我国在20世纪80年代开始育种细毛羊，其中的敖汉细毛羊在敖汉、翁牛特旗县开始繁育，父母系均来自于不同的细毛羊品种，父本通常以美利奴羊为主[1]。毛囊是皮肤的一附属结构，它的形成是上皮细胞和真皮细胞间相互作用的结果。在羊毛产量上皮肤和毛囊的性状起到了重要的作用，因此了解皮肤结构和毛囊的发育规律对细毛羊生产显得尤为重要[2]。毛囊的调控也受多种因子影响，因此探究毛囊生长发育的调控基因也显得非常重要。
Hox(Homeobox)基因又称为同源异型盒基因(Homeotic gene)，是胚胎复杂的遗传系统的中心，在胚胎发育过程中，它通过相应的信号指挥胚胎的发生[3]，发出信号作用于不同部位的细胞，使得细胞在分化的过程中接收到来自Hox基因的信号，能够保证各个部位分化出正常的组织和器官，是发育遗传学研究的前沿阵地[4]。Hox家族是动物基因组内高度保守的一类转录因子[5]，目前共有39个[6]，不但在动物体轴形成过程中扮演着重要的角色，对毛囊细胞增殖分化也起着重要作用[7-9]，是一类重要的发育调控基因。通过对人和小鼠的研究发现，大多数Hox家族的基因均在皮肤和毛囊中表达[10]。Hoxa5能够对毛囊细胞的增殖、分化发出信号[9]，从而能够阻断毛囊在退行期时的其他信号的传递，延滞了毛囊的周期发育[11]。Hox基因数目多少、序列的多样性及其表达模式直接决定了动物的生态多样性，因此Hox基因在模式生物系统中的研究相对较广泛。Hoxa5在控制毛生长发育中有重要作用，当缺少或过表达时，小鼠都会表现出毛生长的缺陷[12]。BMPs本身是一种蛋白，BMPs在骨的形成过程中发挥着重要的作用，通过诱导间充质干细胞使其分化成骨，也可以通过诱导促进脂肪细胞向骨细胞分化从而成骨，也有促进胚胎成纤维细胞的分化，进一步分化形成骨骼[13]。有研究表明，BMPs对毛囊细胞的发育也有一定的影响，初步得到对毛囊的发育是抑制作用，至于在哪个时期还有待研究。BMPR1B基因属于BMPs家族的Ⅰ型受体因子，同样它也调节神经细胞、骨细胞等的代谢。近来在绵羊多产基因分子机制上的研究较多，表明骨形态发生蛋白及其受体对动物卵泡发育具有重要影响。在毛囊生长发育上，BMPR1B基因在初级毛囊的毛母质、内根鞘和毛干等均可以表达，在次级毛囊的内根鞘和绒干也将表达[14]，这为研究提供了一定的基础。
目前，在敖汉细毛羊身上基因的研究主要集中在肌肉方面，选取优良基因对肌肉肌纤维粗细的影响，对于有关皮肤毛囊的基因研究还相对较少，有一部分研究也只局限在分子水平上，通过基因mRNA的表达量来初步判断基因的作用；还有一部分是与毛囊无关的研究。本研究不仅从单个基因的mRNA水平和蛋白水平上对功能进行鉴定，并且着重对Hoxa5、BMPR1B两基因之间的相互作用关系进行了鉴定，以分析两者之间的上、下调关系，从而进一步为基因通路的研究提供一定的基础，为基因在个体层次上的研究提供坚实的基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
选取健康40日龄的胎羊。
1.2 主要试验试剂及仪器
PeM-T、pcDNA3.1质粒、Lipofectamine2000、高糖培养液等均购自青岛鑫宇恒一有限公司。BB5060UV 型贺氏二氧化碳培养箱购于德国Eppendorf公司，Western Blot、荧光定量PCR系统均购自Bio-Rad公司[15]。
1.3 表达载体的构建
1.3.1 引物设计及扩增 从NCBI中查找绵羊的Hoxa5(GenBank登录号为NM-015095103.2)、BMPR1B(GenBank登录号为NM-001009431.1)基因全序列，选取Hoxa5基因和BMPR1B基因的CDS区，利用软件Primer 5.0设计2个基因的引物。设计同时需在上下游引物5′端加入保护碱基和EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切位点，最终完成的Hoxa5引物序列为：
