矮秆紧凑型玉米具有抗倒伏、耐密和适宜机械化生产等特点[1-4]，但目前可供利用的玉米矮秆基因资源比较单一，遗传基础狭窄，主要集中在br2[5-7]。进一步发掘新的玉米矮秆资源、加强矮化基因的鉴定与利用，为矮秆、紧凑、耐密优良玉米杂交种的选育提供物质和技术储备，对玉米矮化育种具有十分重要的意义[8-13]。根据MaizeGDB数据库资料，控制玉米株高的有近250个QTLs，分布在10 条染色体上；已报道玉米矮秆单基因如br、br-2、bv和D8等60多个，大部分为隐性基因，但基因D8、D9、D(t)[14]、D*-10[15]、D11[16]等为显性单基因，基因br-2[17]、an1[18]、D8[19]、D9[20]、d3[21]和D(t) [22]等已成功克隆。本研究以矮秆突变体K125d为主要研究材料，从主要性状表现、矮秆性状的遗传模式、控制该矮秆性状的基因定位与克隆等方面，进行系统的遗传评价，以期明确该突变体在玉米矮化育种方向的应用价值，为其应用研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

矮秆突变体K125d(P1)，7个测验种(P2)，以及构建的正反交F1、B1、B2和F2共6个世代群体。7个测验种名称及主要特征为，K211(K125d同源高秆)、K123d和626(矮秆)、K365和K363(中秆)、K305和K236(高秆)。以上材料均由四川农大正红生物技术有限责任公司(以下简称公司)提供。

1.2 试验设计

1.2.1 K125d与K211形态差异比较 在公司四川双流育种基地种植K125d和K211，选取有代表性的30个单株考察株高等主要农艺性状；成熟时，在各材料小区中间收获有代表性的30个果穗晒干，于室内考查主要经济性状；对植株进行拍照对比。

1.2.2 K125d矮秆性状遗传模式分析 试验在四川双流和雅安2个生态点进行。其中，每个点种植P1和P2群体各36株，正反交F1群体各84株；将籽粒最多的B1和B2果穗平均分成2份，在2个点全播；F2群体每试验点均播种336粒。对分离群体进行株高鉴定，用χ2检验株高分离比例适合性，确定其遗传模式。

1.2.3 K125d矮化基因定位 定位群体为(K236×K125d)F2，在公司四川双流育种基地播种1 400粒，为扩大定位群体规模，将上述用于遗传模式分析的群体也用于定位使用。单株编号挂牌，分别判定高、矮株类型并登记。采用集团分离分析法(Bulked segregation analysis，BSA) [23]进行基因定位，在定位群体中各选取10株极高和极矮单株提取DNA并等量混合，构建高秆和矮秆基因池。选取由上海生工生物工程股份有限公司合成的458对SSR引物(查自Maize Genetics and Genomics Database，http://www.maizegdb.org)，用于亲本K236和K125d间的多态性引物筛选；然后在高秆和矮秆基因池间，进一步筛选多态性标记，筛选出可能与矮秆连锁的分子标记；再用定位群体中的典型高秆和典型矮秆植株各10株进行验证；最后用定位群体中的255个矮秆单株进行扩增。用2×CTAB法提取DNA并纯化，PCR反应体系用25 μL，PCR扩增产物用3% 琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像系统成像后观察统计带型，用MAPMAKER 3.0软件进行连锁分析，用MAPDraw V2.1[24]绘制遗传连锁图谱。

2 结果与分析

2.1 K125d与K211主要性状比较

K125d与K211的植株对比见图1，可见K125d植株叶片密集重叠，节间短、株高和穗位高较矮。考种结果表明，它们的果穗均为筒型、白轴、籽粒半马齿型，K211籽粒黄色，K125d籽粒白色。将它们主要农艺和经济性状比较结果列于表1，可见，与K211相比，K125d生育期极显著变长；株高、穗位高和叶夹角分别降低53.07%，71.46%和21.81%，均达极显著水平；但叶片数和叶宽均极显著增加，其增加比例分别为22.75%和15.15%，其余农艺性状差异不显著；就主要经济性状来看，K125d虽然穗长、穗粗和穗行数差异不显著，但行粒数和百粒质量却显著或极显著降低，造成单株产量极显著降低34.41%。

