氮素是作物必需的三种大量元素之一，而过度施用氮肥会导致氮肥利用率低下，同时造成土壤硝态氮大量残留和淋失以及地下水污染等一系列环境问题[1]。山东省畜禽养殖业迅猛发展，养殖污染问题日趋严重。山东省2016年规模化养殖畜禽粪便产生量为9 840.8万 t，在全国排名第一[2]，畜禽养殖业的污染排放已经成为我国最重要的农业面源污染。以养殖业畜禽废弃物还田为主的种养结合是实现地力提升和物质再循环、减少污染的方式之一。
畜禽粪便有机肥或秸秆等有机物料在农田中的自然降解缓慢，菌肥的介入能加速其中的养分释放，提高作物对其中养分的吸收[3]。随着集约化复种程度的提高，作物种植品种单一、秸秆还田等因素导致的土传病害日益严重，高产量严重依赖于化肥与农药的高投入，对农产品安全构成了很大的威胁[4]。菌肥或有机肥的使用能使作物系统产生免疫[5]，增强作物的抗病性，可在一定程度上减少损失。Ahmad等[3]研究发现，接种微生物菌剂能提高小麦籽粒吸氮量和吸磷量，提高氮素利用效率和磷素利用效率并提高产量。菌肥中的有益微生物能利用化学肥料中的氮素养分进行繁殖，提高对氮素的固定量，有些菌种还是磷和钾的增溶剂，能够活化磷素，提高植物对土壤中的氮磷钾养分的同化量[6]；秸秆还田能在生育中期增加土壤无机氮固持[7]，两者都能降低氮素营养的损失并提高氮素的回收率。化肥减量及其有机肥替代已成为近年来国内外研究的热点问题[8-11]。
以往的研究多集中于施氮量对作物氮素吸收的影响[12-14]，缺少关于单施菌肥或与有机肥结合条件下作物氮素吸收利用情况及部分替代化肥的可行性的研究。本研究主要通过分析复合菌肥配施下冬小麦氮素吸收和分配特征，比较不同处理之间植株生长特性和产量的差异来探讨化肥减量的可行性和最优菌肥的选择,以期为菌肥配施和秸秆还田下有机肥替代化肥、化肥减量以及减量多少为宜提供参考，为农田氮素科学管理和增效减负提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验地概况
试验地点设在山东省滨州市滨城国家农业科技园区，该地区属于温带大陆性季风气候，多年平均气温12.7 ℃，平均地面温度14.7 ℃，平均日照时数2 632.0 h，年平均降水量564.8 mm，降水多集中在7-8 月份。作物种植方式为冬小麦-夏玉米轮作，土壤类型为潮土。试验开始于2017年10月21日，至2018年6月9日结束。2017年试验前耕层土壤有机质含量为13.7 g/kg、全氮0.9 g/kg、全钾21 g/kg、速效磷70.6 mg/kg、碱解氮83.4 mg/kg、速效钾227 mg/kg。
1.2 试验材料
供试作物为山东省农业科学院选育的冬小麦品种济麦22。菌肥1为北京十方技术有限责任公司生产的复合微生物菌剂蓝矛绿盾(有效微生物为短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)，可湿性粉剂；菌肥2为陕西乾亨农业发展有限公司生产的酵素菌(BYM)肥料，黑色粉末状；2种复合菌剂有效活菌数量均≥2 亿/g。试验所用有机肥为山东瓮福金谷化肥有限公司生产的免深耕有机肥，黑色颗粒状，其中N+P2O5+K2O≥5%，C/N为4.6，有机质≥45%。
1.3 试验设计
本试验主要研究菌肥和有机肥配施对冬小麦氮素吸收利用和分配的影响，试验共设置5个处理，每个处理3个重复(即3个小区)。菌肥与有机肥、磷肥作为基肥一次性施入，氮肥的1/2作为底肥，1/2作为追肥。每个小区面积为14 m×10 m=140 m2。5个处理为：高量化肥，CK(N为200 kg/hm2，P2O5为120 kg/hm2)；菌1和中量化肥，B1N2P2(菌肥1为7.5 kg/hm2，N、P2O5比CK分别减量25%)；菌1和有机肥与低量化肥，B1ON1P1(菌肥1为7.5 kg/hm2，有机肥为3 t/hm2，N、P2O5比CK分别减量50%)；菌2和中量化肥，B2N2P2(菌肥2为7.5 kg/hm2，N、P2O5比CK分别减量25%)；菌2和有机肥与低量化肥，B2ON1P1(菌肥2为7.5 kg/hm2，有机肥为3 t/hm2，N、P2O5比CK分别减量50%)。4种菌肥处理为等氮等磷处理，即用有机肥补足25% CK所施化肥中的N和P2O5。菌肥、有机肥及基肥尿素、磷酸二铵均由人工撒施，小区旋耕15 cm。冬小麦于2017年10 月21日播种，翌年3月中旬灌返青水一次，并于拔节前进行一次追肥。其余管理措施如中耕、除草等和当地大田作物常规管理方式相同，并于2018年6月9日收获。