上游引物：5′-CCGGAATTCATGAGCTCTTATTTT GTAAAC-3′；
下游引物：5′-CGGGGTACCTAAACGCTCAAATA CTCAGG-3′。
在BMPR1B上下游引物5′端加入EcoR Ⅰ、Nde Ⅰ酶切位点，最终完成的引物序列为：
上游引物：5′-CCGGAATTCATGCTTCAGGTTTG CGAAGT-3′；
下游引物5′-GGAATTCCATATGTCAGATGTCC TGTCTAAGGG-3′[15]。
利用TRIzol裂解成纤维细胞，按照试剂盒说明提取细胞RNA，并将其反转录成cDNA。扩增体系为20 μL:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，金牌Mix 17 μL。
1.3.2 TA克隆 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，对DNA片段进行加A，反应体系为：目的片段15 μL、Tailing-A ReactionBuffer 4 μL、Tap DNA Polymerase 1 μL。TA克隆连接体系为：T4 DNA连接酶2 μL、T4 Buffer 1 μL、T载体2 μL、目的片段5 μL、水浴16 ℃ 3 h，4 ℃ 12 h。取50 μL DH5ɑ与5 μL T连接液混匀冰浴20 min；42 ℃热激90 s，冰浴15 min；加入400 μL LB培养基(不含AMP抗生素)37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，去上清，将细胞均匀分散在含有AMP抗生素的培养基上，在37 ℃培养箱中倒置12 h，挑取单菌进行10 h摇菌[16]。
1.3.3 Hoxa5、BMPR1B基因与pcDNA3.1质粒重组 对TA克隆载体分别进行EcoR Ⅰ、NdeⅠ双酶切和EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ双酶切，酶切体系为：EcoRⅠ内切酶1 μL；Nde Ⅰ内切酶1 μL；Kpn Ⅰ内切酶1 μL；TA克隆载体和pcDNA3.1 5 μL；Buffer 1 μL加水补足到50 μL体系。37 ℃ 2 h，对Hoxa5、BMPR1B基因及切开的pcDNA3.1质粒进行胶回收，取Hoxa5、BMPR1B基因各5 μL，3 μL pcDNA3.1，加入1 μL T4DNA连接酶及1 μL T4 DNA连接酶Buffer，22 ℃金属浴2 h，16 ℃ 3 h，后转入到DH5α感受态细胞中过夜培养，选取单个菌落进行摇菌，利用简单PCR鉴定菌液中是否含有目的基因，对含有的菌液进行测序检测[16]。
1.4 敖汉细毛羊成纤维细胞的培养
从怀孕的母体中取出完整的40日龄胎羊，用75%酒精对胎儿清洗几遍，再用PBS进行清洗并保存。带回细胞间后用75%的酒精清洗，再用含有双抗的PBS清洗。对30日龄的胎羊只留躯干，将躯干分成直径1.0～1.5 cm，并在分离的组织上滴加适当的胎牛血清，覆盖组织即可，37 ℃，5.0% CO2培养箱培养3 h，之后在培养基加入适当的高糖培养液。24 h后先观察细胞生长情况，待细胞生长良好，则给细胞进行换培养液[15]。待细胞密度达95%，去除废旧培养液用预热含有双抗的PBS洗涤几遍，每个平板中加入1 mL的胰蛋白酶，放入CO2恒温培养箱中消化，当大量细胞由梭形变为圆形时加入3 mL的培养液停止消化。根据细胞密度的大小进行分板，继续加入新鲜的培养液进行培养，待细胞密度达95%后，再次进行传代[16]。
