砀山酥梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)属白梨系统，是我国栽培面积和产量最大的梨品种，该品种果皮颜色黄亮、果大核小、果肉细腻、皮薄多汁，是果品中的名优产品[1-2]。但砀山酥梨在贮藏后期表皮会出现不规则的黑褐色斑点，严重时连成片，甚至蔓延到整个果面，这是一种严重的生理性病害，被称作黑皮病。黑皮病使果实的外观质量严重受损，给梨农和贮藏企业造成了巨大的经济损失[3]。
近年来，众多学者虽对梨黑皮病的发病机理进行了深入研究，但至今尚未建立统一的理论。国内外专家普遍认为，梨黑皮病发生机制与苹果虎皮病相似，果皮中α-法尼烯及其氧化物代谢产物积累是导致黑皮病发生的直接原因[4-6]。另外，多酚物质的氧化褐变、果实醇类酯化失调、自身挥发物质的积累也会导致黑皮病[7]。目前，关于梨黑皮病的研究主要集中在α-法尼烯及其氧化物代谢积累、黑皮病发生的影响因素以及防治等方面，虽有学者对黑皮病发病程度与果实硬度、可溶性固形物、总酚、过氧化物酶等指标进行了研究，发现黑皮病的发生也会使总酚含量、多酚氧化酶活性(PPO活性)等相关生理指标失衡[3]，但有关黑皮病与果实矿质元素、叶绿素荧光参数指标的关系未见报道，因此，本研究对贮藏期不同程度黑皮病的砀山酥梨进行相关特征指标测定，以探索梨黑皮病与相关生理指标的相关性。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试材料为砀山酥梨(套袋)果实，分别于2016年9月21日和2017年9月21日采自山西晋中地区一管理水平中等的果园，树龄10 a，采收时果实硬度为(5.88±0.16)kg/cm，可溶性固形物含量为(12.95±0.21)%，果实采收后运回中国农业科学院果树研究所(辽宁兴城)，选大小均匀、无病虫害、无机械伤的果实放置在(0±1) ℃低温冷库贮藏，待贮藏至第2年4月时进行相关指标调查和测定。
1.2 试验方法
1.2.1 黑皮病分级处理 根据果实黑皮面积占整个果实总面积的百分比分为4级[8]。0级：无黑皮现象发生；Ⅰ级：黑皮面积≤25%；Ⅱ级：25%<黑皮面积≤50%；Ⅲ级：黑皮面积>50%。
1.2.2 测定指标及方法 矿质元素测定：砀山酥梨果实中N含量采用凯氏定氮法测定，P含量采用钼锑钪比色法测定，K含量采用火焰分光光度法测定[9]；Ca、Mg含量采用原子吸收分光光度计法测定[10]。每个指标重复3次测定，每个重复用果20个。
呼吸强度采用SP-9890气相色谱仪(山东，鲁南瑞虹仪器有限公司)测定，参考刘佰霖等[11]方法，载气为高纯N2，压力为0.5 MPa；燃气为空气和氢气，压力分别为0.4，0.2 MPa；转化炉温度为360 ℃；填充柱温度为80 ℃，FID检测器温度为160 ℃。将不同处理果实分别置于同样体积密封塑料盒内，室温(20 ℃)密封1 h后，使用注射器抽取1 mL气体进行测定，每个处理重复3次，每重复用果15个，共计45个果。
乙醇含量采用GC-2010气相色谱仪(日本，岛津公司)顶空进样法测定。测定具体方法为：载气为高纯N2，压力为0.5 MPa；燃气为空气和氢气，流量分别为400，40 mL/min；FID检测器温度为200 ℃。吸取果实匀浆上清液5 mL，放入加有NaCl(1.335～1.350 g)及1 mL蒸馏水的顶空瓶内，然后混匀进行测定。每个处理3次重复，每重复用果20个。
相对电导率(细胞膜透性)采用DDS-320电导仪(上海，康仪公司)测定，参考贾晓辉等[12]方法，稍有改动。用10 mm打孔器分别取20片果皮圆片，将其放入烧杯中，然后加50 mL水测定C0。振荡30 min后测定C1。置于沸水中煮30 min，冷却定容至50 mL，测定C2。果肉、果心取2 mm厚，其余步骤同果皮。相对电导率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%。
总酚含量和多酚氧化酶(PPO)活性测定参照高俊凤[13]的方法，每个级别重复测定5次，每个重复用果9个。
果皮叶绿素荧光参数采用英国 Hansatech公司的 Handy PEA 叶绿素效率仪测定，在果实赤道线两侧选择2个相对的位点，取直径约1.5 cm 的果皮，用样品夹暗处理 30 min，之后依次测定初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)、光化学效率(Fv/Fm)以及PS Ⅱ的潜在活性(Fv/Fo)，测试光强为3 000 μmol/(m2·s)。每个级别重复测定3次，每个重复用果20个。
