水稻栽培方式主要有移栽和直播2种栽培模式。移栽稻是将水稻种子先育苗，再栽插到大田中的一种栽培方式。直播稻是指将水稻种子直接播入大田中的一种栽培方式。较之移栽稻，直播稻省去了育秧和移栽2个环节，极大节约了种植成本，提高了经济效益。目前，许多国家水稻栽培模式主要以直播为主，如美国、澳大利亚、意大利、日本、斯里兰卡和马来西亚等[1-3]。随着农村青壮年劳动力向非农业领域转移，我国直播稻面积也呈现逐年增加的趋势。直播稻的栽培面积在2007年以前的仅为2%，现在已增加至30%以上[4]。
制约直播稻发展的主要因素之一是直播时低温、低氧的环境因素导致的出苗不齐、缺苗等现象[1, 5-10]。解决该问题的有效措施是提高水稻种子耐低温和低氧发芽能力。已有研究证实，水稻低氧发芽力在不同的水稻品种间存在明显差异，且低氧发芽力是多基因控制的复杂的数量性状[11-13]。侯名语等[11]利用Kinmaze/DV85 重组自交系群体分析了控制水稻低氧发芽力的QTL, 共检测到5 个低氧发芽力QTL，分别位于第1，2，5，7 号染色体上，贡献率10.5%～19.6%。Jiang等[14]利用USSR5/N22 F2群体定位了2个低氧发芽力QTLs，分别定位于第5，11号染色体，分别可以解释15.51%和10.99%表型变异。陈孙禄等[12]利用R0380/RP2334回交自交系群体定位了4个低氧发芽力QTLs，分别定位于第2，3，8号染色体，贡献率最小的为9.37%，贡献率最大为17.34%。孙凯等[15]利用200 份水稻种质为材料对低氧条件下，芽鞘长度进行GWAS分析，共检测到15 个与芽鞘长显著关联的位点，分布在第3，4，5，6，8，11 染色体上。Yang等[16]利用YZX/02428重组自交系群体定位了25个低氧发芽力的QTL，分别位于除第11号染色体外的其他11条染色体上。
虽然人们在水稻低氧发芽资源筛选及相关的QTL定位和基因克隆等方面取得了一定进展，但总的来说，控制低氧发芽遗传位点的挖掘仍然比较有限。筛选新的耐淹水种质资源，定位更多控制低氧发芽的QTL，并对相关基因进行克隆，对水稻低氧萌发育种和阐明耐低氧发芽分子机理有重要意义。本研究以云南省籼稻地方品种扎西玛和江苏省优良食味粳稻品种南粳46 构建的RIL群体，对控制低氧发芽性状进行QTL定位，为下一步基因克隆和育种利用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
以云南省籼稻地方品种扎西玛(母本)与江苏省优良食味粳稻品种南粳46(父本)为亲本，用单粒传法构建了含有135个家系的RIL群体[15-17]。
2019年正季，亲本材料及其包含135个家系的RIL群体种植于江苏省农业科学院南京试验田。株距和行距分别为13.3，30.0 cm。田间管理与一般大田相同。
1.2 低氧发芽检测
为了打破休眠，将亲本及各家系的种子置于50 ℃烘箱中放置7 d。低氧发芽试验参照陈孙禄等[12]和Jiang等[14]进行，具体如下：从亲本及135个家系中，随机选取健康饱满一致的种子，用84消毒液(原液)消毒30 min，然后用无菌去离子水清洗5次后，置于装满无菌去离子水的10 cm高的离心管中，并密封。每份材料4管，每管5粒, 3次重复。于人工气候室中28 ℃，黑暗培养。7 d后调查胚芽鞘长度，作为低氧发芽力的指标[12,16]。
1.3 QTL分析
用QTL IciMapping 4.0[18]检测低氧发芽力QTL，LOD阈值设为2.5。QTL 命名按McCouch等[19]的方法进行。
SSR标记RM1300和RM1227选自Gramene(https://archive.gramene.org/)。RM1300引物序列为：RM1300-F:CAGCCATGAATGTTGGCTAC和RM1300-R:GCCATGTCCATTTATGGTGC，RM1227引物序列为：RM1227-F:CATGGTAGCACACACCCTTG和RM1227-R:CATCGACATGTGGACCACTC。
2 结果与分析
2.1 亲本及群体低氧发芽分析
在低氧条件下发芽7 d后，以胚芽鞘长度为标准，对扎西玛和南粳46低氧发芽力进行了调查，结果发现：扎西玛胚芽鞘长度为2.92 cm，而南粳46胚芽鞘长度为6.68 cm，二者差异在P=0.01水平上达到极显著水平(图1)。扎西玛/南粳46 RIL群体胚芽鞘长度呈现为连续的分布，胚芽鞘长度为1.32～5.99 cm，群体胚芽鞘长度次数呈正态的分布(图2)。
A.低氧条件下发芽7 d，扎西玛(左)和南粳46表型(右)；B.低氧条件下发芽7 d，扎西玛和南粳46胚芽鞘长度；A′和B′表示P=0.01水平差异显著。
A.Phenotype of Zhaxima(Left)and Nanjing 46(Right)for 7 d under anaerobic conditions; B.Coleoptile length of Zhaxima and Nanjing 46 for 7 d under anaerobic conditions; A′ and B′ mean statistically significant difference at P=0.01.