1.5 细胞转染
当细胞密度达90%左右时，去除旧的培养液，用不含抗生素的PBS清洗几遍，利用Lipofectamine2000进行转染，共转染组和单转染组分别取其20 μL脂质体试剂，加入480 μL DMEM(不含双抗)，混匀，静置5 min，在共转染组中分别加入20 μL的Hoxa5、BMPR1B质粒，460 μL高糖培养基(不含双抗)，单转染组加40 μL质粒，460 μL高糖培养基，孵育15～20 min，加入4 mL 高糖培养基，37 ℃培养6 h，换含有双抗的高糖培养液，继续培养36 h[18]。
1.6 实时荧光PCR检测
对转染后细胞继续正常培养48 h，当细胞密度达90%时收集细胞，去除培养基用PBS清洗几遍，每平板中加入 3 mL的TRIzol裂解成纤维细胞，按照试剂盒说明提取细胞RNA。其浓度和纯度处于正常范围时对RNA进行反转录[15-16]，反转录成cDNA。通过NCBI查找绵羊Hoxa5、BMPR1B基因的CDS区和绵羊GAPDH的CDS区，利用PrimerPremier 5.0分别设计Hoxa5、BMPR1B和GAPDH基因的特异性荧光定量引物，序列如表1。
利用设计的荧光定量引物和反转录的cDNA对2个基因进行定量检测。试验组和对照组各设置3次重复，2个基因分别点36 μL，每孔总量5 μL；退火温度设置为60 ℃；结果数据利用公式Ct(2-ΔΔCt)计算，从而计算出Hoxa5、BMPR1B的相对表达量。荧光定量的数据结果用SPSS 20.0软件进行差异显著性分析，以P<0.01作为差异极显著性判断标准[15-16]。
表1 引物信息
Tab.1 Primers information
基因Gene引物序列 (5′-3′)Primer sequence产物大小/bpProduct length退火温度/℃Annealing temperatureHoxa5F:CCGGAGAATGAAGTGGAAAA18660R:ACGAGAACAGGGCTTCTTCABMPR1BF:ACATCTTGGGCTTCATTGCTG19860R:ATCGTGAGTTGGGTTTGGTCGGAPDHF:AAGTTCAACGGCACAGTCA12860R:ACCACATACTCAGCACCAGC
1.7 Western Blotting检测Hoxa5、BMPR1B基因蛋白质表达
首先用细胞裂解液PARI裂解提取成纤维细胞中的蛋白质，目的基因Hoxa5、BMPR1B和内参基因β-actin分别点3个胶孔，先进行2.5 h的电泳；电泳后对蛋白质进行PVDF转膜，用转膜电泳槽进行2～3 h，完全转膜后对蛋白质进行封闭2 h；封闭后用TBST进行洗膜3次；对一抗进行1∶2 000的比例稀释，在4 ℃冰箱用一抗孵育PVDF膜12 h；一抗孵育完后进行二抗的孵育，对二抗进行1∶2 000的比例稀释，孵育1.5 h；孵育完成后进行曝光，A液和B液按照1∶1的比例混合，避光进行压膜，利用AIC曝光拍照。对曝光后的蛋白条带用ImageJ 软件进行灰度值分析，得出目的基因与内参基因灰度值的比值[17]。
2 结果与分析
2.1 Hoxa5、BMPR1B目的基因的扩增
利用反转录的cDNA和上下游引物对目的基因进行PCR 扩增，以获得Hoxa5、BMPR1B目的片段。电泳结果如图1所示，其扩增出的片段明亮且无杂带，Hoxa5条带大小约为804 bp，BMPR1B条带大小约为1 509 bp，均与已知的目的片段大小相同，可用于后期的连接试验。
M.2000 Marker；1.BMPR1B基因扩增条带(1 509 bp)；2.Hoxa5基因扩增条带(804 bp)。
M.2000 Marker；1.BMPR1B product(1 509 bp)；2.Hoxa5 product(804 bp).