1.3 数据处理
所有数据均为2 a试验结果的平均值，采用Excel 2016软件进行数据处理，SPSS统计软件进行单因素方差分析，邓肯氏多重差异比较。
2 结果与分析
2.1 砀山酥梨不同等级黑皮病果的矿质元素含量
不同等级黑皮病砀山酥梨果实的主要矿质元素含量见图1。结果表明，果实N含量越高，黑皮病越严重，不同等级果的N元素含量差异显著(P<0.05)，Ⅰ级果实的K、Mg、P含量显著高于其他级别(P<0.05)，其中0级果含量最低。结果还表明，发病程度越高的果实Ca元素含量越低，且各等级果实的Ca含量间存在显著性差异(P<0.05)，0级果(无黑皮病)的Ca含量最高。
2.2 砀山酥梨不同等级黑皮病果的呼吸强度和乙醇含量
由图2可知，对于呼吸强度来说，0级果最低，为14.4 mg/(kg·h)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级果和0级果之间均存在显著差异(P<0.05)，与0级果的呼吸强度相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级果的呼吸强度分别提高了15.3%，43.06%，34.03%；同一等级梨果实其不同部位的乙醇含量由高到低依次为果皮>果心>果肉，0级果实的果皮和果肉乙醇含量均最低，分别为101.34，15.81 mg/kg，二者均显著(P<0.05)低于Ⅲ级果实的果皮和果肉，且果皮乙醇含量也显著低于Ⅰ、Ⅱ级果实的果皮；0级果心的乙醇含量最高，为97.29 mg/kg，显著(P<0.05)高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级果心的乙醇含量。
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2-5同。
Different lowercase letters indicated significant differences(P<0.05).The same as Fig.2-5.
图1 砀山酥梨不同等级黑皮病果的矿质元素含量
Fig.1 Mineral element content of Dangshansu pear superficial scald of different grades
图2 砀山酥梨不同等级黑皮病果的呼吸强度和乙醇含量
Fig.2 The respiration intensity and ethanol content of Dangshansu pear superficial scald of different grades
2.3 砀山酥梨不同等级黑皮病果的相对电导率
由图3可知，同一等级梨果实其不同部位的相对电导率(细胞膜透性)由高到低依次为果肉>果心>果皮，0级果的果皮、果肉和果心相对电导率均最低，分别为13.10%，52.36%，32.78%，且均显著(P<0.05)低于Ⅱ、Ⅲ级果，且果肉相对电导率也显著低于Ⅰ级果。可以看出，黑皮病越严重，果肉相对电导率越高，表明细胞膜损伤越严重，果皮和果心相对电导率在0级果与Ⅰ级病果间无显著差异(P>0.05)。
2.4 砀山酥梨不同等级黑皮病果的总酚含量和PPO活性
由图4可知，同一等级梨果实不同部位的总酚含量由高到低依次为果皮>果心>果肉，0级果的总酚含量最低，其中0级果皮、果心总酚含量与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级果均存在显著差异(P<0.05)，0级果肉总酚含量与Ⅰ级果存在显著差异(P<0.05)，与Ⅱ、Ⅲ级果均无显著差异(P>0.05)；与相对电导率规律一致，发病程度越高的果实其果皮、果肉、果心PPO活性越高，除0级果外，其他等级梨果实其不同部位的PPO活性由高到低依次为果心>果皮>果肉，且各等级果实果皮、果肉和果心的PPO活性之间均存在显著差异(P<0.05)，Ⅲ级果3个部位的PPO活性均显著(P<0.05)高于0、Ⅰ、Ⅱ级果。
2.5 砀山酥梨不同等级黑皮病果的叶绿素荧光参数
由图5可知，无黑皮病(0级)果实的叶绿素荧光各参数(Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo)均显著(P<0.05)高于发病果(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)，表明黑皮病的果实衰老或者受逆境胁迫较严重。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级果之间Fo、Fm、Fv、Fv/Fo差异显著(P<0.05)，而Ⅱ级与Ⅰ级果之间Fv/Fm值差异不显著(P>0.05)。