图1 低氧条件下亲本表型
Fig.1 Phenotype of Zhaxima and Nanjing 46 under anaerobic conditions
图2 扎西玛/南粳46 RIL群体胚芽鞘长度次数分布
Fig.2 Distribution of coleoptile length of the RIL population derived from the cross between Zhaxima and Nanjing 46
2.2 低氧发芽QTL分析
本研究前期构建了扎西玛/南粳46 RIL群体SSR标记分子连锁图谱，该图谱共包含202对SSR标记，总长度为1 437.3 cM，平均图距为8.1 cM，能满足QTL 作图的要求。根据群体中135个家系低氧发芽力数据，利用QTL Ici-Mapping 4.0对控制低氧发芽QTL进行检测，在第12号染色体上的RM1300和RM1227之间检测到一个控制低氧发芽力的QTL(qAG-12)，qAG-12位于第12染色体上26.00～27.34 Mb的1.34 Mb范围内。该QTL来自南粳46，LOD值为3.04，可以解释11.24%的表型变异(图3)。
图3 水稻低氧发芽力QTL检测
Fig.3 QTL detection of anoxia germinability in rice
3 讨论与结论
耐淹成苗率低、杂草问题等是影响直播稻产量的重要因素。与传统的移栽稻相比，直播稻种子在萌发时处于淹水环境之中。淹水环境有利于控制田间杂草却不利于直播稻成苗，水直播稻成苗率通常在30%左右[20]。这主要归因于以往的育种过程中，很少对低氧萌发等与直播水稻相关的性状进行人为选择，这直接导致目前市场上正在推广的绝大多数水稻品种不适合进行田间直播[20-22]。开展耐淹水的种质资源筛选，挖掘在低氧条件下萌发能力强的水稻资源，并在水稻育种过程中加以利用和选择是提高耐淹成苗率的关键。此外，控制耐淹成苗率的遗传位点的挖掘仍然比较有限，且控制耐淹成苗率的遗传位点都是由多基因控制的复杂的数量性状，遗传力较低，常规的育种选择费时费力。因此，开展控制耐淹成苗率的遗传位点的定位研究，继而进行多基因分子标记辅助聚合育种，有望提高水稻种子低氧发芽能力，进而改善解决直播稻全苗问题。
本研究对云南地方品种扎西玛和江苏省优质稻品种南粳46低氧发芽进行了鉴定，发现二者差异极显著，进而利用扎西玛/南粳46 RIL群体在12染色体上定位到一个主效QTL，位于SSR标记RM1300和RM1227之间，为该QTL育种利用提供了材料和分子标记。将RM1300和RM1227在日本晴基因组中进行定位，发现其位于第12染色体上26.00～27.34 Mb。该候选区域未见报道的低氧发芽的QTL，故qAG-12是一个新的QTL。在Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)对该候选区间注释发现，在这1.34 Mb范围内共有200多个注释基因。接下来，拟从扎西玛/南粳46 RIL群体中选择含有qAG-12单株与扎西玛构建F2次级分离群体，对qAG-12进行精细定位，为下一步基因克隆奠定基础。
在淹水条件下，扎西玛和南粳46种子低氧发芽力呈现极显著差异，并利用扎西玛/南粳46 RIL群体在第12染色体上定位到一个新的控制水稻种子低氧发芽力的QTL(qAG-12)。
[1] 金千瑜, 欧阳由男, 陆永良, 徐一成.我国南方直播稻若干问题及其技术对策研究[J].中国农学通报, 2001,17(5):44-48.doi:10.3969/j.issn.1000-6850.2001.05.014.
Jin Q Y, Ouyang Y N, Lu Y L, Xu Y C.Research on some problems of direct-seeded rice in South China and its technical countermeasures[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2001, 17(5): 44-48.
[2] 王慧.水稻直播技术特点及发展现状[J].农业科技与装备, 2017,27(1): 72-73.doi:10.16313/j.cnki.nykjyzb.2017.01.030.
