水稻(Oryza sativa L.)作为我国重要的粮食作物，其产量及品质一直受到各界的广泛关注，在土地资源与人口数量日益凸显的矛盾下，水稻产量的提升显得尤为重要。穗数、穗粒数和粒质量是影响水稻产量的关键因素，水稻籽粒的粒长、粒宽、粒厚对粒重具有重要的影响，千粒质量与粒长、粒宽与长宽比、粒长与长宽比均呈正相关[1]，通常水稻千粒质量在30 g以内，大部分大粒水稻千粒质量在30～40 g，而少数特大粒水稻品种千粒质量在40 g以上，大粒水稻在粒质量方面所具有的绝对优势对提高水稻产量具有重要的影响作用，近年来，大粒水稻吸引了越来越多人的关注，我国在“七五”攻关工作的基础上筛选了上千份水稻材料并选出了2 000余份优异种质，但千粒质量在40 g以上的特大粒资源只有9份[2]。通常，采用诱变的方式获得大粒突变体材料以研究相关功能[3]，或者采用多次反复回交方法对相关功能基因进行精细定位[4]。水稻籽粒的大小和充实度决定了水稻千粒质量，而水稻籽粒的充实度与水稻的灌浆特性有着密切的关系，近年来，有关控制水稻籽粒大小基因的研究颇受关注，有研究分析了水稻9个主效基因与粒长粒宽粒厚的调控关系，发现对粒厚影响最大，粒宽次之粒长影响最小[5]，水稻基因RBG1的高表达增加籽粒的大小，主要通过细胞数量的增多，同时上调热休克蛋白增加水稻的抗逆性[6]，另外，许多非编码microRNAs(miRNAs)对水稻的籽粒大小也具有调控作用，比如miR396e和miR396f是水稻粒径和柱型的重要调节因子，二者突变后通过调节赤霉素(GA)前体甲羟戊酸(Mevalonic acid)的水平改变株型，同时增大粒径提高产量[7]，Argonaute(AGO)蛋白和小RNA(sRNAs)是RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心组成部分，研究发现，OsAGO17在水稻幼穗和幼节中表达量较高，并且与OsmiR397b的表达模式一致，因此，推测OsAG17是一种AGO蛋白，进一步发现OsAGO17与OsmiR397b形成RISC对水稻的粒径和粒质量具有积极的调控作用[8]，miR530则通过直接靶向影响OsPL3编码的蛋白降低籽粒的大小，减少穗的分枝[9]。大粒水稻相较于常规稻来说虽具有粒型大、粒质量大的优势，但同时在灌浆方面却有着明显的差异，因此，存在有较多的空瘪粒，主要原因是由于大粒品种为异步灌浆型品种，通常二次枝梗顶端籽粒开花较早，灌浆速率较大，因此，籽粒较为充实，而二次枝梗末端开花较晚，灌浆速率较慢，因而造成较多的空瘪粒[10]。在常规稻中大多为同步灌浆型品种，一般籽粒充实度较好[11-12]。本试验通过以大粒材料0183与对照材料9311作为研究对象，同过比较分析二者在苗期和成熟期的各项生理指标以及种质差异，为后续培育高产优质杂交水稻奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与研究
水稻大粒材料0183与对照材料9311于2019年4月初在重庆师范大学根系发育与氮高效利用重点实验室试验田进行播种并于5月初进行大田移栽。在苗期对大粒材料0183与常规水稻品种9311进行3次重复取样，然后进行相关生理指标测定和分析。待其抽穗结实后以同样方式取样，并分析检测其根、茎、叶的各项生理指标。
1.2 测定项目与方法
1.2.1 农艺性状调查 考察并统计分析了2份材料的粒长、粒宽、粒厚和千粒质量等指标。
1.2.2 脯氨酸含量测定 采用磺基水杨酸提取水稻中的脯氨酸，通过酸性茚三酮加热处理后，利用甲苯萃取，在520 nm波长处比色并计算出脯氨酸含量。
1.2.3 可溶性蛋白含量测定 通过考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue，G-250)法，利用蛋白典料结合的原理，定量测定样品中的蛋白质浓度。
1.2.4 可溶性糖含量测定 通过蒽酮法测定水稻中的可溶性糖含量，糖类与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物在波长620 nm处具有吸收峰，因此，根据颜色测定糖含量。
1.2.5 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定 丙二醛是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，3，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，在520 nm处进行比色测定，检测丙二醛相对含量。
1.2.6 叶绿素含量测定 通过丙酮法提取植物中的叶绿素，分别在663，645 nm处进行比色，并计算出叶绿素含量。
1.3 数据统计及分析
采用Graphpad prism 5和CorelDRAW X7对数据分析及作图，利用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差及相关性分析。
2 结果与分析
2.1 大粒材料0183相关农艺性状分析
首先，统计和分析了大粒材料0183的相关农艺性状。该材料与9311相比，株高和穗长无明显差异，茎秆粗壮且叶片颜色较深。从籽粒方面来看，大粒材料0183籽粒在粒长、粒宽、粒厚方面与9311均有差异(图1-A，B)，进一步统计分析发现其粒长和粒厚无显著差异而粒宽存在显著差异(图1-C-E)，同时千粒质量与9311相比存在显著差异(图1-F)。该材料是一份优异的水稻种质资源，为后续水稻控制籽粒大小的相关基因定位克隆提供了可能，同时为培育高产优质的杂交水稻新品种奠定了基础。
不同小写字母表示同一时期材料间差异显著(P<0.05)。图3-5同。
Different small letters mean significant difference among materials under the same period(P<0.05).The same as Fig.3-5.