注：±.标准误; 2 组处理数据后的英文字母不同，则表示这2 组处理间的数据差异显著，小写字母代表P=0.05水平差异显著；大写字母代表P=0.01水平差异显著。

Note:±.SE; If the English letters of the two groups were different，the difference between the two groups was significant difference, lowercase letters means significantly different at P=0.05；Capital letters means significantly different at P=0.01.

2.2 突变体K125d株高的遗传分析

2.2.1 F1正反交群体株高表现 将K125d配制的7个F1正反交群体株高表现列于表2。可见，所有正反交F1群体在2个试验点均表现为高秆，且正、反交群体平均株高无显著差异，说明K125d株高遗传表现无细胞质效应，即该矮秆性状可能由核基因调控。另外，除用测验种K211配制的组合K125d×K211外，测验种株高越高，其相应的F1群体株高也有增高趋势，即用高秆测验种配制的组合其平均株高高于中秆、中秆高于矮秆；雅安点F1株高比双流点有增高的趋势，表明F1株高由双亲遗传背景共同控制，并受生态环境影响。

2.2.2 F2和回交群体的株高频次分析 将F2和回交群体的植株高度作分布频次分析，结果为用K125d回交的所有B1和F2群体的植株高度均表现为双峰分布；B2群体(用K123d回交的B2除外)均表现高秆，表明K125d矮秆性状由多基因控制的可能性不大。

2.2.3 回交群体的株高分离比例分析 将用K125d构建的7个B1回交群体和用K123d构建的B2回交群体的株高分离比例结果列于表3。可见，在四川双流和雅安，7个B1回交群体均出现高矮分离，分离比例符合1∶1；用626、K211、K236、K305、K363和K365等测验种构建的6个B2回交群体在2个生态点均表现为高秆，表明可能由1对隐性核基因控制K125d的矮秆性状。至于用K123d构建的B2回交群体出现高矮分离，分离比例符合1∶1，其原因可能是控制K125d和K123d矮秆性状的基因不等位。

注：临界t值， χ20.05(1)=3.84, χ20.01(1)=6.63。表4同。

Note: The critical t value, χ20.05(1)=3.84, χ20.01(1)=6.63.The same as Tab.4.

2.2.4 F2群体的株高分离比例分析 将用K125d构建的7个F2群体的株高分离结果列于表4。可见，所有F2群体在雅安和双流2个生态点株高分离规律表现一致，除(K125d×K123d)F2群体外，其余6个F2群体植株高矮分离符合3∶1，进一步表明由1对隐性核基因控制K125d的矮秆性状。而(K125d×K123d)F2群体植株高矮分离比例为9∶7，符合2对隐性单基因控制同一性状分离比例，表明控制K125d和K123d矮秆性状的隐性单基因不等位。

综合分析表明，K125d与7个不同株高自交系配制的F1正反交群体，在2个试验点均表现为高秆，其对应正、反交群体间的株高差异不明显，证明控制K125d矮秆性状的基因无胞质效应；除K123d外(br2类型)[11]，与其余6个不同株高自交系配制的B1回交群体，高、矮秆分离比例为1∶1，B2回交群体全为高秆，F2群体高、矮秆分离比例为3∶1，充分证明K125d的矮秆性状受1对隐性核基因控制，暂命名为d125。用K125d和K123d构建的回交群体B1、B2及自交F2群体，其群体植株高矮分离，比例分别为1∶1、1∶1和9∶7，符合由2对互补隐性基因控制株高遗传表现的分离比例规律，表明基因d125与br2可能不等位。