Wang H.Characteristics and developing status of rice direct sowing technology[J].Agricultural Science & Technology and Equipment, 2017,27(1): 72-73.
[3] 罗锡文, 王在满, 曾山, 臧英, 杨文武, 张明华.水稻机械化直播技术研究进展[J].华南农业大学学报, 2019, 40(5): 1-13.doi:10.7671/j.issn.1001-411X.201905069.
Luo X W, Wang Z M, Zeng S, Zang Y, Yang W W, Zhang M H.Recent advances in mechanized direct seeding technology for rice[J].Journal of South China Agricultural University, 2019, 40(5): 1-13.
[4] 曹微, 王燕, 谭斌, 刘伟, 储莉, 潘招远, 赵光苗, 曹桂元, 周玉亮.水稻品种直播相关的种子低温和低氧萌发活力评价[J].分子植物育种, 2018, 16(10): 3259-3268.doi:10.13271/j.mpb.016.003259.
Cao W, Wang Y, Tan B, Liu W, Chu L, Pan Z Y, Zhao G M, Cao G Y, Zhou Y L.Evaluation of seed germination vigor of rice cultivars under low temperature or hypoxic condition related with direct seeding rice[J].Molecular Plant Breeding, 2018, 16(10): 3259-3268.
[5] 王岳钧.浙江省直播稻技术发展过程回顾与分析评价[J].中国稻米, 2015, 21(2): 1-3.doi：10.3969/j.issn.1006-8082.2015.02.001.
Wang Y J.Review and evaluation of rice direct seeding technology in Zhejiang Province[J].China Rice, 2015, 21(2): 1-3.
[6] 王宝祥, 卢百关, 潘启明, 徐大勇.黄淮稻区水稻直播研究进展及育种策略探讨[J].北方农业学报, 2017, 45(5):1-5.doi:10.3969/j.issn.2096-1197.2017.05.01.
Wang B X, Lu B G, Pan Q M, Xu D Y.Research progress in breeding level of direct-seeding rice and breeding strategy in the Huang and Huai Valley[J].Inner Mongolia Agricultural Science and Technology, 2017, 45(5):1-5.
[7] 张志财, 贾维东, 林秀云, 王金明, 孙强, 李鹏志.吉林省水稻直播技术现状、问题及对策[J].北方水稻, 2017,47(6):47-50.doi：10.16170/j.cnki.1673-6737.2017.06.015.
Zhang Z C, Jia W D, Lin X Y, Wang J M, Sun Q, Li P Z.Development situation and countermeasures of rice direct seeding cultivation in Jilin Province[J].North Rice, 2017,47(6):47-50.
[8] 刘利成, 黎用朝, 黄志才, 邓应征, 闵军, 刘三雄, 胡敏.湖南水稻直播现状、问题与发展对策[J].湖南农业科学,2019(9):12-16.doi:10.16498/j.cnki.hnnykx.2019.009.004.
Liu L C, Li Y C, Huang Z C, Deng Y Z, Min J, Liu S X, Hu M.Current situation, problems and developing countermeasures of rice direct seeding in Hunan Province[J].Hunan Agricultural Sciences, 2019(9):12-16.
[9] 陈东, 李强, 彭彦, 吴天昊, 张秀丽, 董家瑜, 毛毕刚, 赵炳然.淹水胁迫下褪黑素浸种对水稻幼苗生长的影响[J].华北农学报, 2019, 34(3):129-136.doi:10.7668/hbnxb.201751428.
Chen D, Li Q, Peng Y, Wu T H, Zhang X L, Dong J Y, Mao B G, Zhao B R.Effect of melatonin on rice seedling growth under submergence stress[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2019, 34(3):129-136.
[10] Mondal S, Khan M I R, Dixit S, Cruz P C S, Septiningsih E M, Ismaila A M.Growth, productivity and grain quality of AG1 and AG2 QTLs introgression lines under flooding in direct-seeded rice system[J].Field Crops Research,2020,248:107713.doi:10.1016/j.fcr.2019.107713.
[11] 侯名语, 江玲, 王春明, 万建民.水稻种子低氧发芽力的QTL定位和上位性分析[J].中国水稻科学, 2004, 18(6):483-488.doi:10.16819/j.1001-7216.2004.06.002.
Hou M Y, Jiang L, Wang C M, Wan J M.Quantitative trait loci and epistatic analysis for seed anoxia germinability in rice(Oryza sativa L.)[J].Chinese Journal of Rice Science, 2004, 18(6):483-488.
