烟草黑胫病是由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的一种毁灭性土传病害，常导致烟草根和茎基部坏死、植株变黄凋萎，严重影响烟草的产量和品质。烟草疫霉属于藻菌界卵菌门卵菌纲霜霉目霜疫霉科疫霉属，主要以菌丝体和厚垣孢子随病残体在土壤中越冬，翌年条件适宜时，病菌产生孢子囊和游动孢子完成初侵染，经风、雨传播进行再侵染[1-2]。烟草黑胫病在我国除黑龙江省外的其他烟区普遍发生，其中河南省为历史上的重病区，近年来随着连作烟田面积的扩大和连作年限的延长，该病害逐年加重[3-4]。目前国内外已发现烟草疫霉存在4个生理小种(0、1、2、3)，我国已报道的烟草疫霉生理小种有0和1号小种[5-7]，河南省以1号小种为优势小种[8-10]。近年来，DNA分子标记技术在真菌的遗传多样性分析方面得到广泛应用[11-12]，已报道的河南省烟草疫霉多数菌株的遗传分化水平较低[10，13-14]。目前，对河南省烟草疫霉群体遗传结构的深入研究较少，本研究拟利用随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)分子标记对河南省烟草疫霉的遗传多样性与遗传结构进行系统研究，旨在明确河南省烟草疫霉群体的遗传多样性水平和遗传结构组成，为有效防控烟草黑胫病提供理论指导。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
本研究所用的菌株由河南科技大学植物检疫实验室提供，菌株的采集信息见表1。
表1 供试烟草疫霉菌株的采集信息
Tab.1 Collecting information of tested P. nicotianae isolates
菌株Isolate采集地Source年份Year菌株Isolate采集地Source年份YearPN01三门峡市卢氏县2013PN16周口市鹿邑县2013PN33三门峡市卢氏县2014PN17洛阳市洛宁县2013PN02三门峡市卢氏县2013PN18洛阳市洛宁县2013PN04濮阳市濮阳县2013PN36洛阳市洛宁县2014PN34濮阳市濮阳县2014PN19洛阳市洛宁县2013PN05南阳市邓州市2013PN20商丘市睢阳区2013PN06南阳市邓州市2013PN21洛阳市嵩县2013PN07许昌市襄城县2013PN22平顶山市郏县2013PN35许昌市襄城县2014PN23平顶山市郏县2013PN08郑州市登封市2013PN24平顶山市郏县2013PN09郑州市登封市2013PN25漯河市舞阳县2013PN10郑州市登封市2013PN26济源市2013PN11三门峡市渑池县2013PN37济源市2013PN12三门峡市渑池县2013PN27洛阳市宜阳县2013PN13三门峡市渑池县2013PN28洛阳市宜阳县2013PN14周口市鹿邑县2013PN29洛阳市宜阳县2013PN15周口市鹿邑县2013PN30驻马店市确山县2013
1.2 DNA的提取
烟草疫霉菌株接种于10%V8液体培养基(V8汁100 mL，蒸馏水900 mL，CaCO3 3 g)中25 ℃黑暗培养，5 d后过滤收集菌丝，经液氮研磨成粉末状，然后采用CTAB法[15]提取DNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。
1.3 RAPD-PCR反应
RAPD-PCR反应体系(25 μL)：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，引物(10 μmol/L) 2 μL，模板DNA 0.5 μL，添加ddH2O至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性60 s，36 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，36个循环，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。每个引物的扩增重复2～3次，PCR产物通过加入溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照记录。
1.4 数据分析
将电泳图中条带的有无作为统计参数，有条带的标记为1，无条带的标记为0。使用POPGENE 1.31 软件[16]计算主要遗传多样性参数：观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon信息指数；采用NTSYS-pc 2.10软件[17] 计算各菌株间的遗传相似系数，并进行基于非加权平均法(Unweighted pair-group method arithmetic average，UPGMA)聚类分析和主成分分析；利用STRUCTURE2.3软件[18]基于贝叶斯模型分析烟草疫霉的遗传结构。选用混合祖先模型，设定群体数目K=1～10，不作数迭代(Length of burn-in period)为10 000次，不作数迭代后的MCMC(Markov Chain Monte Carlo)为100 000次，每个K值进行10次重复计算，参考Evanno的方法确定最适K值[19]，计算Q值并绘制遗传结构图。
2 结果与分析
2.1 遗传多样性分析
采用已选定的6条RAPD引物对34个烟草疫霉菌株进行扩增，结果显示，总的DNA条带数为30个，其中多态性条带数为27个，多态性比率为90%(表2)；引物RAPD04的扩增条带数和多态性条带数均最多，为9，其扩增情况见图1。利用POPGENE 1.31 软件计算得出，观测等位基因数为1.900 0，有效等位基因数为1.485 1，Nei’s基因多样性指数为0.271 0，Shannon信息指数为0.402 8。这些参数的数值整体偏低，说明河南省烟草疫霉的遗传多样性水平较低。
M.DL5000 DNA Marker;1-34.烟草疫霉菌株。
M.DL5000 DNA Marker; 1-34.P.nicotianae isolates.
