溶解氧、pH值、氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮等是养殖水质指标的重要参数，直接影响水生生物健康[1]。水产养殖过程中水质可影响养殖品种的成活率、生长特征等[2]，同时养殖品种和养殖密度同样会影响水质[3-4]。网箱养殖方式中，密度胁迫影响鱼类生长状况和水质条件[5-6]。有研究表明，克氏螯虾高密度养殖不仅抑制生长同时造成养殖水质恶化[7]；墨吉明对虾随养殖密度增加存活率降低，水质参数变化幅度增加[8]。罗非鱼养殖模式、养殖密度等与水质参数指标间存在密切关系[9]。水体中氨氮含量过高不仅引起水质恶化，而且会造成水生生物死亡[10]。罗非鱼氨氮急性暴露试验表明，氨氮诱导罗非鱼代谢系统及功能基因的应答变化[11]。Mota等[12]研究表明，循环水养殖系统中总氮含量对大鳞鲆生长影响要高于pH值，高浓度总氮(50 mg/L)和低pH值(5.7)组中大鳞鲆生长指标要显著低于对照组和低总氮(0.5 mg/L)、低pH值组。硝酸盐氮(299.4±5.8)mg/L 28 d暴露可导致斑石鲷体质量下降、死亡率和血浆硝酸盐氮浓度增加，同时产生组织病理学损伤[13]。
水产养殖过程中投喂、肥水、施药等活动所引起的自污染[14]不仅限制养殖品种生长与存活，同样会增加养殖成本，并造成环境污染。养殖水体具有一定自身净化能力，但当养殖密度过高时养殖水体自身净化能力有限，如不能妥善解决将引起水体富营养化、缺氧等状况发生[15]。养殖水体微生物多样性与养殖环境中物质能量代谢密切相关，菌群结构及多样性与养殖品种、养殖密度、水质参数等均密切相关。本研究开展了养殖密度试验，通过水质指标测定和养殖水体生物多样性分析确定罗非鱼养殖过程中自污染的形成，探讨通过合理的养殖密度降低养殖过程中自污染，提高养殖品种品质。
1 材料和方法
1.1 试验材料
罗非鱼(Oreochromis niloticus)饲养于北京市水产科学研究所小汤山基地，选取规格一致(体质量(25.75 ± 6.89)g，体长(11.77 ± 0.57)cm)罗非鱼作为试验对象，每天投喂2次，分别于9：00和15：00各投喂1次，投喂量为鱼总质量3%。
1.2 试验方法
设置罗非鱼养殖密度梯度，0.8 m3养殖池中分别放置低密度(30尾)，中密度(60尾)和高密度(120尾)，每个养殖密度设3个平行。养殖水体氨氮、硝态氮、亚硝态氮、浊度等由美国哈希DR900便携式多参数比色计测定。温度、溶解氧、pH值和硬度由美国哈希HQ40d便携式多参数分析仪测定。养殖水体参数指标每3 d检测1次。30 d养殖试验结束后，测量罗非鱼体长、体质量等生长指标，取其肝脏和鳃用于组织病理学分析，取4 L养殖水体用0.22 μm滤膜过滤，滤膜冻存于-80 ℃用于微生物群落多样性分析。
肝脏和鳃组织样品保存于4%多聚甲醛(南京建城)，按照脱水、包埋、切片、复水、染色和封片等一系列步骤进行组织切片制备[16]。通过Olympus BX51进行显微观察，通过Olympus U-TV0.63XC进行显微拍照。
水体菌群多样分析通过细菌16S rDNA V3-V4区扩增，Illumina Miseq平台测序及数据分析获得。引物序列：Primer1 5′-3′：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA；Primer2 5′-3′：GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT。扩增程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，60 s，30次循环；72 ℃，7 min，4 ℃。
1.3 数据统计与分析
试验数据通过IBM SPSS Statistics 21软件进行分析，并制作载荷图；SigmaPlot 12.0用于制作水质指标变化图。
2 结果与分析
2.1 罗非鱼养殖密度对生长指标影响
不同养殖密度对罗非鱼体长、体质量、肥满度、肝脏指数等生长指标存在影响(表1)。30 d养殖试验结果表明，随养殖密度增加，罗非鱼体长、体质量、肥满度、肝脏指数均呈现下降趋势，虽未达显著差异(P>0.05)，但这一趋势可能随养殖时间延长而更显著。
表1 罗非鱼养殖密度试验生长指标
Tab.1 Growth indexes of tilapia in different density culture
注：同列相同字母表示无显著性差异(P>0.05)。
Note：The same lowercase letters in the same column indicate no significant difference(P>0.05).