[12] 陈孙禄, 王俊敏, 潘佑找, 马健阳, 张建辉, 张红生, 滕胜.水稻萌发耐淹性的遗传分析[J].植物学报, 2012, 47(1): 28-35.doi:10.3724/SP.J.1259.2012.00028.
Chen S L, Wang J M, Pan Y Z, Ma J Y, Zhang J H, Zhang H S, Teng S.Genetic analysis of seed germinability under submergence in rice[J].Chinese Bulletin of Botany, 2012, 47(1): 28-35.
[13] 张晓丽, 陶伟, 王强, 陈雷, 郭辉, 梁天锋, 高国庆, 唐茂艳.基于早稻直播的水稻品种耐低温和低氧能力评价[J].南方农业学报, 2019,50(12)：2680-2687.doi:10.3969/j.issn.2095-1191.2019.12.08.
Zhang X L, Tao W, Wang Q, Chen L, Guo H, Liang T F, Gao G Q, Tang M Y.Evaluation of tolerance to low temperature and anoxia of rice varieties based on direct seeding of early rice(Oryza sativa L.)[J].Journal of Southern Agriculture, 2019,50(12)：2680-2687.
[14] Jiang L, Liu S J, Hou M Y, Tang J Y, Chen L M, Zhai H Q, Wan J M.Analysis of QTLs for seed low temperature germinability and anoxia germinability in rice(Oryza sativa L.)[J].Field Crops Research, 2006,98(1):68-75.doi:10.1016/j.fcr.2005.12.015.
[15] 孙凯, 李冬秀, 杨靖, 董骥驰, 严贤诚, 罗立新, 刘永柱, 肖武名, 王慧, 陈志强, 郭涛.水稻耐淹成苗率相关性状全基因组的关联分析[J].中国农业科学, 2019,52(3):385-398.doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.001.
Sun K, Li D X, Yang J, Dong J C, Yan X C, Luo L X, Liu Y Z, Xiao W M, Wang H, Chen Z Q, Guo T.Genome-Wide association analysis for rice submergence seedling rate[J].Scientia Agricultura Sinica, 2019,52(3):385-398.
[16] Yang J, Sun K, Li D X, Luo L X, Liu Y Z, Huang M, Yang G L, Liu H, Wang H, Chen Z Q, Guo T.Identification of stable QTLs and candidate genes involved in anaerobic germination tolerance in rice via high-density genetic mapping and RNA-Seq[J].BMC Genomics, 2019, 20(1)：355.doi:10.1186/s12864-019-5741-y.
[17] 方先文, 张云辉,肖西林,张所兵,林静, 汪迎节.基于重组自交系群体的水稻粒形QTL 定位[J].江苏农业学报, 2017, 33(2): 241-247.doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2017.02.001.
Fang X W, Zhang Y H, Xiao X L, Zhang S B, Lin J, Wang Y J.Mapping of QTLs for grain shape using recombinant inbred lines in rice(Oryza sativa L.)[J].Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2017, 33(2): 241-247.
[18] Meng L, Li H H, Zhang L Y, Wang J K.QTL IciMapping: Integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations[J].The Crop Journal, 2015, 3(3): 269-283.doi:10.1016/j.cj.2015.01.001.
[19] McCouch S R, Cho Y G, Yano M, Paul E, Blinstrub M, Morishima H, Kinoshita T.Suggestions for QTL nomenclature for rice[J].Rice Genetics Newsletter, 1997, 14: 11-13.
[20] 冯延江, 王麒, 赵宏亮, 宋秋来, 孙羽, 曾宪楠.我国水稻直播技术研究现状及展望[J].中国稻米,2020,26(1):23-27.doi:10.3969/j.issn.1006-8082.2020.01.005.
Feng Y J, Wang L, Zhao H L, Song Q L, Sun Y, Zeng X N.Research status and prospect of the direct seeding technology of rice in China[J].China Rice,2020,26(1):23-27.
[21] 姚义.江淮下游地区直播稻播期与品种综合生产力及其利用的研究[D].扬州：扬州大学，2012：125.
Yao Y.Studies on comprehensive productivity and use of sowing date and varieties of direct seeding rice in the loweryangtze and huai valleys[D].Yangzhou: Yangzhou University,2012：125.
[22] 卢百关, 秦德荣, 樊继伟, 方兆伟, 李健, 刘辉, 迟铭, 徐大勇.江苏省直播稻生产现状、趋势及存在问题探讨[J].中国稻米,2009(2):45-47.doi:10.3969/j.issn.1006-8082.2009.02.015.
Lu B G, Qin D R, Fan J W, Fang Z W, Li J, Liu H, Chi M, Xu D Y.Present situation, tendency and problems of direct seeding rice production in Jiangsu Province[J].China Rice,2009(2):45-47.