马铃薯(Solanum tuberosum)茄科茄属,因其块茎淀粉含量高且营养全面,既可作为蔬菜也可用于餐桌主食,是重要的粮食作物[1]。马铃薯作为世界范围内主要的粮食作物之一,其地位仅次于小麦、玉米和水稻,而中国作为最大的马铃薯生产国之一,现正成为世界马铃薯产量的领跑者[2]。马铃薯在田间种植和窖储过程中常受细菌性病害及真菌性病害的威胁,主要的病害有枯萎病、早疫病、晚疫病、粉痂病、干腐病、青枯病、软腐病等,严重制约着我国马铃薯产业的发展[3]。
病程相关蛋白(Pathogenesis related protein,PR蛋白)是植物体内快速检测致病因子及非生物胁迫并产生防御机制的一类蛋白,其通过诱导因子的诱导直接参与到植物的抗病过程中[4]。PR 蛋白广泛分布于植物各个结构中[5],植物的叶片是该类基因的主要存在处及发挥作用的场所[6]。植物识别病原体和害虫衍生的信号,感知它们并利用这些线索诱导防御行为的产生,使得植物对害虫和病原体攻击时由 PR 蛋白的积累进行防御,它们通常是约 6～43 ku 的低分子量蛋白质,热稳定,耐蛋白酶,在低 pH 下仍可溶解[7]。Chun等[8]发现聚糖纳米粒子(CNPs)具有控制由镰孢菌引起一系列病害的能力,使用 CNPs 胁迫植物时,PR1和PR10基因显著上调,并且证实CNPs 通过诱导 PR 蛋白的产生来达到生物防治的目的。为评估壳聚糖在处理期间对植物的诱导作用,选择在 SAR代谢途径中至关重要的2个基因PR1及PR5,发现壳聚糖作为诱导物诱导植物体时,使得PR1和PR5表达量明显上调,进而 SAR开始防御工作,证明PR1和PR5在植物体内的防御反应中发挥重要作用[9]。Wang 等[10]从百合属中分离出2个Ⅱ类PR4家族基因,其在病原体感染期间积累,参与植物抗病性,在百合抗病中起重要作用。李秀钰等[11]克隆了马铃薯PR1基因,进行了生物信息学分析,预测分析了该基因在抗病中的作用。为了进一步了解马铃薯PR1基因在抗病中的功能,本试验成功构建了植物表达载体pBI121-StPR1,并利用农杆菌转化法将StPR1基因导入烟草中,获得转基因烟草,并且对转基因烟草进行抗病性及生理特性分析,为PR1基因在植物的抗病方面提供了理论基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 马铃薯(大西洋品种)由黑龙江省农业科学院提供。烟草(山西品种)由东北农业大学植物资源与分子生物学研究室保存并提供。
1.1.2 菌株和载体 植物表达载体pBI121、大肠杆菌 DH5α和农杆菌GV3101由东北农业大学植物资源与分子生物学研究室保存提供。
细菌病害软腐病病菌胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia.carotovora subsp. Carotovora Borgey,Ecc)、菊欧氏菌(E.chrysanthemi Burkholder. Atroseptica Dye,Ech)、胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(E.carotovora subsp. Mc Fadden et Dimock,Eca)和青枯病病菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,RS)、真菌病害干腐病病菌接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、燕麦镰孢(F. avenaceum)由东北农业大学植物资源与分子生物学研究室保存提供。
1.1.3 试剂与酶 RNA提取试剂盒购自BioTeke ；反转录试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、高保真 Taq 酶、T4 连接酶购自北京全式金生物公司；限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ购自NEB公司；普通Taq酶、LB营养琼脂、LB肉汤、MS培养基等试剂购自哈尔滨美恒试剂公司。
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计 根据NCBI上公布的马铃薯病程相关蛋白PR1(XM-006367029.2),找到CDS区,使用Primer Premier 5.0进行PR1克隆引物的设计,上游引物为PR1-F(5′-GCTCTAGAATGGGATACTCC AATATTGCCTTAA-3′)，下游引物PR1-R(5′-CGCGG ATCCTTAGATATCAGTTGGAAGTTCCA-3′), 并在上下游引物的 5′ 端分别引入了XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点。引物由库美生物公司合成。