1.4 样品采集
于冬小麦生长的6个重要生育时期(苗期、越冬期、返青期、拔节期、灌浆期、成熟期)，取地上部分植株样品分析全氮含量，3点混匀后为1个重复，每个处理包括3个重复。植株样品在105 ℃下杀青30 min 后，在80 ℃ 恒温下烘干24 h左右，至质量不再变化，称干质量后用剪刀剪碎并用四分法去掉多余的样品，再用球磨仪进行磨粉粉碎待测。成熟期每个处理随机选取3个5m×5m=25 m2的样方全部收获测量冬小麦籽粒产量，并取部分麦穗带回室内进行考种。
1.5 测定项目与方法
植株样品全氮：采用H2SO4-H2O2消煮，半微量凯氏法测定，所用仪器为ATC-165凯氏定氮仪。
冬小麦旗叶SPAD值：采用日产叶绿素计SPAD-502Plus进行测定。在拔节及以后各时期在每个小区随机选取10片旗叶进行叶绿素含量测定，取其平均值。拔节期测最上一片完全展开叶片的中部。
产量：每个处理采集3个25 m2面积内的小麦籽粒全部于80 ℃烘干至恒质量，称质量后求平均值即为各处理产量。小麦穗数和穗粒数：成熟期收获时，在每个处理中随机选择3个2 m×2 m=4 m2的样方计量其中的穗数；从挖回的9株样品中选取有代表性的20个标准穗测定其穗粒数，风干后测定千粒质量，并求平均值。相关参数的计算公式如下：
氮素收获指数=籽粒氮素累积量/植株氮素累积量×100%
①
氮素生理利用率(kg/kg)=籽粒产量/植株氮素累积量
②
氮素吸收效率(kg/kg)=植株地上部分氮素累积量/施氮量
③
氮肥偏生产力(kg/kg)=籽粒产量/施氮量
④
地上吸氮速率(mg/(d·株)) = 地上部分氮素阶段累积量/相邻生育时期间隔天数
⑤
经济系数(kg/kg)=籽粒产量/地上干物质产量
⑥
1.6 数据分析
试验数据采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0 软件进行处理并绘图，处理间的多重比较采用LSD 法。
2 结果与分析
2.1 复合菌肥配施下冬小麦地上部分吸氮量
由图1可知：冬小麦各生育期地上部分氮素吸收量整体呈现出随生育期推迟不断增加的趋势，其中前3个生育时期地上吸氮量积累缓慢，后3个生育时期累积速度大幅提升，这是由于返青期和拔节期之间浇灌了返青水，极大地促进了小麦生长，故地上吸氮量大幅度增加。拔节期冬小麦地上部吸氮量较前一时期增加了27.55～33.45倍。在苗期和越冬期以CK最高，苗期显著高于B1N2P2、B1ON1P1和B2ON1P1处理(P<0.05)，越冬期显著高于B1N2P2和B1ON1P1处理；后4个生育阶段均以CK地上吸氮量最低，其中返青和灌浆期均以B2ON1P1处理最高，前者显著高于CK和B1N2P2处理(P<0.05)，后者显著高于CK、B1N2P2和B1ON1P1处理，拔节期各处理之间差异不显著(P>0.05)，成熟期表现为B2N2P2>B2ON1P1>B1ON1P1>B1N2P2>CK，除B1ON1P1和B2ON1P1之间差异不显著，其他处理间均有显著差异 (P<0.05)。
不同字母表示同一生育时期不同处理间在0.05水平上差异显著。图2、表1-4同。
Different letters indicate that different treatments have significant difference at 0.05 level in the same growing stage.The same as Fig.2,Tab.1-4.