图1 引物RAPD04对34株烟草疫霉的扩增结果
Fig.1 Amplification of 34 P. nicotianae isolates by primer RAPD04
表2 所用的RAPD引物
Tab.2 RAPD primers used
引物Primer序列Sequence扩增条带数Amplified bands多态性条带数Polymorphic bandsRAPD04TTGGCACGGG99RAPD07CAGGCCCTTC32RAPD11AGGGGTCTTG76RAPD13TCAGGGAGGT33RAPD15GTCTCCGCAA44RAPD18CCCAAGGTCC43
2.2 UPGMA聚类分析
利用NTSYS-pc 2.10软件计算34个烟草疫霉菌株之间的遗传相似系数，可知各菌株间的遗传相似系数在0.59～1.00，通过非加权平均法进行聚类分析，在遗传相似系数0.80的位置可将34个菌株划分为6个类群(图2)。类群Ⅰ包括26个菌株，占菌株总数的76.47%，为优势类群。该类群的菌株在河南省除濮阳地区以外的11个地区均有分布。类群Ⅱ仅包括PN4一个菌株，类群Ⅲ包括PN28和PN29 2个菌株，类群Ⅳ仅包括PN16一个菌株，类群Ⅴ包括PN21和PN34 2个菌株，类群Ⅵ包括PN27和PN37 2个菌株。烟草疫霉菌株之间存在着遗传相似系数为1.00的现象，例如PN2和PN33之间，PN1、PN12和PN14之间，PN13、PN19和PN20之间，PN5、PN8、PN10、PN15、PN17、PN18、PN23、PN26、PN35和PN36之间，说明这些菌株的遗传分化程度较低。
图2 34株烟草疫霉的UPGMA聚类分析
Fig.2 UPGMA dendrogram of 34 Phytophthora nicotianae isolates
2.3 主成分分析
基于RAPD标记数据对34株烟草疫霉进行主成分分析，根据第1和第2主坐标构建主成分分析二维图(图3)，由图3可知，主成分分析结果和UPGMA聚类分析结果相一致，UPGMA聚类中遗传相似系数为1的菌株在主成分分析中聚为一个点，UPGMA聚类中类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ的菌株在主成分分析中也分别聚在4个类群，但是类群Ⅲ的PN28和PN29 2个菌株没有聚在一起，其中PN29与类群Ⅳ的PN16相距较近，可能是因为第1和第2主坐标的贡献率分别为38.66%，14.77%，还有其他因素没有考虑。
图3 34株烟草疫霉的主成分分析
Fig.3 Principal coordinate analysis of 34 P.nicotianae isolates
2.4 遗传结构分析
使用STRUCTURE软件对烟草疫霉群体遗传结构进行分析，在 K=1～10中，K=2时达到最大拟然值，因此，基于贝叶斯模型推测河南省烟草疫霉群体起源于2个祖先亚群，即亚群Ⅰ和亚群Ⅱ(图4)。从图中可以看出，河南省烟草疫霉群体中亚群Ⅰ和亚群Ⅱ所占比例分别为72.73%,27.27%，说明亚群Ⅰ为优势亚群。以50%类群属性比例作为划分依据将河南省烟草疫霉分为C1和C2 2个类群，C1类群(单个菌株中亚群Ⅰ占比超过50%)包括25个菌株，其中PN19、PN20、PN13、PN17、PN5、PN23、PN26、PN35、PN8、PN10、PN18、PN36、PN15、PN33和PN2等15个菌株中亚群Ⅰ所占比例超过95%；C2类群(单个菌株中亚群Ⅱ占比超过50%)包括9个菌株，其中PN27、PN37、PN21和PN34等4个菌株中亚群Ⅱ所占比例超过98%，因此，55.88%的烟草疫霉菌株遗传组分非常单一。
绿色色块为亚群Ⅰ; 红色色块为亚群Ⅱ。
Green represented subpopulation Ⅰ; Red represented subpopulation Ⅱ.
图4 34株烟草疫霉的遗传结构(K=2)
Fig.4 The genetic structure of 34 P.nicotianae isolates (K=2)
3 结论与讨论
本研究利用筛选获得的6条RAPD引物对来自河南省12个地区的34个烟草疫霉菌株进行分析，扩增出的条带中多态性条带比率为90%，说明河南省烟草疫霉存在一定的遗传多样性。但计算得出Nei’s基因多样性指数为0.271 0，Shannon信息指数为0.402 8，这2个指数数值偏低，同时一些菌株间的遗传相似系数为1.00，说明河南省烟草疫霉的遗传多样性处于较低水平，这与刘芳等[10]和封松利等[13]对河南省烟草疫霉遗传多样性的研究结果是一致的。
本研究利用STRUCTURE软件对河南省烟草疫霉遗传结构的进一步分析表明，河南烟草疫霉群体可能来自于2个祖先亚群，群体中亚群Ⅰ所占比例远大于亚群Ⅱ，亚群Ⅰ为优势亚群，并且超过半数菌株的遗传组分相对单一。而崔林开等[20]的研究结果显示，河南省烟草疫霉群体可能来自于3个祖先亚群，可能是由于使用的分子标记不同导致分析的位点不同，从而造成分析结果有一定的偏差，但最终的结果显示河南省烟草疫霉大多数菌株的遗传组分单一，这些菌株来自于2或3个祖先亚群，即河南省烟草疫霉群体的遗传结构较为简单。
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