1.2.2 RNA提取及cDNA的合成 RNA的提取参照BioTeke试剂盒进行,检测其OD260/280为1.8～2.1可用。参照全式金试剂盒进行cDNA的合成,用β-actin对cDNA质量进行检测(β-actin-F：5′-GCTTCC CGATGGTCAAGTCA-3′；β-actin-R：5′-GGATTCCAG CTGCTTCCATTC-3′)。
1.2.3 植物表达载体的构建 用引物PR1-F、PR1-R对基因StPR1进行扩增,体系为50 μL。回收PCR产物。T4 连接酶连接用 XbaⅠ和 BamHⅠ分别双酶切回收后的 PCR 产物和pBI121空载体并转化 DH5α,PCR和酶切鉴定阳性克隆,测序检测有无移码、突变。测序由库美生物公司完成。冻融法转化农杆菌GV3101并进行鉴定。
1.2.4 转基因烟草植株的获得 烟草种子消毒参照胡重怡等[12]方法,无菌条件下将种子种植到 1/2MS 培养基上,置于 25 ℃,16 h 光照无菌室中。待烟草长出 5 片左右真叶时,进行烟草叶盘法侵染[13],侵染后放到愈伤培养基中,14 d后将叶盘转入到分化培养基中,7 d左右叶盘周围会长出抗性芽,待其长到 2～3 cm时将抗性芽切离叶盘,置于生根培养基中。待转基因幼苗生根,长至 8～10 cm 左右,将三角瓶上的封口膜打开,进行壮苗。壮苗 3～5 d后,将其转置到土中进行培养(土∶蛭石=3∶1)。使用叶盘法获得野生型烟草植株与转基因型进行对照。
1.2.5 转基因烟草的检测 利用北京全式金生物技术有限公司 DNA 提取试剂盒提取转基因烟草的总DNA,利用PCR检测转基因烟草植株。
1.2.6 转基因烟草抗病性分析 选择长势良好,叶片翠绿的野生型及转基因烟草,使用剪刀将叶片剪下,用无菌水浸泡过的脱脂棉将叶柄部包紧,将干净的培养皿底部放上灭菌的滤纸,使用 3 000 μL 无菌水浸湿滤纸。马铃薯真菌病原菌接种方法是将培养在固体培养基 PDA 中的接骨木镰孢及燕麦镰孢用打孔器取直径为 1 cm 的菌块置于叶片上。马铃薯细菌病原菌接种方法是吸取 300 μL Ecc、Eca、Ech 及 RS 细菌菌液(OD600 值在 1.0～1.5)置于叶片上,以 300 μL 无菌水置于叶片上为对照,每种处理 3 个生物学重复。处理完成后用保鲜膜将培养皿封住,在保鲜膜上用大头针扎些小洞。分别在处理 3,6,9,12,15 d 进行叶面病斑直径(单位：cm)测量并记录。
1.2.7 转基因烟草的生理指标测定 材料处理及病原菌接种方法同 1.2.6,分别在处理 0,4,12,36,48 h 时,取 3 g 样本,液氮速冻,-80 ℃保存备用。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性采用试剂盒测定。具体操作方法参考哈尔滨市凯誉生物科技有限公司 SOD、POD、CAT 试剂盒。
1.2.8 数据处理 数据统计使用 Microsoft Excel 2007；统计分析使用 SPSS 15.0；统计图制作使用 GraphPad Prism 5。
2 结果与分析
2.1 马铃薯块茎中 RNA 的提取
马铃薯总 RNA 的提取结果获得 28S 及 18S条带(图1),无弥散出现,其完整性以及稳定性均达到后续试验要求。进行cDNA的合成。
2.2 含酶切位点的基因扩增
使用含有酶切位点的特异性引物进行 PCR扩增,PCR扩增PR1基因的CDS序列,扩增产物在 540 bp 出现特异性条带(图 2),大小与预期相符,回收目的条带。
M.DNA 分子量标准 2000；1-3.样品RNA。
M.DL2000 DNA Marker；1-3.Sample RNA.
图1 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig.1 The result of agarose gel electrophoresis of RNA extract
M.DNA 分子量标准 2000；1-2.PCR 产物。
M.DL2000 DNA Marker；1-2.The PCR production.
图2 含酶切位点 StPR1 基因的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.2 The result of agarose gel electrophoresis of StPR1 gene containing restriction
2.3 表达载体鉴定
对菌液进行阳性筛选,菌液PCR结果获得了目的性片段,其长度在540 bp(图 3),大小与基因相同。
M.DNA 分子量标准 2000；1-5.PCR 产物。
M.DL2000 DNA Marker；1-5.The PCR production.