图1 各生育时期冬小麦地上部分吸氮量动态变化
Fig.1 Dynamic changes of winter wheat nitrogen uptake amount overground in different growing stages
综合说明，常规化肥处理仅能在前期促进小麦生长和吸氮，而后期表现不佳；各时期均表现为B2ON1P1>B1ON1P1和B2N2P2>B1N2P2，说明菌肥2在提高植株对氮素的获取能力方面比菌肥1优越；菌肥配施下化肥不同程度减量或结合有机肥能在小麦生育中后期提高地上携氮量，为营养器官中的氮素向籽粒中转移奠定了良好的基础。
2.2 复合菌肥配施下冬小麦生育后期地上部分吸氮速率
小麦植株吸氮量与小麦的生长发育进程密切相关，既反映了植株对氮素的需求量和获取能力，又能表征其对不同来源氮素(有机肥氮或化肥氮)的吸收和利用强度。由于冬小麦在苗期、越冬期和返青期生长缓慢，地上干物质和氮素累积亦变化不大，故仅在后3个生育期研究其地上部分的吸氮速率，拔节期是冬小麦全生育期的吸氮高峰，主要因小麦返青后温度迅速回升加之返青水的补灌，在这一时期进行追肥能及时满足小麦的生长需求和促进增产。从图2可以看出：在拔节期和灌浆期CK处理的吸氮速率均低于菌肥处理，拔节期显著低于B1N2P2 和B2N2P2处理 (P<0.05)，灌浆期还显著低于B2ON1P1处理；拔节期和灌浆期的吸氮速率均表现为B2N2P2>B2ON1P1、B1N2P2>B1ON1P1，灌浆期后两者之间差异显著(P<0.05)，说明小麦对化肥氮的吸收能力比有机肥氮强；成熟期吸氮速率B2ON1P1>B1ON1P1>CK>B2N2P2>B1N2P2，前二者显著高于后三者(P<0.05)，其中B1N2P2 和B2N2P2的吸氮速率较灌浆期有所降低，B2ON1P1的吸氮速率基本持平，而CK与B1ON1P1的吸氮速率较灌浆期有所增加。经田间实际考察，发现CK、B1ON1P1、B2ON1P1处理均有成熟度不一，部分小麦的旗叶和茎秆在成熟期还没有干枯变黄，过量的氮素供应造成了这些处理贪青晚熟，导致在成熟期吸氮速率仍然居高不下。有机肥中的有机态氮分解缓慢，未能在作物的养分需求临界期前提供适量的氮素营养，而后期氮供应过剩，这是造成菌肥和有机肥与低量化肥组合营养器官生物量过大而籽粒产量不高的主要原因。
图2 后3个生育时期各处理冬小麦地上部分吸氮速率动态变化
Fig.2 Dynamic changes of winter wheat nitrogen uptake rates overground in three later growing stages
2.3 复合菌肥配施下冬小麦叶片SPAD值
由表1可知，在拔节期冬小麦叶片SPAD值表现为CK
表1 后3个生育时期不同菌肥组合下冬小麦叶片SPAD值
Tab.1 SPAD readings of winter wheat under different combination of biofertilizers in three later growing stages
处理Treatment拔节期Jointing stage灌浆期Filling stage成熟期Maturing stageCK41.2±1.59b51.4±3.94b30.2±1.89abB1N2P248.6±0.37a58.2±0.79a24.0±1.05bB1ON1P145.1±2.41ab54.1±2.23b31.1±1.33aB2N2P247.5±2.42a58.9±1.04a26.8±2.19bB2ON1P147.6±3.64a55.4±1.21b33.1±1.88a
注：所有数据均以平均值±标准差来表示。表2-4同。
Note： All data are expressed as Mean±SD. The same as Tab.2-4.
2.4 复合菌肥配施下冬小麦氮素分配特征
由表2得，灌浆期籽粒吸氮量表现为B2N2P2>B1N2P2>B2ON1P1>CK>B1ON1P1，CK和B2ON1P1二者间差异不显著外(P>0.05)，其他处理间差异均达显著水平(P<0.05)，除CK外的各处理排序和最终产量排序一致；灌浆期地上营养器官吸氮量大于籽粒吸氮量，处理间表现为CK>B2ON1P1>B1ON1P1>B1N2P2>B2N2P2，前三者显著高于后二者(P<0.05)，说明灌浆期菌肥配施下化肥减量25%两处理植株地上部分籽粒中的氮素分配比例已经开始逐渐增高，且显著高于菌肥与有机肥结合的处理。成熟期籽粒吸氮量表现为B2N2P2>B2ON1P1>B1N2P2>B1ON1P1>CK (P<0.05)，可见菌肥2的吸氮量显著大于菌肥1和CK，说明菌肥2优于菌肥1；成熟期小麦地上营养器官吸氮量表现为B1ON1P1>B2ON1P1>B2N2P2>B1N2P2>CK，前二者显著高于后三者(P<0.05)，亦说明菌肥与有机肥组合可能会增加小麦整株的吸氮量，但是籽粒吸氮的分配比例并不高，因此会影响最终产量。
表2 灌浆期和成熟期冬小麦营养器官和籽粒吸氮量对比
Tab.2 Contrast on grain and other organ nitrogen uptake amount during filling stage and maturing stage mg/株
生育时期Growing stage部位PositionCKB1N2P2B1ON1P1B2N2P2B2ON1P1灌浆期籽粒29.91±0.22c36.24±0.59b26.90±0.68d48.60±1.42a31.10±0.97cFilling stage营养器官224.40±8.30a127.80±4.15c161.70±4.07b119.20±4.93c162.40±15.30b成熟期籽粒425.93±9.50e588.57±17.00c490.49±14.30d943.40±15.90a618.85±6.98bMaturing stage营养器官153.20±5.64d164.90±15.70cd275.31±13.50a185.20±6.08c231.40±11.13b
注：营养器官包括叶+叶鞘+茎秆+穗轴+颖壳。
Note：Other organs include leaf+leaf sheath+stalk+cob+glume.
