牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起黏膜病/牛病毒性腹泻的主要致病原，为单股正链RNA病毒，与猪瘟病毒(CSFV)和绵羊边界病毒(BDV)同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)[1-2]。BVDV主要感染牛，也感染猪、山羊、绵羊和鹿等其他动物[3]。BVDV感染可导致怀孕母牛流产，早期胚胎坏死，胎儿发育迟缓或畸形，腹泻，慢性消耗综合征，致命性的黏膜疾病以及呼吸、免疫、生殖系统的疾病等[4]。此外，怀孕期间的母畜感染BVDV可引起新生动物的持续性感染(Persistently infected，PI)，PI动物血清抗体虽呈阴性，但其终身携带病毒，并不断向周围环境排放病毒[5]，是BVDV传播的主要来源，因此，对养殖业造成极大危害。
依据BVDV在细胞上是否引起细胞病变，BVDV可分为非细胞病变型(Noncytopathic，NCP)和致细胞病变型(Cytopathic，CP)[6-7]。根据5′-UTR基因序列差异，BVDV可分为2种基因型，即：BVDV-1型和BVDV-2型[8]。其中BVDV-1型目前已鉴定出21个亚型(1a-1u)[9-10]，BVDV-2型已鉴定出4个亚型(2a-2d)。此外，欧洲病牛血清中还发现另一种新BVDV基因型，即：HoBi样BVDV-3型，该基因型又可分为Thai源和Brazilian源2种亚型[11]。BVDV分子流行病学表明，我国存在BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-1c、BVDV-1d、BVDV-1m、BVDV-1o、BVDV-1p、BVDV-1q、BVDV-2a和BVDV-2b亚型的流行毒株[12-14]，但主要流行BVDV-1b和BVDV-1m亚型。目前，该病在世界范围内广泛流行，给全球畜牧业造成了严重的经济损失[15]。此外，牛血清在细胞培养及生物制品研发过程中广泛应用，如果血清中有NCP型BVDV的感染，将对生物制品行业产生很大的安全隐患。
本研究从甘肃某牛场采集腹泻牛粪便样品，并成功分离到1株BVDV-1a亚型毒株，不仅丰富了我国BVDV的分子流行病学数据，为该地区BVDV的防控提供了一定的参考依据，也为BVDV的致病机制的研究及疫苗研制奠定了坚实基础。
1 材料和方法
1.1 病毒、细胞与病料样品
BVDV NADL毒株采购自中国兽医药品监察所；牛肾细胞(MDBK)采购自中国科学院上海细胞库；DH5α感受态购自宝生物工程(大连)有限公司；牛腹泻粪便样品采集自甘肃地区某奶牛养殖场。
1.2 主要试验试剂
MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、RT-PCR试剂盒、pMD18-T Vector、DNA凝胶回收试剂盒、DL1000 Maker均购自宝生物工程(大连)有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购自美国GIBCO公司；FITC标记的BVDV荧光抗体采购自美国VMRD公司。
1.3 引物
用于扩增BVDV 5′-UTR与Npro的引物参考张康等[16-17]合成的引物，引物的详细资料见表1。
表1 扩增BVDV 5′-UTR与Npro的引物
Tab.1 Primers for amplifying BVDV 5′-UTR and Npro
引物名称Primer name引物序列(5'-3')Primer sequences片段大小/bpFragment size5'-UTR5'-GCCATGCCCTTAGTAGGACT-3' 2795'-GCCATGTACAGCAGAGAT-3'Npro 5'-CTCTGCTGTACATGGCACAT-3'524 5'-GAGCAGCTGTGACCCATA-3 '
1.4 处理和鉴定病料样品
在牛粪便样品中加入适量的PBS缓冲液，充分溶解悬浮后，迅速离心收集上清液。根据病毒RNA提取试剂盒的指示，从上清液中提取RNA，然后进行RT-PCR扩增病毒5′-UTR，扩增产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，从而确定BVDV阳性的样品。
1.5 病毒分离培养
