大豆是我国重要的粮食作物和油料作物，也是我国人民植食性蛋白的主要来源[1]。异黄酮是一种黄酮类化合物，又称植物雌激素[2]，包括游离型的大豆黄素、染料木素和黄豆黄素3种[3]，主要存在于大豆、菜豆、苜蓿等豆科植物中，其中以大豆的含量最高[4]。大豆异黄酮是大豆重要的次生代谢产物之一。它不仅参与调节植物的生长活动，还对人体健康具有重要作用。为了满足市场对大豆异黄酮的需求，高异黄酮含量的大豆品种选育成为育种人员的重要目标之一。
异黄酮主要通过苯丙氨酸代谢途径进行生物合成，这一途径是从莽草酸途径衍生的植物特有的次生代谢途径，也是植物三大次生代谢途径之一[5]。在自然状态中，异黄酮以3种母核的形式存在，它们通过β-糖苷键和葡萄糖结合，形成异黄酮葡萄糖苷，在大豆中存在[6]。黄酮类色素等次生代谢产物的糖苷主要经过糖基化修饰，存在于植物天然次生代谢产物合成的最后一步[7]。UGT是存在于自然界中的一种重要修饰分子，UDP(尿嘧啶二磷酸腺苷)所活化的糖分子也能被UGT转移到生物大分子上。UGT可修饰大豆中的黄酮类化合物，形成异黄酮糖苷，也是异黄酮的合成过程中的一类重要次生代谢产物[8]。目前，UGT基因已在多种植物(如水稻[9]、玉米[10]、荞麦[11]、三花龙胆[12])中被研究，付晓雯 [8]从葛根中成功克隆出具有糖基转移酶活性的GT4基因，并验证该基因可以影响大豆苷元、染料木素、黄豆黄素等物质的合成。李红艳等[13]在丹参中成功克隆糖基转移酶基因SmUF3GT，发现其可以将不稳定的类黄酮色素转化为稳定类黄酮苷元。尤章 [14]发现紫花苜蓿中MsUGT73B2基因影响黄酮物质的合成。Achnine等[15]发现蒺藜苜蓿GT99D基因参与合成黄酮类物质。而大豆糖基转移酶基因功能尚鲜见报道。
本研究以高异黄酮品种中豆27为试验材料，克隆GmUGT73全长序列并构建植物表达载体pCambia3300-GmUGT73，利用发根农杆菌介导大豆快速转化技术来验证GmUGT73基因与异黄酮含量的关系，进而为分子标记辅助育种提供基因资源。
1 材料和方法
1.1 试验材料
大豆品种：中豆27由中国农业科学院作物所培育；东农50由东北农业大学大豆研究所提供。
菌种和载体：K599发根农杆菌、pCambia3300载体、大肠杆菌DH5α感受态。
1.2 试验方法
1.2.1 大豆总RNA提取及反转录 将大豆材料中豆27的种子种在12 cm×12 cm的小方钵中，钵中装灭菌蛭石。将材料放置于16 h光和8 h暗，温度(23±2)℃，湿度60%的光照培养箱内。待大豆幼苗第一轮三出复叶完全展开时，取叶片组织15～30 mg，置于液氮中，依照TRIzol的方法提取高异黄酮品种中豆27叶片的总RNA。采用东洋坊反转录试剂盒说明书进行操作，将RNA反转录成cDNA。
1.2.2 GmUGT73的生物信息学分析 通过测序获得了DNA序列，并且利用DNAMAN软件将其翻译氨基酸序列。利用ProtParam、ProtCcale、TMpred和MEMSAT-SVM在线软件，可以对氨基酸的理化性质、亲水性、疏水性、跨膜结构等指标进行初步分析，进而初步预测基因的功能。
1.2.3 RT-PCR法克隆GmUGT73全长基因 在Phytozomev 11.0数据库查找GmUGT73基因的全长序列，GmUGT73 CDS区域全长1 395 bp，根据GmUGT73 基因的CDS序列设计引物(表1)，将cDNA作为模板DNA进行PCR扩增，反应体系和反应程序根据高保真DNA聚合酶(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase)说明书进行操作。用琼脂糖凝胶电泳检测的方法对目的基因片段进行电泳检测。
表1 PCR引物
Tab.1 Primers for PCR
引物名称 Primer name引物序列 (5′-3′) Primer sequenceGmUGT73-FAGAACACGGGGGACTATGGAGCAACCAACTAGTGTGGmUGT73-RATCCTCTGTTTCTAGTCATAAGGATTCAAGTCCTTG
1.2.4 目的片段回收 获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯照射下，用解剖刀迅速切下含目的片段的琼脂糖凝胶(质量一般小于0.3 g)，放入干净的1.5 mL离心管中，利用胶回收试剂盒将目的片段进行回收，放入-20 ℃冰箱中保存。