2.3 矮秆基因d125的定位

基因定位群体为(K125d×K236)F2，选取均匀覆盖10条玉米染色体上的SSR引物458对，筛选出在双亲间多态性较好的引物109对；进一步在高、矮秆基因池间对这109对引物进行多态性筛选，其中多态性表现较好的引物为umc2235。以引物umc2235分布的位置为参考，选择并合成位于玉米第一条染色体1.05～1.09位置区间的SSR引物153对继续进行多态性筛选，结果发现bnlg1619、umc1085、umc1278、umc1601、umc1689、umc1035、umc2560、umc2569和umc2387等9对引物在高、矮秆基因池间均表现出多态性，至此，共筛选出在高、矮基因池间具有多态性的SSR引物10对。

用上述10对SSR引物，对255个矮秆单株DNA，分别进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统对电泳结果照相，统计10对引物对定位群体中所有矮秆单株DNA扩增带型。扩增结果连锁分析用作图软件MAPMAKER 3.0，将重组率转化为遗传距离用Kosambi函数转化，引物与矮秆基因d125的连锁关系用“Group”命令(LOD值大于3.0，重组率小于50%)判断，各标记间的图距用MAP命令计算，用MAPDraw V2.1 构建遗传连锁图谱。结果为，矮秆基因d125，初步定位于1号染色体上，介于umc2569和umc1278 2个SSR分子标记之间，其遗传距离分别为6.6，5.1 cM(图2)。

2.4 矮秆基因d125的克隆

根据定位结果，位于标记umc2569和umc1278附近的已知矮秆基因有5个，br2(bin 1.06)、br1(bin 1.07)、d*-N1352B(bin 1.06)、smp*-N706A(bin 1.06)和d*-N454A(bin 1.06)，在MaizeGDB中搜索相关信息发现仅有br2关联有基因模型，因此以br2作为候选基因进行克隆。

根据br2基因模型GRMZM2G315375设计了8对重叠引物(图3-A)，用于扩增br2的5个外显子区域。克隆结果如图3-B所示，可见引物d125-8从K125d中扩增产物比K211约小250 bp(图3-B中的箭头所示)；对扩增产物的测序结果如图3-C所示，可见d125在第1 651个碱基处有一个9 bp片段的插入，在第6 438碱基处有一个232 bp片段的缺失。通过DNAMAN对编码序列进行翻译显示，d125插入的9个碱基编码谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和甘氨酸(G)，该位置不在功能结构域内(图3-D中三角形所示)；而缺失导致从第1 288个氨基酸后产生移码突变(如图3-D的箭头所示)，该突变区域在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)的注释为与各种细胞活动有关的ATP酶，而在P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)中为核酸结合域(Nucleotide binding domain，NBD)，该功能域功能主要是为PGP转运提供能量。

3 讨论与结论

3.1 矮秆突变体K125d株高的遗传模式

玉米矮秆基因的遗传一般分为单基因和多基因2种遗传模式[25-26]，针对一个新的矮秆资源，常用与其他自交系构建的F1、B1、B2和F2群体的株高分离表现情况，来分析判断其遗传模式，如张素梅等[14]于2007年就做过类似研究。本研究用矮秆突变体K125d与同源自交系K211以及2个矮秆、中秆和高秆自交系，构建的正反交F1，回交B1、B2和自交F2群体分析其遗传模式，结果为K125d矮秆性状受1对隐性核基因控制，命名为d125。

3.2 矮秆基因d125初步定位结果

MaizeGDB已收录矮秆基因60多个，定位在玉米1号染色体上的有11个。基因br2是发现较早且研究较多的玉米矮秆基因，该基因与生长素的合成相关，已被成功克隆[17]。笔者将矮秆基因d125初步定位在1号染色体umc2569和umc1278 SSR分子标记之间，其距离分别为6.6,5.1 cM，在染色体上的位置与矮秆基因br2(bin 1.06)和br1(bin 1.07)等相近。