在鉴定为BVDV阳性的粪便样品中加入适量的PBS缓冲液，经充分溶解悬浮后，低速离心收集上清液，上清液经0.22 μm滤膜过滤除菌后，接种于已长成单层的MDBK细胞，37 ℃吸附2 h后补加含2%胎牛血清的DMEM维持液于37 ℃、5% CO2条件下培养3 d，每天观察细胞病变情况。同时设立阴性对照组，即不接种粪便样品处理液的MDBK细胞。连续盲传至12代，提取病毒RNA，用RT-PCR技术扩增BVDV 5′-UTR和Npro片段。RT-PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收后克隆至pMD18-T载体，将鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.6 免疫荧光检测
将盲传12代的病毒接种于长满单层MDBK细胞的24孔板中，不接种病毒的正常细胞为阴性对照，接种NADL毒株的孔为阳性对照。将24孔板置于37 ℃、5% CO2 培养箱中培养12 h后，弃营养液，PBS洗涤3次后，用4%多聚甲醛固定细胞；PBS洗涤3次后，根据BVDV的FITC法结合荧光抗体染色法，分别对试验组和对照组细胞进行染色；PBS洗涤3次后，用DAPI染色细胞核；PBS洗涤3次后，将24孔板置荧光显微镜下观察细胞染色情况。
1.7 TCID50测定
将第12代细胞培养物上清用不含血清的DMEM营养液进行10倍系列稀释，在长满单层MDBK细胞的96孔板中，以100 μL/孔接种各稀释度的样品，每个稀释度接种8孔，同时设立未接种BVDV的正常MDBK细胞作为阴性对照，置于37 ℃、5% CO2 条件下培养。12 h后，按照BVDV的FITC结合荧光抗体说明方法对所有MDBK细胞染色，并记录每孔荧光反应结果及其稀释度，根据Karber公式计算分离病毒的TCID50。
1.8 遗传进化分析
用DNAStar软件对第12代BVDV分离株的5′-UTR和Npro核苷酸序列与GenBank中已公布的BVDV各亚型的参考毒株和瘟病毒参考毒株进行比对分析，并在MEGA 7.0软件中采用邻接法绘制系统进化树。
2 结果与分析
2.1 分离株的培养特性和RT-PCR检测结果
将RT-PCR和序列分析检测为BVDV阳性的粪便样品经处理后在MDBK细胞上连续盲传至12代产生典型的细胞病变(图1)，表明分离到的病毒株可能为导致细胞病变的CP型BVDV病毒株。将第12代细胞培养物收集后提取RNA，进行5′-UTR和Npro基因的RT-PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，结果表明，分离培养物与BVDV NADL株均能在279(5′-UTR)，524 bp(Npro)处分别出现特异性条带，且与预期大小一致(图2)，而阴性对照无任何条带。将扩增片段的测序结果在GenBank上进行Blast比对分析，结果表明，该分离株为 BVDV，将其命名为BVDV-GSLY株。
A.BVDV F12在MDBK细胞上产生细胞病变；B.MDBK健康细胞对照。
A.The cytopathic effect of BVDV F12 on MDBK cells；B.Normal MDBK control.
图1 BVDV感染MDBK细胞产生细胞病变(200×)
Fig.1 The cytopathic effect of BVDV on MDBK cells(200×)
2.2 分离病毒的免疫荧光试验鉴定与TCID50测定
将从病料样品中获得的BVDV-GSLY株和BVDV NADL株病毒液分别接种于MDBK细胞，培养12 h后，利用FITC结合荧光抗体对MDBK细胞进行染色，并置于荧光显微镜下观察。结果显示：未接种BVDV的正常MDBK细胞中没有荧光产生(图3-A)，而BVDV NADL株(图3-B)和 BVDV-GSLY株(图3-C)感染的细胞胞浆中均可见特异性绿色荧光，表明该分离物是BVDV。用该方法检测病毒滴度，结果表明，BVDV-GSLY分离株的第12代细胞培养上清中病毒滴度可达107.8 TCID50/0.1 mL。
M.DL1000 Maker；1.BVDV-GSLY株5′-UTR扩增产物；2.NADL株5′-UTR扩增产物；3.阴性对照5′-UTR扩增产物；4.BVDV-GSLY株Npro扩增产物；5.NADL株Npro扩增产物；6.阴性对照Npro扩增产物。
M.DL1000 Maker；1.RT-PCR product of BVDV-GSLY 5′-UTR；2.RT-PCR product of NADL 5′-UTR；3.RT-PCR product of 5′-UTR gene of negative control；4.RT-PCR product of BVDV-GSLY Npro；5.RT-PCR product of NADL Npro；6.RT-PCR product of Npro gene of negative control.