样品Samples体长/cmBody length体质量/gWeight肥满度Condition factor肝脏指数Hepatic index低密度 Low density12.7±1.5a39.6±6.0a1.9±0.2a1.15±0.40a中密度 Medium density12.6±1.5a36.3±5.1a1.8±0.1a1.03±0.38a高密度 High density12.5±1.4a33.8±3.6a1.7±0.1a0.76±0.21a
2.2 罗非鱼养殖密度对组织学影响
不同养殖密度罗非鱼肝脏和鳃等器官外观无异常。组织病理学结果显示，不同养殖密度对罗非鱼肝脏组织无显著影响，但鳃组织存在变化(图1)。低密度养殖组鳃丝排列正常，中密度养殖组鳃小叶变形扭曲、部分末端膨大甚至鳃小叶脱落，高密度养殖组未观测到鳃小叶。鳃是水生动物重要的呼吸器官，也是环境污染物的直接接触器官。郝小凤等[17]发现氨氮对泥鳅存在急性毒性，且泥鳅的死亡率与水体氨氮浓度呈正相关，同时21 d氨氮亚慢性暴露可导致泥鳅鳃组织损伤。水体中的高浓度的氨氮可导致草鱼鳃组织细胞排列和结构异常[18]，团头鲂幼鱼鳃组织96 h内随氨氮胁迫时间延长，鳃组织损伤加重[19]。养殖水体中的氨氮、亚硝态氮等物质可以导致鱼类鳃组织损伤、降低载氧能力。
A.低密度养殖组罗非鱼肝脏组织；B.中密度养殖组罗非鱼肝脏组织；C.高密度养殖组罗非鱼肝脏组织；D.低密度养殖组罗非鱼鳃；E.中密度养殖组罗非鱼鳃；F.高密度养殖组罗非鱼鳃。
A.Tilapia hepatic tissue in low density culture group；B.Tilapia hepatic tissue in medium density culture group；C.Tilapia hepatic tissue in high density culture group；D.Tilapia gill tissue in low density culture group；E.Tilapia gill tissue in medium density culture group；F.Tilapia gill tissue in high density culture group.
图1 罗非鱼不同密度养殖组肝脏及鳃组织切片
Fig.1 Slices of hepatic and gill tissue of tilapia cultured with different densities
2.3 罗非鱼养殖密度对水质参数影响
不同罗非鱼养殖密度对养殖水体溶解氧、pH值、电导率、氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的影响规律基本一致(图2)。养殖水体中溶解氧含量随养殖密度增加而降低(P<0.05)，pH值随养殖密度增加而降低，电导率随养殖密度增加而升高。养殖周期内，高密度组水体氨氮含量高于低密度和中密度组，但15 d后不同养殖密度组的养殖水体中氨氮含量均下降，养殖水体中氨氮含量随养殖时间延长呈下降趋势。养殖周期内从第15 d至第27 d，高密度养殖组中亚硝酸盐氮和硝酸盐氮含量远高于低密度和中密度组(P<0.05)；第30 d高密度组养殖水体中亚硝酸盐氮含量较第27 d显著下降，但硝酸盐氮含量仍呈增加趋势。强俊等[20-21]发现罗非鱼养殖密度与氨氮、亚硝酸盐等存在互作效应。水质参数相关系数矩阵(表2)及载荷图(图3)显示，随养殖密度增加指标间相关性有所变化。不同养殖密度组水体硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均为中等强度相关；低密度和高密度组溶解氧与氨氮呈负中等强度相关，中密度组中溶解氧与氨氮呈负极强相关。养殖环境中，氨氮通过微生物作用转化为亚硝酸盐氮，过量的亚硝酸盐进入鱼体后可导致鱼类血红蛋白携氧能力下降，甚至功能性贫血[22]。
2.4 罗非鱼养殖水体细菌多样性
16S rDNA测序结果表明中密度组OUT数目最多，但不同养殖密度水体中细菌的丰富度和多样性无显著差异(表3)，进一步分析发现不同养殖密度对罗非鱼养殖水体中菌属种类无影响，但不同养殖密度组的养殖水体菌属丰度有差异。养殖水体排名前10的菌属分别为黄杆菌属、新鞘脂菌属、hgcl_clade、大单胞菌属、沉积物杆菌属、伯克氏菌属、鲸杆菌属、多核菌属、红杆菌属和假单胞菌属(表4)。黄杆菌属在罗非鱼养殖水体中为优势细菌，其比例高于新鞘脂菌属、hgcl_clade、大单胞菌属、沉积物杆菌属等。黄杆菌属在生活污水处理、污染物降解中多有应用[23-24]；Ottowia具有反硝化能力[25]，是废水中的优势菌属之一[26-27]；嗜冷硝化菌(Candidatus nitrotoga)可适应在低温环境下生长，可替代Nitrospira的菌属[28]。中华绒螯蟹养殖水体中可培养优势细菌属中亦有假单胞菌属和黄杆菌属[29]，但黄杆菌属和假单胞菌属的潜在致病性亦不可忽视。新鞘脂菌属具有广泛的存在性，在湖泊[30]、温泉[31]等水体中多有检出，部分新鞘脂菌属和假单胞菌属细菌亦具有反硝化能力[32]。hgcl_clade属于放线菌门，具有广泛的分布[33-35]，据报道在鱼菜共生养殖池塘中亦是主要菌属[36]。本研究中养殖水体富含无机氮，水体中优势菌属具有污染物降解能力，可见水体自净能力与微生物群落有密切联系。
同次采样中不同字母表示显著性差异(P<0.05，n=3)。