图3 砀山酥梨不同等级黑皮病果的相对电导率
Fig. 3 The relative electric conductivity of Dangshansu pear superficial scald of different grade
图4 砀山酥梨不同等级黑皮病果的总酚含量和PPO活性
Fig.4 The total phenol content and PPO activity of Dangshansu pear superficial scald of different grade
图5 不同等级黑皮病果实的果皮叶绿素荧光参数
Fig.5 Chlorophyll fluorescence parameters of pericarp of Dangshansu pear superficial scald of different grade
2.6 砀山酥梨不同等级黑皮病与相关生理指标的相关性分析
为明确砀山酥梨的发病程度与果实相关生理指标间的相互关系，以黑皮病不同等级为一个总体，以对应的相关生理指标数据为另一个总体，应用典型相关分析进行统计分析。由表1可知，黑皮病等级与N含量呈极显著正相关(P<0.01)，其相关系数为0.987；而与Ca含量间呈极显著负相关(P<0.01)，其相关系数为-0.991。黑皮病的等级与呼吸强度、乙醇含量(果皮)、电导率(果肉)、总酚含量(果皮和果心)、PPO活性(果皮、果肉、果心)均呈极显著正相关(P<0.01)，其相关系数分别为0.870，0.784，0.986，0.805，0.853，0.924，0.996，0.976；与果肉乙醇含量呈显著正相关(P<0.05)，其相关系数为0.684；而与果心乙醇含量呈极显著负相关(P<0.01)，其相关系数为-0.790。黑皮病的等级与Fo、Fm值呈极显著负相关(P<0.01)，其相关系数分别为-0.977，-0.941；与Fv值呈显著负相关(P<0.05)，其相关系数为-0.673；与Fv/Fm、Fv/Fo呈负相关，但并不显著。
表1 果实生理指标与黑皮病等级的相关系数
Tab.1 Correlation coefficient between the physiological index and the superficial scald grade of fruit
相关生理指标Relatedphysiologicalindicators相关系数Correlationcoefficient相关生理指标Relatedphysiologicalindicators相关系数CorrelationcoefficientK0.221果皮总酚含量Peeltotalphenolcontent0.805∗∗N0.987∗∗果肉总酚含量Pulptotalphenolcontent-0.029Ca-0.991∗∗果心总酚含量Coretotalphenolcontent0.853∗∗Mg0.428果皮PPO活性PPOactivityofpeel0.924∗∗P0.258果肉PPO活性PPOactivityofpulp0.996∗∗呼吸强度Respirationintensity0.870∗∗果心PPO活性PPOactivityofcore0.976∗∗果皮乙醇含量Peelethanolcontent0.784∗∗Fo-0.977∗∗果肉乙醇含量Pulpethanolcontent0.684∗Fm-0.941∗∗果心乙醇含量Coreethanolcontent-0.790∗∗Fv-0.673∗果皮相对电导率Peelrelativeconductivity0.383Fv/Fm-0.380果肉相对电导率Pulprelativeconductivity0.986∗∗Fv/Fo-0.188果心相对电导率Corerelativeconductivity0.442
注：*.在0.05水平上呈显著相关；**.在0.01水平上呈极显著相关。
Note：* .Significantly correlated at the 0.05 level；** .Highly significantly correlated at the 0.01 level.