图1 大粒材料0183相关农艺性状分析
Fig.1 Agronomic trait analysis of large grain 0183
2.2 丙二醛含量测定
丙二醛作为植物膜脂过氧化的重要产物之一，检测丙二醛的含量可以了解植物的抗性生理以及受损伤程度，为了进一步了解大粒材料0183与9311在丙二醛含量方面是否存在差异，对大粒材料0183和9311分别在苗期与成熟期测定了丙二醛含量(以鲜质量计)，结果表明，大粒0183无论在苗期或者成熟期的根与叶中丙二醛含量极显著高于9311，而大粒0183同时期在茎中无显著差异(图2-A，B)。因此，大粒材料0183在生长发育过程中可能更容易受到环境因素的影响，其在抗逆性方面可能与常规水稻品种9311相比较弱。
2.3 可溶性糖与可溶性蛋白含量测定
可溶性糖的含量与植物的生长代谢密切相关，检测不同时期可溶性糖的含量能进一步了解植物的生理活动变化，蛋白质是植物干质量比例最大的分子，植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，检测可溶性蛋白含量能了解植物的总代谢活动。分别在苗期与成熟期测定了可溶性糖与可溶性蛋白的含量，从苗期-成熟期可溶性糖的含量(以鲜质量计)在不断增加，大粒0183的可溶性糖含量显著高于9311(图3-A，B)，同时可溶性蛋白(以鲜质量计)从苗期-成熟期显著下降，在根部表现尤为显著，下降趋势表现为根部>茎部>叶部(图3-C，D)。结果表明，可溶性糖含量在0183成熟期和幼苗期的叶片中显著高于对照品种9311，可溶性蛋白含量在0183成熟期的叶片中显著高于对照品种9311，说明大粒材料0183有较强参与渗透调节生理恢复的优势。
不同大写字母表示同一时期材料间差异极显著(P<0.01)。
Different capital letters indicate significant differences among materials under the same period(P<0.01).
图2 大粒0183与9311的丙二醛含量分析
Fig.2 Malondialdehyde contents in large grain 0183 and 9311
不同小写字母表示同一时期材料间差异显著(P<0.05)。图4-5同。
Different small letters mean significant difference among materials under the same period(P<0.05).The same as Fig.4-5.
图3 大粒0183与9311中可溶性糖和可溶性蛋白含量
Fig.3 Soluble sugar and soluble protein contents of large grain 0183 and 9311
2.4 叶绿素含量分析
植物中的叶绿素作为光合作用过程中的关键色素分子，其含量与植物的光合作用以及氮素营养密切相关，为植物的生长发育提供有机物。通常在一定条件下植物的产量与叶绿素含量呈正比，测定植物叶绿素含量对理解植物生长发育以及水稻育种十分重要。通过对0183和9311在苗期和成熟期的叶绿素含量进行了测定和分析，结果表明，大粒材料0183在苗期的叶片中叶绿素含量(以鲜质量计)显著低于常规品种9311(图4-A)，而在成熟期叶片中的叶绿素含量较9311高(图4-B)，说明在生长发育的后期0183具有持续高效率的光合作用，生长发育还在持续进行，这可能与其最终产量形成有关。
图4 大粒材料0183与9311的叶绿素含量分析
Fig. 4 Chlorophyll contents analysis of large grain 0183 and 9311
2.5 脯氨酸含量测定
脯氨酸是植物抗逆性的重要指标，抗逆性强的植物一般会有大量脯氨酸积累。为了解大粒材料0183的抗逆生理特性，对0183和9311 2个材料的脯氨酸含量(以鲜质量计)进行了测定。结果表明，苗期0183中脯氨酸的含量显著高于对照品种9311(图5-A)，但在生长发育的后期含量较低且9311从幼苗期-成熟期脯氨酸含量增长幅度高于大粒材料0183(图5-B)，说明随着生长发育的进行大粒材料0183抗逆性相比对照品种9311表现更差，可能在后期最终产量的形成上更易受环境影响。
图5 大粒0183与9311脯氨酸含量
Fig.5 Proline contents of large grain 0183 and 9311
2.6 大粒材料0183各生理生化指标的相关性分析
通过对大粒水稻材料0183在苗期和成熟期的生理指标之间进行相关性分析，发现大粒材料0183仅在幼苗期叶部可溶性糖与丙二醛有显著正相关，而与茎中脯氨酸的含量呈显著负相关性，可溶性蛋白与可溶性糖在大粒材料0183幼苗期茎部呈极显著负相关性(表1)，在成熟期呈正相关但不显著(表2)。另外，对大粒材料0183在成熟期的各生理指标进行关联分析发现，丙二醛与可溶性蛋白在茎中有很大的负相关性但差异不显著；而可溶性糖与脯氨酸在茎中有比较大的正相关性但差异同样不显著。通过对不同部位各相关指标进行关联分析对深入的了解大粒材料0183在各生长发育阶段的生理响应十分重要，同时也为后续进一步的研究工作提供指导。
表1 大粒材料0183幼苗期生理指标的相关性分析
Tab. 1 Correlation analysis of physiological indexes at seedling stage of 0183
注：*、**. P<0.05 和P<0.01 水平上2组指标相关性显著。表2同。
Note：*，**. The two groups of indicators have significant correlation at the level of P<0.05 and P<0.01. The same as Tab.2.