图1 Hoxa5、BMPR1B目的基因扩增
Fig.1 Hoxa5,BMPR1B target gene amplification
2.2 TA克隆测序比对
将获得的Hoxa5、BMPR1B基因片段分别与T载体连接，转化到DH5α中，37 ℃振荡培养12 h。对菌液的序列进行测序，将目的基因的序列与测序所得的序列用DNAMAN进行比对，比对结果如图2所示，菌液中的碱基序列与已有目的序列完全一致，碱基没有发生缺失。
Query.已知序列； Sbjct.目的基因序列。图6同。
Query.Known sequence; Sbjct.Target gene sequence.The same as Fig.6.
图2 BMPR1B(A)、Hoxa5(B)TA克隆测序比对
Fig.2 BMPR1B(A),Hoxa5(B) clone sequencing comparison
2.3 克隆载体的鉴定
利用试剂盒对连接好的T-Hoxa5、T-BMPR1B克隆载体进行提取，提取后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，Hoxa5基因大小为804 bp，T载体大小为3 489 bp，连接上目的基因后应在4 293 bp处，BMPR1B基因大小为1 509 bp，T载体大小为3 489 bp，连接上目的基因后应在4 998 bp处，条带清晰单一，结果显示克隆载体提取成功，可用于后续的酶切试验。
M.5000 Marker；1-2.BMPR1B克隆载体(4 998 bp)；3-4.Hoxa5克隆载体(4 293 bp)。
M.5000 Marker；1-2.BMPR1B cloning vector(4 998 bp);3-4.Hoxa5 cloning vector(4 293 bp).
图3 克隆载体的电泳鉴定
Fig.3 Identification of cloning vectors by electrophoretic
2.4 克隆载体、pcDNA3.1载体双酶切
对克隆载体和pcDNA3.1载体分别进行双酶切，克隆载体的双酶切将目的基因片段切下，pcDNA3.1的双酶切把载体切开，对两者双酶切之后的片段进行切胶回收用于后续的连接。结果如图4所示，1-4酶切效果良好，1-2是对BMPR1B克隆载体的EcoRⅠ、NdeⅠ双酶切，目的基因为1 509 bp，T载体为3 489 bp,与图中条带所吻合。3-4是对Hoxa5克隆载体的EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切，目的基因为804 bp，T载体为3 489 bp,与图中条带所吻合。5-6是对pcDNA3.1的双酶切，大小为5 428 bp，图中条带与已知大小所吻合。因此目的基因可与表达载体pcDNA3.1进行连接。
M.5000 Marker；1-2.BMPR1B克隆载体EcoR Ⅰ、Nde Ⅰ双酶切；3-4.Hoxa5克隆载体EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ双酶切；5-6.pcDNA3.1载体双酶切。
M.5000 Marker；1-2.BMPR1B cloning vector EcoRⅠ,Nde Ⅰ double digestion;3-4.Hoxa5 cloning vector EcoRⅠ, KpnⅠ double digestion;5-6.pcDNA3.1 vector double digestion.