3 讨论与结论
砀山酥梨贮藏后期果实发生黑皮病的几率很高，严重影响果实的外观和商品价值，易造成极大的经济损失。针对梨黑皮病的发病机制至今不明，Isidoro等[6]在Rocha梨与Spotts等[14]在Anjou梨中的研究发现，随着贮藏时间的增加，共轭三烯呈不断增长趋势，而α-法尼烯的含量在贮藏前期呈上升趋势，但在贮藏后期则不断下降，因此，专家普遍认为是α-法尼烯和其氧化产物的积累导致黑皮病的发生，同时黑皮病的发生导致总酚含量、PPO活性等相关生理指标失衡，初步判断黑皮病发生可能还与其他因素有紧密联系，本研究对此进行了详细研究。
钙元素是植物生长发育必需的营养元素之一，其在植物内含量一般为0.1%～5.0%[15]。本试验研究结果表明，黑皮病发病程度与果实中的Ca含量呈极显著负相关，说明砀山酥梨果实黑皮病的发生与果实中的Ca含量密切相关。本研究还表明，砀山酥梨黑皮病果实中的N、K、Mg、P含量均高于正常果实，其中N含量随着黑皮病发病程度的增加逐渐升高，初步判断，果实中较高的N含量和相对低的Ca含量可能是导致砀山酥梨果实贮藏后期出现黑皮病的主要原因，这与前人研究果实单一性缺钙不一定会导致黑皮病发生，过高的氮含量和钾含量会对钙的吸收产生较强的拮抗作用的结论具有一致性[16-17]。本结论是在2 a重复研究的基础上得出的，虽然进行了重复试验，但样本采自同一果园，下一步需要扩大采集规模，从不同管理水平的多个果园进行测定比较，进一步验证。
还有研究表明，黑皮病与乙烯作用有一定相关性，α-法尼烯的合成是乙烯通过结合受体加快完成的，所以果实的呼吸强度对黑皮病的发生有一定的影响[18]，本试验也表明，随着砀山酥梨果实黑皮病发病程度的增加，其呼吸强度也呈上升趋势，初步判断黑皮现象逐渐加重可能与呼吸强度较高有一定关系。此外本研究通过对砀山酥梨果皮、果肉和果心不同部位的乙醇含量进行测定分析，发现随着黑皮病加重，果皮和果肉部位的乙醇含量增加，果心部位含量下降，可以看出同一果实不同部位发生黑皮病之后，对乙醇含量的影响存在差异，也同样证明了研究果实自身挥发性物质的致病理论具有一定的困难。这与Prasad和Meigh等[19-20]认为黑皮病的发生可能是由自身挥发性物质所引起，但未发现果实内醇、酯含量与黑皮病发生的相关性且致病理论无法进行验证的结论具有一致性。
Rowan和Rupasinghe等[21-22]研究表明，黑皮病产生是由于细胞内部α-法尼烯氧化生成共轭三烯，进而破坏细胞膜结构，引起果皮组织氧化褐变，最终导致表皮层细胞大量死亡。与上述结论一致，本试验中黑皮病等级与果肉部位的相对电导率呈极显著正相关，说明果实黑皮病发生与细胞膜的结构破坏具有密切关系。而果皮部位的相对电导率与黑皮病等级存在一定正相关(r=0.383)，但相关性并不显著，这可能是因为在果实发病初期只是果实的亚表皮的外层细胞轻微褐变，随着黑皮病加重，亚表皮细胞褐变程度增加，并向里扩展到5～6层亚表皮细胞，严重时会使亚表皮细胞解体，内邻的皮层细胞变形，导致果皮凹陷，而表皮细胞一般不受影响[23-24]。果皮相对电导率取样及测定可能主要以果皮表皮细胞为主，而果肉相对电导率取样及测定则是邻近果皮部位的果肉，大多含有果皮内邻的皮层细胞，后期应对果皮相对电导率和果肉相对电导率与黑皮病发生的机制进行深入研究。本试验发现黑皮病等级与果皮、果心总酚含量以及3个部位的PPO活性均呈显著正相关，与鞠志国[25]发现酚类物质含量与黑皮病发生过程存在联系的结果一致。
Mir等[26]研究不同品种苹果虎皮病与叶绿素荧光参数之间的关系，发现当Fv/Fm值由0.78下降到0.70时，果实表面会出现病斑，表明Fv/Fm值可以反映虎皮病的发展状况。与以上研究结果类似但又存在差别，砀山酥梨果实的Fv/Fm值与黑皮病等级呈不显著负相关，但总体而言，无黑皮病果的Fv/Fm值高于黑皮病果，在一定程度上表明黑皮病等级与Fv/Fm值的降低有关，但却不能完全取决于Fv/Fm值下降的程度，这可能由于果实的品种、贮藏环境等存在差异，因而对果实Fv/Fm值的变化趋势产生了影响。
本研究结果表明，黑皮病的发生和矿质元素失调(Ca含量降低，N含量升高)有着紧密的联系，在今后工作中应探寻解决矿质营养失衡的问题，从而指导实际生产中准确平衡施肥，降低果实贮藏期黑皮病的发生。同时黑皮病发病程度的增加，将会使果实的呼吸强度、乙醇含量(果皮)、相对电导率(果肉)、总酚含量(果皮、果心)、PPO活性(果皮、果肉、果心)逐渐增强，果皮叶绿素荧光参数(Fm、Fo)逐渐降低。因此，可通过采前调控矿质营养元素或采后补钙等手段，降低果实贮藏期黑皮病发生，从而提高果实贮藏品质。
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