图3 重组 pBI121-StPR1 质粒菌液 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.3 The result of agarose gel electrophoresis of recombinant pBI121-StPR1 plasmid PCR product
使用 XbaⅠ和 BamHⅠ对重组质粒进行双酶切,结果在 540 bp 处获得目的片段(图4),确定表达载体构建成功,命名为进行pBI121-StPR1。
2.4 农杆菌转化鉴定
将重组质粒转化至GV3101中,在 Kan 和 Rif 培养基上进行筛选,阳性菌落扩繁,扩繁后对该菌液进行 PCR 鉴定,菌液PCR结果获得了目的性片段,其长度在540 bp(图5),确定农杆菌转化成功。
M1.DNA 分子量标准 15000；1.pBI121 原质粒；2.pBI121-StPR1 质粒；3.pBI121-StPR1 质粒双酶切；M2.DNA 分子量标准 2000。
M1.DL15000 DNA Marker；1.pBI121 original plasmid；2.pBI121-StPR1 plasmid； 3.pBI121-StPR1 plasmid double digestion；M2.DL2000 DNA Marker.
图4 双酶切鉴定
Fig.4 Double enzyme digestion
2.5 转基因烟草的检测
对转基因烟草进行抗性筛选,在7 d产生明显的差别,野生型烟草叶盘发黄,叶盘边缘褶皱处于死亡状态,无分化芽产生。转化后烟草叶盘逐渐变大生长,长出明显的愈伤部分,并且有分化芽出现(图6)。将转基因型烟草分化芽放入抗性生根培养基中进行生根培养(图7)。
M.DNA 分子量标准 2000；1-6.重组质粒转化农杆菌后 PCR 鉴定。
M.DL2000 DNA Marker；1-6.PCR identification after transformation of recombinant plasmid into Agrobacterium.
图5 重组质粒转化农杆菌后 PCR 鉴定
Fig.5 PCR identification after transformation of recombinant plasmid into Agrobacterium
图6 转基因抗性植株的筛选
Fig.6 Screening of transgenic resistant plants
图7 烟草叶盘上芽的生根培养
Fig.7 Rooting of buds on tobacco leaf discs
随机取遗传转化植株叶片,进行 DNA 的提取(图8),并对野生型烟草及转基因烟草进行了 PCR 检测(图9),野生型无扩增条带,转基因植株出现扩增条带,证明 StPR1 成功转入烟草中。
M.DNA 分子量标准 15000；1.野生型烟草 DNA；2-3.转 StPR1 基因烟草 DNA。
M.DL15000 DNA Marker；1.Wild type tobacco DNA；2-3.Transgenic StPR1 gene tobacco DNA.
图8 野生型与转基因型烟草叶片的 DNA 提取
Fig.8 DNA extraction from wild-type and transgenic tobacco leaves
M.DNA 分子量标准 2000；1.重组质粒为模板的 PCR 产物；2.野生型烟草 DNA为模板；3.转 StPR1 基因烟草 DNA 为模板。
M.DL2000 DNA Marker；1.PCR product of recombinant plasmid as template；2.Wild type tobacco DNA as a template；3.Transfer of StPR1 gene tobacco DNA as a template.
图9 转基因植株的 PCR 鉴定
Fig.9 PCR identification of transgenic plants
Ecc-WT.Ecc 胁迫野生型烟草；Ecc-P35S:StPR1.Ecc 胁迫转基因型烟草；Eca-WT.Eca胁迫野生型烟草；Eca-P35S:StPR1.Eca 胁迫转基因型烟草；Ech-WT.Ech 胁迫野生型烟草； Ech-P35S:StPR1.Ech 胁迫转基因型烟草；RS-WT.RS 胁迫野生型烟草；RS-P35S:StPR1.RS 胁迫转基因型烟草。不同小写字母表示同一处理时间处理间差异显著(P<0.05)。图11-17同。
Ecc-WT.Ecc stress wild type tobacco；Ecc-P35S:StPR1.Ecc stress transgenic tobacco； Eca-WT.Eca stress wild type tobacco；Eca-P35S:StPR1.Eca stress transgenic tobacco；Ech-WT. Ech stress wild type tobacco；Ech-P35S:StPR1.Ech stress transgenic tobacco；RS-WT.RS stress wild type tobacco；RS-P35S:StPR1.RS stress transgenic tobacco.Different small letters indicate significant difference among treatments under the same processing time(P<0.05). The same as Fig.11-17.