Different letters in the same sampling times represent significant difference(P<0.05，n=3).
图2 罗非鱼养殖水体水质指标变化
Fig.2 Changes of water quality indicators of tilapia aquaculture
表2 不同养殖密度组水质指标相关系数矩阵
Tab.2 Correlation matrix of water quality indicators at different rearing densities
组别Group水质指标Water quality index溶解氧Dissolved oxygenpH值pH value电导率Conductivity氨氮Ammonia nitrogen亚硝酸盐氮Nitrite nitrogen硝酸盐氮Nitrate nitrogen低密度溶解氧 1.0000.2730.028-0.463**0.0210.356*Low densitypH值0.2731.0000.411*0.0820.1840.110电导率0.0280.411*1.0000.0890.2940.180氨氮-0.463**0.0820.0891.000-0.088-0.478**亚硝酸盐氮0.0210.1840.294-0.0881.0000.467**硝酸盐氮0.356*0.1100.180-0.478**0.467**1.000中密度溶解氧 1.0000.3450.091-0.818**-0.719**-0.192Medium densi-typH值0.345*1.0000.393*0.071-0.194-0.107电导率0.0910.393*1.0000.150-0.136-0.293
表2(续)
注：*.P < 0.05；**.P < 0.01。
组别Group水质指标Water quality index溶解氧Dissolved oxygenpH值pH value电导率Conductivity氨氮Ammonia nitrogen亚硝酸盐氮Nitrite nitrogen硝酸盐氮Nitrate nitrogen氨氮-0.818**0.0710.1501.0000.649**0.169亚硝酸盐氮-0.719**-0.194-0.1360.649**1.0000.577**硝酸盐氮-0.192-0.107-0.2930.1690.577**1.000高密度溶解氧 1.0000.1760.247-0.484**0.2060.528**High densitypH值0.1761.0000.1320.226-0.386*-0.279电导率0.2470.1321.0000.2710.040-0.120氨氮-0.484**0.2260.2711.000-0.371*-0.461**亚硝酸盐氮0.206-0.386*0.040-0.371*1.0000.436**硝酸盐氮0.528**-0.279-0.120-0.461**0.436**1.000
A.低密度组水质参数载荷，lowDO、lowEC、lowpH、lowNH3N、lowNO2N和lowNO3N分别代表低密度组溶解氧、电导、pH值、氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮；B.中密度组水质参数载荷，mediumDO、mediumEC、mediumpH、mediumNH3N、mediumNO2N和mediumNO3N分别代表中密度组溶解氧、电导、pH值、氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮；C.高密度组水质参数载荷，highDO、highEC、highpH、highNH3N、highNO2N和highNO3N分别代表高密度组溶解氧、电导、pH值、氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。
A.Load diagram of water quality indicators in low density，lowDO，lowEC，lowpH，lowNH3N，lowNO2N and lowNO3N represent dissolved oxygen，conductivity，pH value，ammonia nitrogen，nitrite nitrogen and nitrate nitrogen，respectively；B.Load diagram of water quality indicators in medium density，mediumDO，mediumEC，mediumpH，mediumNH3N，mediumNO2N and mediumNO3N represent dissolved oxygen，conductivity，pH value，ammonia nitrogen，nitrite nitrogen and nitrate nitrogen，respectively；C. Load diagram of water quality indicators in high density，highDO，highEC，highpH，highNH3N，highNO2N and highNO3N represent dissolved oxygen，conductivity，pH value，ammonia nitrogen，nitrite nitrogen and nitrate nitrogen，respectively.
