猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)引起的接触性、传染性肠道疾病[1]。感染后，2 周龄以内仔猪死亡率高达100%，5 周龄以上的猪死亡率较低，成年猪一般无死亡现象[2]。TGEV为巢状病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)成员，它是仔猪急性病毒性腹泻的重要病原之一，可导致养猪业遭受破坏性的经济损失[3]。1933年，TGEV首次报告于美国。中国在1970年第1次检测到TGEV[4]。
TGEV基因组为不分节段的单股正链RNA，长度约28.5 kb，可分别编码纤突(Spike)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白等4 种结构蛋白以及5种非结构蛋白[5]。TGEV M蛋白高度糖基化，有助于病毒核衣壳与囊膜结合[6]。M蛋白羧基末端暴露于病毒颗粒外表面，具有良好的免疫原性和反应原性[7]。
病毒亲和肽可与病毒特异性结合，在诊断和治疗领域具有良好的应用前景[8]。Zou等[9]曾通过噬菌体展示技术对TGEV病毒亲和肽进行了筛选。其对含有TGEV M蛋白的重组蛋白为靶分子进行了5 轮生物淘选，成功筛选出10 种能与靶分子蛋白结合的十二肽，并通过噬菌体ELISA验证了亲和肽与病毒粒子的亲和性。本研究选取这10 种十二肽中亲和性最强的3 种，通过串联表达方法进行体外表达，并利用Western Blot、Dot-ELISA等方法检测重组蛋白的病毒亲和性。本研究为建立TGEV感染诊断方法和检测技术奠定了一定的物质基础和理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种、质粒和抗体 原核表达载体pET-32a、pGEX-6p-1、大肠杆菌DH5α和Rosetta(DE3)由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院动物免疫学实验室保存。TGEV阳性血清购自中国兽医药品监察所；辣根过氧化物酶(HRP)标记His标签单克隆抗体和HRP标记GST标签单克隆抗体购自Thermo Fisher公司。HRP标记羊抗猪抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TGEV H株(1×105 TCID50/mL)由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA分子质量标准、T4 DNA连接酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司。高保真KOF Taq酶、dNTP mix和4氯-1-奈酚(4-CN)购自哈尔滨超峰生物科技发展有限公司。质粒提取试剂、胶回收试剂盒，购自上海近岸科技有限公司。蛋白分子质量标准购自Thermo Fisher公司。其余常规试剂为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 TGEV M蛋白亲和肽基因的设计与合成 根据Zuo等[9]的研究结果，从10 种可与TGEV M蛋白结合的十二肽中选取亲和力最强的3种，每种亲和肽之间用linker(AAAK)连接。根据设计好的重组蛋白序列，对其推导的核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化，并交由哈尔滨博仕生物技术有限公司进行合成，合成基因插入到pUC57质粒中，该质粒命名为pUC57-MQHT。pUC57-MQHT用无菌去离子水进行1∶10 000稀释，作为PCR模板。
1.2.2 M蛋白亲和肽基因的亚克隆 根据合成的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计合成1对引物。PU：5′-CGCGGATCCGAATGCATCAAGAT CAAT-3′；PL：5′-GGGCCGCTCGAGTTAATCCGATAT TGG-3′。
上游引物PU插入BamHⅠ酶切位点，下游引物PL插入XhoⅠ的酶切位点(下划线表示)。该引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。合成后的引物稀释成50 pmol/μL，-20 ℃保存备用。
将2×Taq酶预混液(包含Buffer，dNTP)12.5 μL，PU 0.5 μL(25 pmoL/μL)，PL 0.5 μL(25 pmol/μL)，模板0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，KOF Taq酶0.5 μL，共25 μL。PCR程序设计为，94 ℃ 1 min 30 s；94 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 重组表达载体的构建 PCR产物、表达载体pET-32a和pGEX-6p-1分别用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切。酶切产物经胶回收。将回收后的PCR产物与pET-32a或pGEX-6p-1连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素(Amp)100 μg/mL 的LB平板，37 ℃过夜培养。挑取单菌落接种至含有Amp 100 μg/mL的液体LB中，37 ℃过夜培养，提取质粒。单、双酶切鉴定质粒。将相应克隆菌寄送哈尔滨博仕生物科技有限公司进行序列测定。测序鉴定正确的重组质粒分别命名为pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。
1.2.4 重组蛋白的诱导表达 将重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布LB平板(Amp，100 μg/mL)。过夜培养，挑取单菌落，获得重组菌株。重组菌首先接种LB液体培养基(Amp，100 μg/mL)，37 ℃振荡培养过夜。再以1%比例转接新鲜的LB液体培养基，37 ℃振荡培养2～3 h后，测菌液OD600达0.5～0.6时，加入至终浓度1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导1～4 h后收获细菌，进行SDS-PAGE电泳分析。重组蛋白分别命名为TRX-MQHT和GST-MQHT。