图10 马铃薯主要致病细菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草病斑直径比较
Fig.10 Comparison of lesion diameters of wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria
2.6 转基因烟草抗病性分析
将软腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和青枯病致病菌 RS 接种转 StPR1 基因烟草及野生型烟草叶片,对病斑直径的变化进行观察测量(图10)。由结果可以看出,接种病原菌后,叶片上的病斑直径会随着胁迫时间的延长而增大,转基因型烟草病斑直径小于野生型烟草,且在胁迫 15 d 时,病斑差异显著。
采用干腐病致病菌接骨木镰孢和燕麦镰孢接种转 StPR1 基因烟草及野生型烟草叶片,对病斑直径的变化进行观察测量(图11)。结果表明，病斑的直径随着时间的延长而增大,且转基因型烟草病斑显著小于野生型。
2.7 转基因烟草的生理指标变化
F. avenaceum-WT.燕麦镰孢胁迫野生型烟草；F. avenaceum-P35S:StPR1.燕麦镰孢胁迫转基因型烟草；F. sambucinum-WT.接骨木镰孢胁迫野生型烟草；F. sambucinum-P35S: StPR1.接骨木镰孢胁迫转基因型烟草。
F. avenaceum-WT.F. avenaceum stress wild type tobacco；F. avenaceum-P35S:StPR1.F. avenaceum stress transgenic tobacco；F. sambucinum-WT.F. sambucinum stress wild type tobacco；F. sambucinum-P35S: StPR1.F. sambucinum stress transgenic tobacco.
图11 马铃薯主要致病真菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草病斑直径比较
Fig.11 Comparison of lesion diameters of wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal
2.7.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 在软腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和致青枯病致病菌 RS 胁迫处理野生型烟草和转 StPR1 基因烟草叶片后,野生型烟草和转基因烟草叶片中 SOD 的活性会随着细菌胁迫时间的延长而呈现上升趋势,Ecc、Ech处理的转基因烟草SOD的活性在12 h后均高于野生型烟草,Eca处理在36,48 h时SOD 的活性野生型高于转基因烟草,RS处理在36 h前SOD 的活性转基因烟草高于野生型,在48 h野生型烟草较高(图12)。
CK-WT.水胁迫野生型烟草；CK-P35S:StPR1.水胁迫转基因型烟草；Ecc-WT.Ecc 胁迫野生型烟草；Ecc-P35S:StPR1.Ecc 胁迫转基因型烟草；Eca-WT.Eca 胁迫野生型烟草； Eca-P35S:StPR1.Eca 胁迫转基因型烟草；Ech-WT.Ech 胁迫野生型烟草；Ech-P35S:StPR1.Ech 胁迫转基因型烟草；RS-WT.RS 胁迫野生型烟草；RS-P35S:StPR1.RS 胁迫转基因型烟草。图14,16同。
CK-WT.Water stress wild type tobacco；CK- P35S:StPR1.Water stress transgenic tobacco； Ecc-WT.Ecc stress wild type tobacco；Ecc-P35S:StPR1.Ecc stress transgenic tobacco；Eca-WT. Eca stress wild type tobacco；Eca-P35S:StPR1.Eca stress transgenic tobacco；Ech-WT.Ech stress wild type tobacco；Ech-P35S:StPR1.Ech stress transgenic tobacco；RS-WT.RS stress wild type tobacco；RS-P35S:StPR1.RS stress transgenic tobacco.The same as Fig.14,16.
图12 马铃薯主要致病细菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草的超氧化物歧化酶活性的变化 Fig.12 Changes of superoxide dismutase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria
采用干腐病致病菌接骨木镰孢和燕麦镰孢处理野生型烟草和转 StPR1 基因烟草叶片后,转基因烟草叶片中 SOD 的活性会随着真菌胁迫时间延长而呈现上升趋势,并且转基因型烟草 SOD 的活性均高于野生型烟草(图13)。
CK-WT.水胁迫野生型烟草；CK-P35S:StPR1.水胁迫转基因型烟草；F.avenaceum-WT.燕麦镰孢胁迫野生型烟草；F. avenaceum-P35S:StPR1.燕麦镰孢胁迫转基因型烟草；F. sambucinum-WT.接骨木镰孢胁迫野生型烟草；F. sambucinum-P35S:StPR1.接骨木镰孢胁迫转基因型烟草。图15,17同。
CK-WT.Water stress wild type tobacco；CK-P35S:StPR1.Water stress transgenic tobacco；F. avenaceum-WT.F. avenaceum stress wild type tobacco；F. avenaceum-P35S:StPR1.F. avenaceum stress transgenic tobacco；F. sambucinum-WT.F. sambucinum stress wild type tobacco；F. sambucinum-P35S:StPR1.F. sambucinum stress transgenic tobacco.The same as Fig.15,17.