指标部位丙二醛可溶性糖可溶性蛋白IndexPositionMDASoluble sugarSoluble protein可溶性糖Soluble sugar茎-0.066叶0.999*可溶性蛋白Soluble protein根0.286茎0.058-1.000**叶0.7500.780脯氨酸Proline根-0.713--0.876茎-0.996*-0.1950.202叶0.7270.6940.091
表2 大粒材料0183成熟期生理指标的相关性分析
Tab.2 Correlation analysis of physiological indexes of 0183 at mature stage
指标部位丙二醛可溶性糖可溶性蛋白IndexPositionMDASoluble sugarSoluble protein可溶性糖Soluble sugar根0.472茎-0.032叶-0.198可溶性蛋白茎-0.9620.284Soluble protein叶0.8030.424脯氨酸Proline根0.429-0.594茎0.3860.910-0.139叶-0.6870.848-0.119
3 讨论与结论
水稻作为人类的主要粮食作物，其驯化是一个十分复杂的选择过程，驯化中往往会发生许多基因的变化，大多数基因调控着水稻相关的重要生物性状[13]。本研究对前期获得的大粒材料0183的相关农艺性状进行了统计分析，该材料在粒宽及千粒质量方面表现比较优异，与对照品种9311相比具有显著差异，是一份可以用于后续基因定位克隆及水稻高产育种的新的种质资源。另外，在生长发育过程中通过生理生化方法对该材料和9311表型特征及生理指标进行了初步探究，结果表明，大粒材料0183具有株高较高，叶片宽大且聚拢等特点，通过叶绿素含量的测定了解到大粒材料0183的光合作用较强，有利于为植物的生长发育积累有机物，在成熟期和幼苗期大粒材料0183可溶性糖与可溶性蛋白含量在叶部较高，具有干旱胁迫下植物生理恢复的优势，但同时大粒材料0183丙二醛含量较高更容易受到胁迫损伤。大粒材料0183生长发育过程中脯氨酸积累量明显低于对照材料9311，在抗逆性方面不具有优势。
穗数、穗粒数、粒质量是影响水稻产量的关键因素。粒长、粒宽 、粒厚、长宽比、千粒质量等粒形性状是由多基因控制的数量性状[14]，利用水稻重组自交系鉴定粒型数量性状基因[15-16]，并分析研究控制水稻粒宽粒质量的QTL GW5 [17]基因。GL7与水稻粒型性状多样性联系紧密[18]，控制粒形各性状的基因存在着互补和累加的效应[19]，基因qPE9、GW2、SLG7、GW5、GS3、GS7、GW8、GS5、GS2在调控4个与谷粒大小和体质量相关的性状中有重要作用。位于水稻3号染色体的GS3位点，经常被认为是粒质量和粒长的主要QTL，有研究指出，GS3可能是颗粒大小的负调节因子[20]；GS5通过调节籽粒宽度、灌浆和质量量来控制籽粒大小[21]；GS2等位基因提高了水稻的籽粒大小和产量[22]得到更长的谷物和更高的产量。
本研究中大粒材料0183相较于9311具有穗数多，粒质量大的优势，但由于大粒0183属于异步灌浆型水稻，因此，存在较多空瘪粒，对大粒材料0183的产量存在严重的影响作用，由于籽粒的粒长、粒宽、粒厚等性状是由多基因控制的数量性状，并且互相存在相关性[23-24]。在后续研究中，将利用9311与大粒材料0183构建相关的基因定位克隆群体，利用图位克隆的方法定位和克隆控制该性状的关键基因，并且解析其功能。另外，通过杂交和回交将大粒材料0183的优良性状整合到常规品种9311中，通过分子标记进行选择获得新的优质高产材料用于后期的杂交水稻育种，为国家的粮食安全提供支撑。
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