1.2.5 重组蛋白的纯化及鉴定 重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，用0.3 mol/L 4 ℃预冷的KCl溶液预染5 min，切下含目的蛋白的凝胶，碾碎，加入PBS悬起，反复冻融3 次，10 000 r/min离心5 min，取上清液。采用Bradford检测法分别对重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT的含量进行测定[10]。纯化的重组蛋白经SDS-PAGE后，转印至硝酸纤维素(NC)膜，5%脱脂乳4 ℃封闭过夜，PBST洗3 遍，浸入1∶100稀释的HRP标记的His标签单克隆抗体或HRP标记的GST标签单克隆抗体中，37 ℃作用2 h，PBST洗涤3 次后用4-CN显色。
1.2.6 Western Blot鉴定重组蛋白的病毒亲和性 纯化的重组蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT经SDS-PAGE后，转印至NC膜上，5%脱脂乳4 ℃封闭过夜，PBST洗3 遍，3 min/次，浸入TGEV H株(1×105 TCID50)稀释液中，37 ℃作用2 h，PBST洗3 遍，3 min/次，浸入PBS稀释的质量浓度为1 mg/mL的重组蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT中，室温作用2 h，PBST洗涤3 遍，3 min/次，浸入1∶1 000稀释的HRP标记GST标签单克隆抗体或His标签单克隆抗体中，室温作用1 h，PBST洗涤3 遍，3 min/次，用4-CN显色。
1.2.7 Dot-ELISA鉴定重组蛋白病毒亲和性 按照以下步骤进行Dot-ELISA操作。在NC膜表面划4 mm×4 mm小方格，先将NC膜在去离子水中浸泡10 min，取出置于室温晾干。用微量移液器吸取1 μL 1 mg/mL的重组蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT，点于小方格的正中央，置于室温晾干。将包被的膜片放入5%脱脂乳中，37 ℃封闭作用60 min后取出，PBST洗涤3 次，2 min/次，室温晾干。将膜片裁剪成小片，点样面朝上置于96 孔酶标板孔内，加入100 μL PBS 倍比稀释的TGEV H株中(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800)，37 ℃ 60 min；每孔加入150 μL PBST泡洗3 次，2 min/次，再用PBS洗涤1 遍，2 min；加入100 μL 1 mg/mL的重组蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT中，37 ℃ 60 min；弃去重组蛋白，每孔加入150 μL PBST泡洗3 次，2 min/次，再用无磷酸盐缓冲液洗涤1 遍，2 min；每孔加入100 μL 1∶1 000稀释的GST标签单克隆抗体或His标签单克隆抗体，37 ℃作用30 min；弃去酶标抗体，每孔加入150 μL PBST泡洗2 次，2 min/次，再用PBS洗涤1 遍，2 min；每孔加入100 μL显色液，37 ℃ 避光显色，5 min后观察；弃去显色液，每孔加入150 μL去离子水泡洗3 次，1 min/次，甩干后取出膜片干燥，拍照。
1.2.8 阻断试验 将TGEV H株分别与1∶100，1∶200，1∶400，1∶800稀释的TGEV阳性血清孵育，4 ℃作用过夜，10 000 r/min离心30 min，取上清。Dot-ELISA法检测阻断效果。膜片预处理按前述方法进行。按1.2.7中所述的Dot-ELISA方法进行检测，观察其反应情况。
2 结果与分析
2.1 重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT的酶切鉴定
构建的重组质粒pET-32a-MQHT、pGEX-6p-MQHT分别采用BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，pET-32a-MQHT经BamHⅠ单酶切获得了6 050 bp的DNA条带，BamHⅠ/XhoⅠ双酶切获得了5 900 bp的载体片段和大小为150 bp的目的条带；pEGX-6p-MQHT经BamHⅠ单酶切获得了5 140 bp的DNA条带， BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切获得了4 990 bp的载体片段和大小为150 bp的目的条带(图1)。上述酶切结果与预期一致。测序结果证明插入位置与阅读框均正确。
2.2 重组蛋白的表达
将构建的重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，经1.0 mmol/L IPTG诱导后1，2，3，4 h取样，SDS-PAGE检测全菌体细胞沉淀，结果表明，获得的重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT大小分别为25，31 ku，与预期相符(图2，箭头所示)。
M1.DNA分子质量标准DL15000；1.pET-32a空载体BamHⅠ单酶切；2.pET-32a-MQHT BamHⅠ单酶切；3.pET-32a-MQHT BamHⅠ/XhoⅠ双酶切；4.pGEX-6p-1空载体BamHⅠ单酶切；5.pGEX-6p-MQHT BamHⅠ单酶切；6.pGEX-6p-MQHT BamHⅠ/XhoⅠ双酶切；M2. DNA分子量标准DL2000。
M1.DNA Marker DL15000；1.pET-32a digested by BamHⅠ；2.pET-32a-MQHT digested by BamHⅠ；3.pET-32a-MQHT digested by BamHⅠ/XhoⅠ； 4.pGEX-6p-1 digested by BamHⅠ；5.pGEX-6p-MQHT digested by BamHⅠ；6.pGEX-6p-MQHT digested by BamHⅠ/XhoⅠ；M2. DNA Marker DL2000.