图2 BVDV-GSLY株5′-UTR和Npro RT-PCR扩增结果
Fig.2 RT-PCR amplification of 5′-UTR and Npro of BVDV-GSLY strain
2.3 分离病毒的遗传进化分析
利用DNAStar软件中的MegAlign对BVDV-GSLY株5′-UTR核苷酸序列与GenBank中已公布的BVDV各亚型参考毒株及瘟病毒属的参考毒株进行核苷酸同源性分析，并用MEGA 7.0对BVDV-GSLY株5′-UTR基因序列与参考毒株序列绘制系统发生树。结果表明，BVDV-GSLY株的5′-UTR与HLJ-10(BVDV-2)、Italy-1/10-1(BVDV-3)、X818(BDV)、CSFV-BR-DAR-039/2009(CSFV)5′-UTR核苷酸序列相似性较低，分别为77.9%，74.2%，73.8%，75.0%，与NADL(BVDV-1)的5′-UTR核苷酸序列同源性较高，为95.4%。系统发生树结果也表明，分离株BVDV-GSLY与BVDV-2、BVDV-3、BDV和CSFV均不在同一进化分支上，亲缘关系较远，但与BVDV-1的9株参考毒株的亲缘关系较近，且与BVDV-1亚型的NADL株处于同一进化分支上(图4-A)。因此，BVDV-GSLY株为BVDV-1型。
A.阴性对照；B.NADL株；C.BVDV-GSLY株。
A.Negative control；B.NADL strain；C.BVDV-GSLY strain.
图3 BVDV-GSLY免疫荧光鉴定(200×)
Fig.3 Immunofluorescence of BVDV-GSLY in MDBK cells(200×)
为进一步确定BVDV-GSLY株的亚型，将BVDV-GSLY株的5′-UTR和Npro序列与GenBank 中各型BVDV参考毒株相应序列进行遗传进化分析，结果表明，BVDV-GSLY株5′-UTR与Npro核苷酸序列的遗传进化关系基本相同，BVDV-GSLY株与美国的SD1株位于同一分支，亲缘关系最近(图4-B、C)。5′-UTR和Npro核苷酸序列同源性分析也表明，BVDV-GSLY株与SD1株5′-UTR和Npro核苷酸序列相似性较高(分别为95.5%，91.5%)，与其他亚型病毒株的核苷酸序列相似性较低(分别为84.27%～93.0%，73.3%～82.1%)，表明BVDV-GSLY株属于BVDV-1a亚型。
3 讨论
牛病毒性腹泻(BVD)是严重危害世界养牛业的重要疾病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为三类动物疫病[18]。1980年，我国首次分离到该病毒。近年来，流行病学调查表明我国大部分地区都有BVDV感染的报道，且牛、猪、鹿、羚羊等均不同程度的感染BVDV，该病已成为严重影响我国畜牧业健康发展的重要疫病之一[19]。本研究通过对甘肃某牛场中牛粪便样品进行检测，对RT-PCR鉴定为BVDV阳性的样本进行细胞接种、RT-PCR检测和免疫荧光试验，成功分离到1株BVDV(命名为BVDV-GSYL)，该毒株在MDBK细胞上连传12代，可产生明显的CPE，证明BVDV-GSYL株为CP型。
A.BVDV 5′-UTR 基因的系统进化树；B.BVDV-1型5′-UTR 基因的系统进化树；C.BVDV-1型Npro基因的系统进化树。
A.The phylogenetic tree based on 5′-UTR of BVDV strains；B.The phylogenetic tree based on 5′-UTR of BVDV-1 strains；C.The phylogenetic tree based on Npro of BVDV-1 strains.
图4 BVDV-GSLY与参考毒株的遗传进化关系
Fig.4 Phylogenetic analysis of BVDV-GSLY and reference strains
由于BVDV 5′ UTR在BVDV基因组中相对保守，因此，常用该基因对BVDV进行分型。此外，在BVDV基因组中，具有较高的保守性的Npro基也可用于基因分型[20]。本研究用BVDV 5′ UTR基因和Npro基因的特异性引物经RT-PCR扩增BVDV-GSYL株的5′ UTR基因和Npro基因，其扩增产物分别为279，(5′-UTR)，524 bp(Npro)，与预期大小一致。分别将BVDV-GSYL株的5′ UTR基因序列和Npro基因序列与GenBank中已公布的参考毒株的对应序列进行比较，绘制系统进化树，分析表明，BVDV-GSYL株与美国的SD1株同源关系最近(5′-UTR和Npro核苷酸序列同源性分别为95.5%，91.5%)，系统进化树也显示分离毒株BVDV-GSYL与SD1株位于同一分支，均属于BVDV-1a亚型。
根据以往报道，在甘肃地区肉牛中曾检测到BVDV-1u毒株，而本次研究为首次从该地区奶牛中分离得到BVDV-1a亚型毒株，且该毒株与先前研究的BVDV病毒株之间存在显著差异。随着甘肃地区荷斯坦奶牛地不断引进，与SD1株具有较高同源性的BVDV-GSLY 株可能已成为甘肃地区奶牛源致病型BVDV的主要流行株。
本研究从牛粪便样本中分离鉴定了1株BVDV-1a 型病毒，为我国甘肃地区BVDV病毒株的流行情况提供了可靠依据，对牛病毒性腹泻病的预防和诊治以及BVDV的致病机制的研究等方面奠定了参考基础。
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