图4 克隆载体及pcDNA3.1载体双酶切
Fig.4 Cloning vector and pcDNA3.1 vector double digestion
2.5 表达载体pcDNA3.1构建及鉴定
将克隆载体酶切下的BMPR1B、Hoxa5目的片段与pcDNA3.1载体进行连接，连接后进一步转入DH5α感受态细胞中，37 ℃、200 r/min振荡培养10 h，对所得的菌液进行普通PCR鉴定，电泳结果条带清晰单一，大小约在804 bp处(图5)，与已知的Hoxa5基因相符；另在1 059 bp处也有单一明亮的条带，与已知的BMPR1B基因相符。说明BMPR1B、Hoxa5与pcDNA3.1载体连接成功。
M.2000 Marker；1-2.BMPR1B;3-4.Hoxa5。
图5 表达载体pcDNA3.1-BMPR1B、pcDNA3.1-Hoxa5的鉴定
Fig.5 Identification of expression vector pcDNA3.1-BMPR1B，pcDNA3.1-Hoxa5
2.6 表达载体菌液测序鉴定
获得pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B表达载体的菌液，对菌液中质粒进行测序鉴定，与已知目的基因的序列进行比较匹配，碱基未发生缺失、添加现象，完全一致(图6)。结果表明，目的基因与pcDNA3.1载体连接成功，且目的基因能够稳定地存在于pcDNA3.1载体中。
2.7 细胞形态观察
2.7.1 原代培养形态观察 通过组织块法对细胞进行培养。24 h进行细胞的观察，可以观察到细胞开始慢慢贴壁，也有少数游离的组织，贴壁的细胞形状不完全是梭形，以梭形居多，还有其他形状的杂细胞(图7)。培养96 h可见培养皿的底部细胞密度约为95%，此密度可对细胞进行传代。
2.7.2 传代培养形态观察 细胞呈指数增长,细胞密度不易过大，因此需要对细胞进行传代，否则会引起抑制生长现象。一般在3 d左右细胞的密度可达90%～95%，此时即可对细胞进行传代。利用胰蛋白酶将贴壁的细胞消化成悬浮状态，分离到其他平板中，前12 h内细胞生长的速度会比较缓慢，12 h后生长将迅速增快，大多数细胞基本保持梭形，如图8所示。
图6 BMPR1B(A)、Hoxa5(B)菌液测序比对
Fig.6 BMPR1B(A)，Hoxa5(B) bacterial sequencing comparison
图7 原代培养24 h(×100)
Fig.7 Primary culture 24 h(×100)
图8 成纤维细胞传代培养(×100)
Fig.8 Fibroblasts subculture(×100)
2.8 实时荧光RT-PCR检测Hoxa5、BMPR1B基因表达
对转染后的细胞提取RNA并反转录成cDNA，应用荧光定量引物进行PCR 扩增Hoxa5、BMPR1B和GAPDH片段。电泳分析结果如图9所示，扩增出的条带明亮且单一，GAPDH扩增的条带大约在128 bp处，Hoxa5扩增的条带大约在186 bp处，BMPR1B条带大小约在198 bp处，因此可继续进行实时荧光定量PCR试验。
由图 10可知，两目的基因Hoxa5、BMPR1B和内参基因GAPDH的熔解曲线上均未出现杂乱的峰，且只有1个峰，扩增曲线比较集中统一，此图表明设计的实时荧光定量PCR引物特异性良好，因而能够获得单一特定产物[15]。对共转染的细胞和单转染的细胞mRNA表达量进行分析，Hoxa5基因共转染后mRNA表达量明显升高，BMPR1B基因共转染后mRNA表达量明显下降，Hoxa5、BMPR1B共转染与单转染比较均差异极显著(P<0.01)，见图11。
M.500 Marker；1-2.内参基因GAPDH扩增条带 ；3-4.目的基因BMPR1B扩增条带；5-6.目的基因Hoxa5扩增条带。
M.500 Marker；1-2.Internal reference gene GAPDH amplification products；3-4.Objective gene BMPR1B amplification products；5-6.Objective gene Hoxa5 amplification products.
图9 GAPDH、Hoxa5、BMPR1B荧光定量产物
Fig.9 GAPDH,Hoxa5, BMPR1B fluorescence quantitative product
图10 Hoxa5、BMPR1B、GAPDH 扩增曲线图(A)和熔解曲线峰值图(B)
Fig.10 Hoxa5,BMPR1B,GAPDH amplification (A) and melting curve(B)
不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。图13同。
The different capital letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01).The same as Fig.13.