2.5 复合菌肥配施下冬小麦产量及氮素利用率
由表3可得，冬小麦有效穗数表现为CK>B2N2P2>B2ON1P1>B1N2P2>B1ON1P1，除B2N2P2与B2ON1P1差异不显著外(P>0.05)，其他各处理之间差异显著(P<0.05)，这是播种和分蘖成穗率不同而造成的；冬小麦穗粒数在B1N2P2处理显著高于其他处理(P<0.05)，这是其获得高产的首要原因，其他处理间差异均不显著(P>0.05)；冬小麦千粒质量现为B2N2P2>B2ON1P1>B1N2P2=B1ON1P1>CK，B2N2P2显著高于CK，说明菌肥的施用能增加小麦的千粒质量，而只有菌肥2和中量化肥的组合千粒质量显著高于CK，这是B2N2P2获得最高产量主要原因；产量表现为B2N2P2>B1N2P2>CK>B2ON1P1>B1ON1P1，B2N2P2和B1N2P2较B1ON1P1处理分别提高了9.80%和7.68%，差异显著(P<0.05)。这反映出菌肥与中量化肥的组合相比，常规化肥和菌肥与有机肥组合具有明显的优越性，化肥减量25%再配合生物菌肥下的产量最高。由此说明菌肥配施与秸秆还田下化肥减量产量不减反增是可以实现的，这与在夏玉米上得到的结论一致。经济系数的表现为2种菌肥与有机肥共用的处理显著低于其他处理，说明该有机肥会降低冬小麦和夏玉米的谷草比，影响产量。
从表4可以看出，冬小麦氮素收获指数表现为B1N2P2和B2N2P2显著大于其余处理(P<0.05)，氮素吸收效率表现出B2N2P2在各处理中最高而CK最低，氮素生理利用率表现为CK显著高于菌肥处理(P<0.05)，说明菌肥处理每吸收1 kg N形成的产量低于常规施肥，但是单位质量的植株所含的氮素浓度却比较高；氮肥的偏生产力表现为B2N2P2>B1N2P2>B2ON1P1>B1ON1P1>CK，菌肥处理显著高于CK(P<0.05)。综上，常规施肥量(N 200 kg/hm2)下的氮素吸收效率和收获指数偏低，氮肥偏生产力也很低，菌肥配施下化肥减量25%能不同程度提高植物对氮素的吸收和利用，且B2N2P2的最高；氮素生理利用率的表现与其他3个氮素利用指标明显不同，菌肥反而表现出劣势。
表3 冬小麦产量构成因素及经济系数
Tab.3 Yield components and harvest index of winter wheat
处理Treatment有效穗数/(×104穗/hm2)Harvest ears穗粒数Kernel number per ear千粒质量/g1000-kernel weight产量/(kg/hm2)Yield经济系数/(kg/kg)Harvest indexCK390.6±2.5a42.5±1.5b29.7±1.7b4 927.0±343.1ab0.46±0.014bB1N2P2372.3±4.6c45.1±3.5a29.9±0.7ab5 031.3±112.0a0.49±0.025abB1ON1P1367.1±9.7d42.5±1.7b29.9±0.3ab4 672.5±126.2b0.40±0.013cB2N2P2384.0±1.9b42.3±0.6b31.6±1.1a5 130.6±97.1a0.52±0.007aB2ON1P1381.4±1.8b42.1±2.8b30.3±0.2ab4 859.7±182.9ab0.42±0.019c
表4 冬小麦收获期氮素利用率及氮肥偏生产力
Tab.4 Nitrogen use efficiency and partial factor productivity by winter wheat at harvest