1.2.5 表达载体构建与目的基因片段连接 在pCambia3300表达载体上找到单酶切位点，采用XbaⅠ酶，在37 ℃水浴锅中5 h将其载体线性化，采用电泳的方法检验酶切结果。采用电击法将目的片段与植物表达载体相连接，采用的大肠杆菌感受态DH5α是博迈德生物技术公司生产的。
1.2.6 菌液验证及测序 利用PCR鉴定阳性克隆的方法，对菌液进行PCR检测(Easy-Taq为PCR扩增酶)。将鉴定为阳性克隆的菌液送到测序公司测序。利用OMEGA公司生产的提质粒盒子(Plasmid Mini Kit(D6942-02*))对测序合格的样品提取质粒。
1.2.7 大豆根部转化与异黄酮含量测定 根据陈安乐[16]大豆发根转化方法对GmUGT73基因以东农50为材料进行K599发根农杆菌转化与侵染，对根部进行DNA提取，采用PCR鉴定的方法，并根据朱莹等[17]液相色谱法(HPLC)测定异黄酮含量的方法，对大豆根部异黄酮进行测定。
2 结果与分析
2.1 GmUGT73基因的克隆与转化
选取中豆27的第一轮完全展开的三出复叶提取总RNA，通过琼脂糖电泳检测，其中18S和28S条带清晰可见(图1)。通过Nanovue仪器对提取的总RNA进行浓度检测，结果表明，RNA纯度较高，完整性好，适合反转录成cDNA，进行基因克隆。
图1 RNA电泳图
Fig.1 Agarosegel electrophoriesis of RNA
将中豆27的第一轮三出复叶总RNA逆转录成cDNA，并以其为模板、GmUGT73-R和GmUGT73-F为引物，经PCR反应后获得目的片段，其长度为1 000～2 000 bp，与目的基因片段长度一致(图2)，然后通过In-Fusion连接的方法将目的基因连接到植物过表达载体上。
对转化大肠杆菌的菌液进行PCR阳性检测(图2)，将阳性克隆的菌液送至测序公司进行测序，下载全基因组基因序列与测序结果比对，将完全匹配的序列作为最终序列。
图2 目的基因电泳图
Fig.2 Electrophoresis result of gene amplification
2.2 生物信息学分析
利用在线软件对GmUGT73蛋白序列的一级结构进行分析，结果表明，GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸，分子质量为51.186 5 ku，理论等电点(pI)为6.27，其原子总数为7 176，其分子式是C2281H3580N608O685S22。在GmUGT73蛋白的氨基酸序列中，含量最多的是Leu，占总数的11.6%；不存在Pyl和Sec 2种氨基酸。GmUGT73蛋白质总正电和负电残基数分别为37和41，蛋白不稳定系数为36.93，表明该蛋白相对比较稳定。GmUGT73蛋白GRAVY值为-0.111，脂溶指数为86.19，属于亲水性蛋白。蛋白质二级结构预测得到GmUGT73蛋白质中含有33.19% α-螺旋、41.59%片层结构、4.74% β-转角、20.47%无规则卷曲。用在线软件SWISS-MODEL预测中豆27中GmUGT73蛋白的三级结构(图3)。
图3 GmUGT73蛋白三级结构的预测
Fig.3 Predict of 3-D structure of GmUGT73 protein
2.3 PCR鉴定发根农杆菌阳性克隆
用基因克隆引物对含有目的基因的发根农杆菌采取PCR阳性鉴定，结果显示，菌液均为阳性克隆，代表目标转化成功(图4)。
2.4 转基因阳性根鉴定
对接种20 d后的发根植株，随机选取10株，提取根部中的DNA，采用PCR检测的方法对其进行阳性鉴定，结果显示其中9株为阳性(图5)。
1.DL2000 Marker；2-6.5个不同单克隆菌液；7.水阴性对照； 8.大肠重组质粒pCambia3300-GmUGT73阳性对照。 1.DL2000 Marker；2-6.Five different monoclonal solutions； 7.Water negative control；8.E.coli plasmids pCambia3300-GmUGT73.