图1 重组表达载体pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT的酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant expression vectors by restriction enzyme digestion
A.SDS-PAGE检测重组蛋白TRX-MQHT的表达： M.蛋白质分子质量标准；1.诱导前的pET-32a空载体；2.诱导后4 h的pET-32a空载体；3.未诱导的pET-32a-MQHT/E.coli Rosetta(DE3)重组菌；4-7.诱导1～4 h的pET-32a-MQHT/E.coli Rosetta(DE3)重组菌。B.SDS-PAGE检测重组蛋白GST-MQHT的表达：M.蛋白质分子质量标准；1.诱导前的pGEX-6p-1空载体；2.诱导后4 h的pGEX-6p-1空载体；3.未诱导的pGEX-6p-MQHT/E.coli Rosetta(DE3)重组菌；4-7.诱导1～4 h的pGEX-6p-MQHT/E.coli Rosetta(DE3)重组菌。
A.Detection of recombinant protein TRX-MQHT by SDS-PAGE：M.Protein Marker; 1.pET-32a/E.coli Rosetta(DE3) before induction; 2.pET-32a/E.coli Rosetta(DE3) induced for 4 h;3.pET-32a-MQHT/E.coli Rosetta(DE3) before induction; 4-7.pET-32a-MQHT/E.coli Rosetta(DE3) induced for 1-4 h. B.Detection of recombinant protein GST-MQHT by SDS-PAGE：M.Protein Marker; 1.pGEX-6p-1/E.coli Rosetta(DE3) before induction; 2.pGEX-6p-1/E.coli Rosetta(DE3) induced for 4 h;3.pGEX-6p-MQHT/E.coli Rosetta(DE3) before induction; 4-7.pGEX-6p-MQHT/E.coli Rosetta(DE3) induced for 1-4 h.
图2 重组蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein
2.3 重组蛋白的纯化及鉴定
重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT的切胶纯化结果如图3-A所示。经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定的结果表明，所获得的表达蛋白为重组蛋白(图3-B)。
2.4 Western Blot鉴定重组蛋白的病毒亲和性
纯化的重组蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT转印至NC膜上后，与TGEV病毒粒子孵育，再与重组蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT孵育，最后用抗GST或His单抗进行检测，如图4所示，2种重组蛋白都显示出阳性印记，而对照TRX或GST标签蛋白无印记。
2.5 Dot-ELISA鉴定重组蛋白病毒亲和性
纯化的重组蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT包被至NC膜上后，与TGEV病毒粒子孵育，再与重组蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT孵育，最后用抗GST或His单抗进行检测，如图5所示，2 种重组蛋白在1×103，5×102，2.5×102 TCID50/mL 3 个滴度时都显示出阳性印记，而在1.25×102 TCID50/mL滴度时无可见斑点，2 种重组蛋白检测TGEV的最低滴度无明显差异,检测TGEV的敏感性为2.5×102 TCID50/mL。TGEV亲和性良好。
A.重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT纯化结果：M.蛋白质分子质量标准；1.TRX-MQHT；2.GST-MQHT；3.TRX蛋白；4.GST蛋白。B.重组蛋白TRX-MQHT和GST-SQHT Western Blot鉴定结果：1.TRX-MQHT；2.TRX蛋白；3.GST蛋白；4.GST-MQHT；5.GST蛋白；6.TRX蛋白。
A.Purification results of recombinant protein TRX-MQHT and GST-MQHT： M.Protein Marker; 1.TRX-MQHT；2.GST-MQHT；3.TRX protein；4.GST protein.B.Identification of recombinant protein TRX-MQHT and GST-SQHT by Western Blot：1.TRX-MQHT；2.TRX protein；3.GST protein；4.GST-MQHT; 5.GST protein; 6.TRX protein.