3.3 矮秆基因d125序列及功能预测

br2是目前应用较多的玉米矮秆基因，编码1个PGP蛋白，由两部分组成，各部分均包含了6个假定的跨膜结构域和一个细胞内的ATP结合域，并具有各自的功能[27]。已克隆得到的br2等位基因中，br2-6、br2-7和br2-9均在外显子1有插入，br2-3在内含子4中有插入[17]，br2-23在第6 667个碱基处有8 bp缺失[28]，株高QTL-qph1中SNP5259(T)编码的氨基酸带点性质改变可能使蛋白与底物结合能力下降[29]，高粱中与br2同源的dw3，其在外显子5上有一个882 bp单元的直接重复，使得该基因功能缺失[17]，致使编码蛋白功能散失。d125在第6 438碱基处缺失232 bp，包含了br2-23中的缺失部分，缺失产生移码突变，这部分位于PGP蛋白和ABC转运蛋白中的NBD内。NBD的功能主要是为PGP转运提供充足的能量，而保守的结构域保证ATP结合与水解[30]，2个Walker结构中任一个突变导致功能完全丧失[31]，而D125蛋白中也具有这个保守结构。此外，NBD含有约215个氨基酸构成的核心区，核心区内的部分氨基酸是保守的，对整个蛋白质的功能具有极其重要的作用[32]。Walker B附近的小片段可能直接或间接地参与底物相互作用和NBD到跨膜域间的信号转导，是PGP蛋白中底物结合的主要位点[17]。d125在Walker B后移码，造成的功能位点缺失可能是导致转运功能丧失的主要原因。

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Genetic Analysis of Maize Dwarf Mutant K125d

SHI Haichun1,2,CHEN Li1,3,LI Kaibing1,4,YU Xuejie1,2,YUAN Jichao1,QUBI Wuhe2,KE Yongpei1,2

(1.College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China;2.Sichuan Nongda Zhenghong Bio Co. Ltd.,Shuangliu 610213, China;3.Sichuan Ya′an Science and Technology and Intellectual Property Office, Ya′an 625000, China;4.Bureau of Agriculture and Rural Affairs of Bijie City, Bijie 551700,China)

Abstract： It is of great significance to explore, study and utilize the new dwarf maize resources in maize dwarf breeding. The study compared and analyzed the morphological differences between dwarf mutant K125d and homologous K211 inbred lines. The reciprocal F1, B1, B2 and F2 populations between K125d and seven inbred lines with different heights were used to analyze the genetic model of dwarf characters in mutant K125d and to locate the dwarf gene by BSA-SSR labeling method. Compared with K211, K125d displayed significantly longer growth period, shorter plant height, dense leaf overlapping, increased leaf number and leaf breadth, and decreased leaf angle. The experiment results were consistent in all populations from two different ecological sites. The height of reciprocal F1 was taller. The separation proportions of B1 and F2 populations were 1∶1 and 3∶1, respectively. The heights of B2 populations were tall in six populations except K123d. The plant height of dwarf mutant K125d was controlled by a recessive nuclear gene, which was tentatively named d125. The F2 population from k125d×K236 was used as the locating population. The dwarf gene d125 was initially located on the long arm of chromosome 1, between SSR markers umc2569 and umc1278 with the genetic distances of 6.6,5.1 cM, respectively. It was concluded that d125 was cloned from gene ID GRMZM2G315375, which had an insertion of 9 bp fragment at +1 651 locus and a deletion of 232 bp fragment at +6 438 locus compared to K211. The deletion led to frameshift mutation, and the loss of functional sites might be the main reason for the loss of transport function.

Key words: Maize；Dwarf mutant；K125d；Genetic analysis；Gene location；Gene cloning

中图分类号：S513.03

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2020)01-0065-08

doi:10.7668/hbnxb.20190244

收稿日期：2019-08-09

基金项目：四川省重点研发项目(2019YFN0012)；科技支撑计划项目(2016NYZ0006；2011FZ0119)；战略性新兴产业发展专项资金(SC2013510122023)

作者简介：石海春(1974-)，男，四川宣汉人，教授，博士，博士生导师，主要从事玉米遗传育种和种子学教学与科研工作。

通讯作者：柯永培(1963-)，男，四川内江人，教授，博士，博士生导师，主要从事玉米遗传育种研究。