总量减少28.4%和21.8%。第二，本结果进一步显示，在北方石灰性褐土设施黄瓜菜田中，增施DCD可显著抑制氨氧化古菌AOA种群数量，且综合效果明显优于吡啶；此外，氨氧化古菌AOA对NOx排放起调控作用，氨氧化古菌AOA amoA基因拷贝数与土壤NOx排放通量之间呈指数正相关关系：Y=121.18e3E-08x (R2=0.840 5, P<0.05)，并且随着氨氧化古菌AOA种群数量的增加，NOx的排放通量呈指数锐升。第三，本试验应用高通量Illumina MiSeq平台测序，利用国际通用的PICRUSt工具对16S rDNAV3-V4区基因系列数据进行分析，基于KEGG数据库的鉴定结果显示，在肥料减施(处理OPT)和硝化抑制剂(处理In-2)调控的土壤中，与同化途径相关的烯酰水合酶(K01692)、底物结合蛋白(K02035)以及转运系统ATP结合蛋白(K09687)系统代谢通路相关的功能基因相对丰度高，是响应上述调控变化最为敏感的氮循环途径。第四，与常规施肥(处理FT)相比，5 a间，减量施肥(处理OPT)和增施DCD(处理In-1)的肥料偏生产力分别提升了32.1%～38.2%和17.8%～21.9%。综上所述，在华北集约化设施菜田石灰性褐土中，增施硝化抑制剂和肥料减施可有效减少农田氮源气体排放，会显著抑制氨氧化古菌AOA的数量，显著提高肥料利用率，可有效防控农业面源污染。
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