图11 Hoxa5、BMPR1B基因mRNA相对表达量
Fig.11 Hoxa5,BMPR1B gene mRNA relative expression
2.9 Hoxa5、BMPR1B基因蛋白表达的检测
对单、共转染的成纤维细胞进行蛋白的提取，然后进行Western Blot。将Hoxa5、BMPR1B基因共转染与单转染进行比较，Hoxa5共转染的蛋白条带明显亮于单转染的对照组，BMPR1B共转染的蛋白条带明显暗于单转染对照组(图12)。利用ImageJ分析的蛋白条带的灰度值有所不同，通过SPSS分析灰度值数据差异显著性，得出细胞共转染Hoxa5基因蛋白表达量极显著高于单转染(P<0.01)(图13)，共转染的BMPR1B基因蛋白表达量极显著低于单转染(P<0.01)。
图12 Hoxa5、BMPR1B基因表达蛋白条带
Fig.12 Hoxa5,BMPR1B gene expression protein product
图13 Hoxa5、BMPR1B基因蛋白相对表达量
Fig.13 Hoxa5，BMPR1B gene protein relative expression
3 讨论与结论
许多的信号相互传递着多个细胞群之间的信号反应，这些信号分子决定着毛囊的发育，它们使毛囊细胞进行着有序地增殖和分化，使之形成完整的毛囊结构[19]。毛囊形态发生是由真皮发出原始信号[20]，在毛囊基板形成的起始阶段，必须先激活皮肤中Wnt信号[21-22]。有研究表明，部分上皮细胞的生长、增殖受Eda类因子和下游的转录因子活性的影响[23-24]。目前，调节毛囊形态发生变化的信号分子有7类，以骨形成蛋白(BMP)信号家族、Wnt通路等为主线，其他信号通路相互调和控制，在单信号通路中，也是2个及以上基因进行调节，很少出现单个基因的调控，相应的呈现抑制或促进不同的作用。BMPR1B基因属于BMP家族，是一种促进物，对毛囊的发育起到了一定的促进作用，Hoxa5基因属于TNF家族，是一种抑制物，对毛囊的发育起到了一定的抑制作用，现在对单个基因作用的研究有所存在，对2个基因以及多个基因作用的研究相对较少，通过对它们之间的相互作用来筛选良性基因，促进羊毛的生产。
也有学者对单个基因功能进行过鉴定，Hoxa5属于Hox家族，得到Hoxa5对脂肪的代谢调节作用，间接控制脂肪粒细胞中的信号因子发挥作用，也有结论得出Hoxa5基因的信号调节对胚胎的发育有重要的影响，对造血干细胞的增殖调节控制起主导作用。Hoxa5对毛囊的发育也有相应的鉴定，是否影响其他与毛囊发育相关的基因，本试验利用BMPR1B基因和它进行相互作用的研究，BMPR1B本身对毛囊的发育有一定的促进作用，Hoxa5的存在以及过表达是否会有利于BMPR1B基因的表达。通过试验结果分析两者的相互作用关系，Hoxa5基因的过表达对BMPR1B基因起到了一定的抑制作用，使得促进羊毛发育的基因受到了抑制，因此两者同时的过表达不利于羊毛的生长，以后的羊毛生产过程中尽量避开抑制性基因的过表达。
Hoxa5、BMPR1B单个基因功能的鉴定出现过，但与毛囊发育功能的鉴定较少。Hoxa5、BMPR1B基因两者之间相互作用关系的研究未曾出现过，本研究可以从mRNA水平和蛋白水平上来鉴定两者之间的作用关系。本研究通过表达载体的构建成功的构建了pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B基因表达载体，转染到敖汉细毛羊的成纤维细胞中，观察细胞的形态以及测定相应表达指标，从而进一步研究基因的作用以及两者之间的相互作用关系。转染后的细胞，Hoxa5、BMPR1B基因的mRNA和蛋白表达量均有明显的升高，初步验证了通过载体构建后基因过表达。单方面研究Hoxa5基因，得知Hoxa5基因能够抑制毛囊的发育，作为和其他基因之间是否存在促进或拮抗作用有待研究，本试验通过与BMPR1B基因的共同研究得出Hoxa5基因自身过表达的同时也将会影响其他信号通路中的基因，至于是促进还是拮抗则根据它们的表达量来判断[18]。
本研究分别对Hoxa5、BMPR1B基因表达载体进行构建，转染成纤维细胞，利用实时荧光定量PCR、Western Blot等检测mRNA和蛋白的表达，结果成功地构建了pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B，并且共转染成纤维细胞Hoxa5基因的表达量明显升高，BMPR1B的mRNA表达量和蛋白表达量均明显下降，且共转染组的表达量极显著低于单转染组(P<0.01)，因而推测Hoxa5基因抑制了BMPR1B基因的表达，BMPR1B基因促进了Hoxa5基因的表达，为进一步在个体水平上研究其功能奠定基础。
[1] 柳楠,王春亮,贺建宁,程明,刘开东,刘积凤,赵金山.敖汉细毛羊不同部位皮肤毛囊发育及形态结构研究[J].中国畜牧杂志, 2015,51(17):1-5.