图4 pCambia3300-GmUGT73转大肠杆菌PCR初步鉴定
Fig.4 PCR results of Escherichia coli containing the recombinant plasmid pCambia3300-GmUGT73
1-10.选取的10株发根植株；水.阴性对照；M.DL2000 Marker。 1-10.Chosen ten root plants；Water.Negative control；M.DL2000 Marker.
图5 PCR鉴定阳性根结果
Fig.5 Positive root PCR results
2.5 转基因阳性根异黄酮含量测定
随机选取5株转基因阳性根，并将其与对照处理同等条件下采用高效液相色谱(HPLC)进行异黄酮相关含量的测量，结果显示，转基因阳性根中大豆苷元和大豆苷含量极显著高于对照材料，其他组分无显著变化，对2组数据进行差异性分析，差异达极显著水平(P<0.01)，所以初步认定GmUGT73基因具有促进异黄酮合成的作用(图6)。
1.对照大豆根系；2-6.转基因阳性发根根系。不同大写字母代表对照与转基因根系之间异黄酮含量的差异极显著(P<0.01)。 1.Control roots；2-6. Transgenic positive roots.Different capital letters represent extremely significant differences in isoflavone content between control and transgenic roots(P<0.01).
图6 转基因阳性根异黄酮含量
Fig.6 Isoflavone content of transgenic positive roots
3 讨论与结论
转基因技术和基因编辑技术不断提高，伴随产生了更多的遗传转化方法和技术，给分子育种和定向改良作物性状提供新思路。至今在植物中使用较多的方法有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等，其中科研人员最为热衷的是农杆菌介导法，主要是其价格成本低、耗时短[18]。采取发根农杆菌转化的方法，可以影响次生代谢产物的合成[19]。证明发根农杆菌转化在筛选异黄酮合成基因方面具有可行性。付晓雯 [8]研究发现，葛根中异黄酮含量受到糖基转移酶相关基因的影响。Baek等[20]研究发现，朝鲜黑莓中糖基转移酶基因在类黄酮合成过程中发挥重要作用。本研究通过发根农杆菌介导法将GmUGT73基因转入东农50品种中，获得15个转基因阳性根，用高效液相色谱法测定转基因阳性根组织的异黄酮含量，验证GmUGT73基因是否参与大豆异黄酮的合成过程。结果证明GmUGT73基因可能参与大豆异黄酮的积累过程。
大豆异黄酮多以苷元形式发挥生物功能，糖基化后其生理作用发生改变[21-23]。因此，糖基化对异黄酮组分的生物功能具有重要的作用。最早发现的大豆异黄酮特异UGT基因是GmIF7GT，它是在大豆幼苗中提取出来的[24]，它对异黄酮合成具有促进作用。后来Dhaubhadel等[25]发现UGT73F2糖基转移酶基因可以促进染料木素和黄酮黄豆黄素合成，从而使黄豆黄苷和染料木苷的含量增多。本研究以中豆27为试验材料，克隆出糖基转移酶基因GmUGT73，连接pCambia3300过表达载体，通过K599转化发根农杆菌，结果表明，发根中的大豆苷元(Daidzein)和大豆苷(Daidzin)含量增加，异黄酮含量显著提高，这表明GmUGT73参与大豆异黄酮代谢过程。
通过RT-PCR方法从大豆中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列；GmUGT73基因编码区编码464个氨基酸，分子质量为51.186 5 ku，该基因编码的蛋白比较稳定，亲水性较强；成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体，发根农杆菌介导法转化大豆东农50，获得的转基因阳性根中异黄酮含量和对照处理相比极显著提高(P<0.01)，说明该基因可能具有合成大豆异黄酮的功能。
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