图13 马铃薯主要致病真菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草的超氧化物歧化酶活性的变化
Fig.13 Changes of superoxide dismutase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal
2.7.2 过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性 在软腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和致青枯病致病菌 RS 胁迫处理野生型烟草和转 StPR1 基因烟草叶片后,转基因烟草叶片中 POD 的活性会随着 4 种致病菌胁迫时间延长而呈现上升趋势,在每种处理的各个时间段转基因烟草的POD活性都比野生型烟草高(图14)。
采用干腐病致病菌接骨木镰孢和燕麦镰孢处理野生型烟草和转 StPR1 基因烟草叶片后,转基因烟草叶片中 POD 的活性会随着致病菌胁迫时间延长而呈现上升趋势,转基因烟草的CAT活性均高于野生型烟草，结果表明,转 StPR1 基因烟草具有较强的 POD 活性(图15)。
图14 马铃薯主要致病细菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草的过氧化物酶活性的变化
Fig.14 Changes of peroxidase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria
图15 马铃薯主要致病真菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草的过氧化物酶活性的变化
Fig.15 Changes of peroxidase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal
2.7.3 过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性 在软腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和致青枯病致病菌 RS 胁迫处理野生型烟草和转 StPR1 基因烟草叶片后,野生型烟草和转基因烟草叶片中 CAT 的活性会随着 4 种致病菌胁迫时间延长而呈现上升趋势,且在每种处理的各个时间段转基因烟草的CAT的活性都比野生型烟草高(图16)。
图16 马铃薯主要致病细菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草的过氧化氢酶活性的变化
Fig.16 Changes of catalase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria
采用干腐病致病菌接骨木镰孢和燕麦镰孢处理野生型烟草和转 StPR1 基因烟草叶片后,转基因烟草叶片中 CAT 的活性会随着致病菌胁迫时间延长而呈现上升趋势,转基因烟草的CAT活性均高于野生型烟草，结果表明,转 StPR1 基因烟草的 CAT 活性更强(图17)。
图17 马铃薯主要致病真菌胁迫下野生型烟草和转基因烟草的过氧化氢酶活性的变化
Fig.17 Changes of catalase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal
3 讨论
近年来,PRs基因已经成为植物抗病相关基因研究的热点,该基因的表达及功能分析是重要的研究内容[14]。相关转录研究表明,正常植株中,PRs基因显示基础水平表达,但在真菌感染后该表达水平显著提升[15]。Zhang等[16]使用实时定量 RT-PCR 对小麦基因 TaPR10 表达量的变化进行分析,发现 TaPR10 在接种后 12 h上调,并且在 24 h 表达量达到了峰值,结果表明 TaPR10 可能参与小麦抗条锈病防御反应。张计育等[17]克隆获得平邑甜茶 MhPR8基因,其含有保守的构建结构域,属于Ⅲ类几丁质酶。qRT-PCR 结果表明,该基因在 SA 诱导下表达量上调,在参与 SA 通路抗生物和非生物胁迫中发挥关键作用。Sarowar等[18]研究发现,辣椒体内的 CABPR1基因在乙烯利治疗创伤和烟草花叶病毒感染后被强烈诱导,其在烟草植物中的过量表达,不仅增强了对重金属胁迫的耐受性,而且还增强了对疫霉菌和细菌病原体的耐受性。Shi等[19]发现棉花中的 GhWRKY39-1 被生物胁迫所诱导,获得该转基因植物后发现,该基因可以提高 PR基因的表达水平,同时 CAT 和 SOD 等酶的活性升高,使得转基因植物具有较高的耐盐性。乔子辰[20]研究发现,将水稻中白叶枯病菌的 hpa1xoo 基因转入棉花,获得转基因棉,在接种黄萎病菌时,转基因植株体内的 POD 等防御酶活性明显升高,并且直接参与到转基因棉的抗胁迫反应。
在本研究中,将马铃薯的病程相关蛋白基因 StPR1,借助叶盘转化法导入烟草中,并对转基因烟草在马铃薯主要致病细菌 Ecc、Eca、Ech、RS 及致病真菌接骨木镰孢和燕麦镰孢胁迫下进行抗病性及 POD、SOD、CAT 生理指标的分析,发现与野生型烟草相比较,转基因烟草对于致病细菌和致病真菌具有更强的抗性。该基因在其他功能作用的研究尚不足,有待进一步的研究。
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