Liu N, Wang C L, He J N, Cheng M, Liu K D, Liu J F, Zhao J S. Study on hair follicle development and morphological structure in different parts of Shuhan fine wool sheep[J].Chin J Anim Sci，2015,51(17):1-5.
[2] Hardy M H, Lyne A G. The prenatal development of wool folli-cles in Merino sheep[J].Division Anim Health Prod, 1955,9(3): 421-441.doi:10.1071/BI9560423.
[3] Kumamoto T,Shalhevet D,Matsue H,Mummert H E, Ward B R, Jester J V, Takashima A. Hair follicles serve as local reservoirsof skin mast cell precursors[J]. Blood,2013,102(5):1654-1660.doi:10.1182/blood-2003-02-0449.
[4] Rogers G E.Hair follicle differentiation and regulation[J]. J Dev Biol, 2004,48:163-170.doi:10.1387/ijdb.021587gr.
[5] 张燕军, 李金泉, 尹俊. 内蒙古绒山羊Hox基因家族成员在毛囊中表达的研究[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37 (4): 128-130.
Zhang Y J, Li J Q, Yin J. Expression of Hox gene family members in Inner Mongolia cashmere goats in hair follicles[J].China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2010, 37 (4): 128-130.
[6] 金淑清, 浦予飞, 裘莹. HOX基因的研究进展[J]. 癌症进展,2011, 9(2): 154-157.
Jin S Q, Pu Y F, Qiu Y. Progress in research on HOX gene[J]. Oncology Progress,2011, 9(2): 154-157.
[7] Yang M, Li Q F, Zhang F. HOX genes in the skin[J].Chinese Medical Journal, 2010, 123: 2607-2612.doi:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2010.18.021.
[8] 孙晓换.补肾法、疏肝法调控小鼠体外发育腔前卵泡卵母细胞BMPR15/BMP6-Smads-shh信号通路的比较研究[D].石家庄:河北医科大学,2016.
Sun X H. Comparative Study of BMPR15/BMP6-Smads-shh signaling pathway in the precancerous follicular oocytes of mice induced by Bushen method and Shugan method[D].Shijiazhuang:Hebei Medical University,2016.
[9] Song H F, Chai J K, Chen M L. Differential display ofhomeobox gene expressions in the normal, wounded human fetaland adult skins by DNA microarray[J]. Chin J Plast Surg, 2005,(21): 372-374.doi:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2010.18.021.
[10] Awgulewitsch A. Hox in hair growth and development[J]. Natur Wissen Schaften, 2003, 90: 193-211.doi:10.1007/s00114-003-0417-4.
[11] Garin E, Lemieux M, Coulombe Y.Hoxa5 function controls the growth and differentiation ofmammary alveolar epithelium[J]. Dev Dyn, 2006, 235: 1858-1871.doi:10.1002/dvdy.21224.
[12] Godwin A R, Capecchi M R. Hox c13 mutant mice lack externalhair[J]. Genes Dev, 1998, 12: 11-20.doi:10.1101/gad.12.1.11.
[13] 管峰,杨利国,程瑞禾,曹少先. 骨形态发生蛋白家族及其受体在生殖调控中的作用[J]. 中国临床康复,2005,(42):190-192.
Guan F, Yang L G, Cheng R H, Cao S X. The role of bone morphogenetic protein family and its receptors in reproductive regulation[J].Chin Journal of Rehabilitation,2005,(42):190-192.