图3 重组蛋白的纯化及鉴定
Fig.3 Purification and identification of recombinant protein
1.TRX-MQHT；2.TRX标签蛋白；3.GST-MQHT；4.GST标签蛋白。
1.TRX-MQHT; 2.TRX;3.GST-MQHT; 4.GST.
图4 Western Blot鉴定重组蛋白的TGEV亲和性
Fig.4 Identification of the affinity of recombinant protein to TGEV by Western Blot
A.TRX-MQHT；B.GST-MQHT：
1.1×103 TCID50/mL；2.5×102 TCID50/mL；
3.2.5×102 TCID50/mL；4.1.25×102 TCID50/mL。
图5 Dot-ELISA鉴定重组蛋白的TGEV亲和性
Fig.5 Identification of the affinity of recombinant protein to TGEV by Dot-ELISA
2.6 阻断试验
以重组蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT为包被物，以不同浓度稀释(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800)的TGEV阳性血清预先处理的TGEV H株为捕获对象，最后以重组蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT为二次亲和物，进行Dot-ELISA检测。检测结果表明(图6)，1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株(1×105 TCID50/mL)与2 种亲和肽的结合。2 种亲和肽检测特异性良好。
A. 包被TRX-MQHT；B. 包被GST-MQHT。1-4. TGEV H株分别与1∶800，1∶400，1∶200，1∶100稀释的TGEV阳性血清作用。
A. TRX-MQHT; B. GST-MQHT.1-4. TGEV H strain co-cultivated with 1∶800, 1∶400, 1∶200, 1∶100 diluted anti-TGEV serum, respectively.
图6 阻断试验
Fig.6 Blocking test
3 结论与讨论
准确的诊断对于TGE的防控至关重要。TGE的初步诊断可根据当地的流行病学以及疑似病猪的临床症状来进行[11]。但由于TGE与猪的其他腹泻性疾病症状相似，因此，TGE的确诊必须进行实验室诊断[12]。目前，已经建立了多种TGEV检测方法，如病毒分离、免疫荧光检测[13]、电镜检测，RT-PCR、纳米颗粒辅助RT-PCR[14]、实时荧光定量RT-PCR[15]、双抗体夹心ELISA[16]、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)[17]和DNA芯片[18]等。用于TGEV检测的RT-LAMP测定法反应时间在60 min以内，较为省时，可通过琼脂糖凝胶电泳直接观察试验结果[19-20]。M蛋白是TGEV囊膜中丰度较高的结构蛋白，保守性高，其也成为建立各种TGEV检测方法的候选蛋白。张小波[21]以原核表达的重组M蛋白作为包被抗原，建立了检测TGEV抗体的间接ELISA方法，并确定了间接ELISA的最佳工作条件。针对M蛋白制备的单克隆抗体和多克隆抗体亦具有良好的应用前景[22-23]。Rodák等[24]制备了针对TGEV N蛋白和M蛋白的单克隆抗体，并建立了竞争-阻断ELISA检测方法，敏感性为1×103 TCID50/mL。
病毒亲和肽在病毒性疾病检测方面也具有良好的应用价值[8]。Zou等[9]以筛选出TGEV M蛋白亲和肽中结合力最高的3 个噬菌体建立了噬菌体ELISA，可以检测到最低的病毒量为0.02 μg。Suo等[25]采用相似的方法筛选TGEV Spike蛋白亲和肽，并以结合力最高的4 个噬菌体建立了噬菌体ELISA，结果显示可以检测到最低的病毒量为0.1 μg，略优于常规ELISA(最低病毒检测量为0.6 μg)。本研究表达的重组M蛋白亲和肽与重组的S蛋白亲和肽的TGEV亲和性是否也有相似的差异，需要进一步的试验来确定。本研究初步建立的Dot-ELISA检测TGEV的敏感性为2.5×102 TCID50/mL，继续优化该Dot-ELISA反应条件后，其敏感性可能会有一定程度的提高。原核表达重组蛋白步骤简单，操作性强，试剂均为实验室常用药品不需要很高的费用[26]，以重组表达的M蛋白亲和肽建立的检测方法有望应用到TGEV的临床诊断中。
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