图3 不同密度养殖水体水质参数载荷
Fig.3 The spot of the first and second principal component scores of water quality indicators
表3 在97%相似度水平上样品中细菌的丰富度和多样性指数
Tab.3 Richness and diversity index of bacteria in samples at the 97% similarity level
注：同列不相同字母表示有显著性差异(P < 0.05)。
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P < 0.05).
样品Samples可操作分类单元OTUsChao1值Chao1香农指数Shannon辛普森指数Simpson低密度 Low density1 026±121a1 548.50±138.77a5.26±0.64a0.89±0.05a中密度 Medium density1 447±170b1 547.93±430.67a5.46±0.80a0.90±0.02a高密度 High density1 176±179a1 296.30±253.31a4.36±1.40a0.82±0.14a
3 结论与讨论
养殖密度梯度试验表明，罗非鱼生长指标未达显著性差异，但呈现出随养殖密度增加而下降，这一趋势很可能随养殖周期延长明显。有研究表明，黄颡鱼增重率、特定生长率等指标随养殖密度增加而降低，水体中亚硝态氮含量增加[37]。罗非鱼肝脏组织无显著变化，但随养殖密度增加鳃组织呈现损伤。有研究表明，氨氮暴露可导致团头鲂[19]、对虾[38]等水生动物鳃组织发生病理学损伤，亚硝酸盐氮也可导致多种水生动物鳃组织损伤[39-40]。因此，中密度和高密度组罗非鱼鳃组织损伤与养殖水体中氨氮和亚硝酸盐氮相关。罗非鱼高密度养殖组水体中亚硝酸盐氮和硝酸盐氮含量随时间增加呈增加趋势，但氨氮含量显著降低，这一结果与养殖水体菌群结构相关。养殖水体中具有硝化作用的菌群可以较好地
表4 罗非鱼养殖水体中细菌多样性及丰度
Tab.4 Bacterial diversity and abundance in aquaculture water of tilapia %
序号Number属类Genus低密度Low density中密度Mediumdensity 高密度Highdensity 1黄杆菌属 18.9520.3315.102新鞘脂菌属5.2514.5012.933hgcl_clade6.3312.6512.144大单胞菌属1.471.5111.835沉积物杆菌属4.081.043.536伯克氏菌属0.657.180.737鲸杆菌属2.422.321.488多核菌属1.510.691.579红杆菌属0.020.762.8810假单胞菌属0.222.570.8711气单胞菌属2.380.100.0312Nordella1.780.070.0013不可培养的0.570.700.5014琼胶分解0.930.360.1215贪噬菌0.690.280.3816噬菌蛭弧菌属0.570.450.2017Candidatus_Aqui-luna0.440.090.6818Fluviicola0.030.011.0619氢噬胞菌属0.310.240.4520拟杆菌 0.400.370.2121Pseudarcicella0.870.020.0122木洞菌属0.420.270.0423嗜冷硝化菌0.040.010.6724生丝微菌属0.250.350.0725厌氧粘细菌0.040.210.3626罗尔斯通氏菌0.050.200.3527硫化细菌0.040.220.3030Reyranella0.100.240.1731苯基杆菌属0.050.100.3632未分类菌属43.1524.1224.2733其他5.998.036.69
控制水体中氨氮含量[41]，微生物群落可促进养殖废水中的氮转化。不同养殖密度的水体中菌群丰度存在差异，其中优势菌属主要以黄杆菌属、新鞘脂菌属、hgcl_clade、大单胞菌属等为主，而上述菌属多具备污染物降解能力，这一特性与水体自净能力相关。中、低密度养殖组水质参数无显著差异，但高密度组中无机氮类含量要高于其他两组。因此，过高的养殖密度不利于鱼类生长，罗非鱼中等养殖密度下保证足够的供氧量可促进水体中无机氮的降解，结合有效的水处理可保证鱼类生长，也能带来最大化的经济效应。
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