[14] 薛鹏. 太行黑山羊BMP2，BMP4基因的克隆及表达分析[D].杨凌：西北农林科技大学,2010.
Xue P. Cloning and expression analysis of BMP2 and BMP4 genes in Taihang black goat[D].Yangling: Northwest A&F University,2010.
[15] 张梦瑶,杨峰，刘开东，刘积凤，柳楠,贺建宁.利用同源重组构建敖汉细毛羊BMPR1B真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究[J].中国畜牧杂志,2018,54(9):109-114.doi：10.19556/j.0258-7033.2018-09-109.
Zhang M Y, Yang F,Liu K D, Liu J F,Liu N, He J N. Construction of eukaryotic expression vector of BMPR1B from Shuhan fine wool sheep by homologous recombination and its expression in fibroblasts[J].Chin J Anim Sci,2018,54(9):109-114.
[16] 张梦瑶,杨峰，刘开东，刘积凤，柳楠,贺建宁.敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究[J].中国畜牧兽医,2018,45(1):131-139.doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2018.01.017.
Zhang M Y, Yang F, Liu K D, Liu J F, Liu N, He J N. Construction of recombinant plasmid of DKK1 gene from Shuhan fine wool sheep and its expression in Fibroblasts[J].China Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2018,45(1):131-139.
[17] 张梦瑶,杨峰，刘开东，刘积凤，柳楠,贺建宁.利用同源重组构建BMP6基因真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究[J].中国畜牧杂志,2018,54(8):101-106.doi:10.19556/j.0258-7033.2018-08-101.
Zhang M Y, Yang F, Liu K D, Liu J F, Liu N, He J N. Construction of eukaryotic expression vector of BMP6 gene by homologous recombination and its expression in fibroblasts[J].Chin J Anim Sci,2018,54(08):101-106.
[18] 张梦瑶,杨峰，刘开东，刘积凤，柳楠,贺建宁.利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究[J].华北农学报,2018,33(5):117-124.doi: 10.7668/hbnxb.2018.05.017.
Zhang M Y, Yang F, Liu K D, Liu J F, Liu N, He J N. Construction of DKK1, BMP4 eukaryotic expression vector and expression of co-transfected fibroblasts by homologous recombination[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2018,33(5):117-124.
[19] 李国强,纪影畅,李宇.毛囊形态发生的分子机制[J].国外医学皮肤性病学分册,2004,30(1):38-40.doi:10.1046/j.0022-202x.2001.01670.x.
Li G Q, Ji Y C, Li Y. Molecular mechanism of hair follicle morphogenesis[J]. Foreign Medical Sciences,2004,30(1)：38-40.
[20] Hardy M H. The secret life of the hair follicle[J].Trends Genet,1992(8):55-61.doi:10.1016/0168-9525(92)90350-D.
[21] Reddy S, Andl T, Bagasra A. Characterization of Wnt gene expression in developing and postnatal hair follicles and identification of Wnt5a as a targetof Sonic hedgehog in hair follicle morphogenesis[J]. Mech Dev, 2001,107:69-82.doi:10.1016/S0925-4773(01)00452-X.
[22] Andl T, Reddy S T, Gaddapara T. WNT signals are required for the initiation of hair follicle development[J]. Dev Cell,2002,2:643-653.doi:10.1016/s1534-5807(02)00167-3.
[23] Yan M, Wang L C, Hymowitz S G, Schilbach S, Lee J. Two-amino acid molecular switch in an epithelial morphogen that regulatesbinding to two distinct receptors[J]. Science, 2000,290:523-527.doi:10.1126/science.290.5491.523.
[24] Kumar A, Eby M T, Sinha S,Chaudhary P M.The ectodermal dysplasia receptor activates the nuclear factor-kappa B,JNK, and cell death pathways and binds to ectodysplasin[J]. A J Biol Chem,2001,276:2668-2677.doi:10.1074/jbc.M008356200.