处理Treatment氮素收获指数/%Nitrogen harvest index氮素生理利用率/(kg/kg)Nitrogen physiological efficiency氮素吸收效率/(kg/kg)Nitrogen uptake efficiency氮肥偏生产力/(kg/kg)Partial factor productivityCK57.2±2.3b18.50±0.7a1.75±0.05c24.64±0.3cB1N2P262.1±0.5a15.59±0.1b3.01±0.2b33.54±1.1aB1ON1P154.3±0.2c14.71±1.2bc3.43±0.27b31.15±0.6bB2N2P265.6±3.9a14.90±0.8b4.53±0.5a34.20±2.0aB2ON1P159.7±0.4b13.10±0.5c3.75±0.3ab32.40±1.9ab
3 结论与讨论
氮素是作物生长不可或缺的大量元素，由作物不同生育期的需肥规律确定最佳需肥量，是减少因过量施肥而导致氮素损失的关键手段[15]。小麦籽粒中80%左右的氮素是从花前营养体积累的氮素中转运而来的，而地上转运量占绝大多数。通过对小麦各生育期地上部吸氮量和吸氮速率的研究来判定小麦的需肥量和追肥时期，对于农田氮素科学管理、合理施肥意义重大。Thonar等[16]认为微生物菌剂可以促进作物生长并提高养分吸收量，但是这和所选的接种基质及施入的土壤性质有关。施用菌肥还可以提高小麦旗叶叶绿素含量，有助于茎、叶中全氮的积累[17]。本试验结果显示：常规化肥处理仅能在生长前期促进冬小麦生长和吸氮，菌肥配施下化肥不同程度减量能在小麦生育中后期提高地上吸氮量，且菌肥2在提高植株对氮素的获取能力和产量等方面优于菌肥1。B1ON1P1和B2ON1P1的营养器官含氮量过高、群体成熟度不一致是导致其产量偏低的主要原因，过量施氮不利于提高籽粒中的氮素分配比例[18-19]；在拔节期和灌浆期CK处理的吸氮速率均低于菌肥处理，且B1N2P2和B2N2P2的吸氮速率显著大于CK(P<0.05)，表明施用菌肥可以在小麦生育后期(成熟期例外)提高地上吸氮量和吸氮速率；B1N2P2和B2N2P2相比于菌肥与有机肥处理和CK能提高成熟期籽粒吸氮量占地上部分总吸氮量的比例；成熟期小麦地上营养器官吸氮量表现为B1ON1P1处理显著大于其他处理，然而其籽粒中的氮素累积量却正好相反。以本次试验的结果为准，若不考虑根系吸氮，冬小麦拔节期的氮素阶段累积量在各处理间的平均值为85 kg/hm2，因此，在返青与拔节期之间追施85 kg/hm2的化肥氮素才能保证冬小麦的正常生长和发育。
菌肥的配施与减量优化平衡施肥能提高氮素利用率，还可以节约成本[20]。Rose等[21]认为菌肥中含有的能促进植物生长的微生物在提高氮素利用方面有巨大的潜力，菌肥在不减少产量的前提下可以代替23%至52%的氮肥，但却不能代替磷肥。通过调节化肥投入的量和时机能够增加菌肥的功效。氮素收获指数和氮素生理利用率是用来反映作物将所吸收的氮用于形成籽粒产量方面的能力的指标，氮素生理利用率又称为氮素籽粒利用效率；而氮素吸收效率和氮肥偏生产力是反映作物对所施肥料中氮的吸收和利用情况的指标。本试验中，常规施氮量(N 200 kg/hm2)下的氮素吸收效率、氮素收获指数和氮肥偏生产力都比较低，菌肥配施下化肥减量25%能不同程度提高植物对氮素的吸收和利用，且B2N2P2的为最高；菌肥配施有机肥的氮肥偏生产力较低，说明有机肥料中的氮素当季利用率不高，其后效可能会持续到下茬作物；但是氮素生理利用率整体偏低且CK的氮素生理利用率显著高于2种菌肥处理，这与其他3个氮素利用指标截然不同，菌肥反而表现出一定的劣势，具体原因尚不明确，有待进一步深入研究。
各菌肥处理的叶片SPAD值同样在生育中后期表现出优势(成熟期例外)，拔节期和灌浆期叶片SPAD值都表现出B1N2P2和B2N2P2显著高于CK，说明菌肥与中量化肥共同施用可增加同期冬小麦的叶片SPAD值，促进了冬小麦的光合作用，但2种菌肥之间差异不显著。
菌肥的施用比单纯使用化肥的增产效应明显，且能改善作物品质[22-26]。化肥减量25%配施菌肥的处理能将所吸收的氮素更好地用于产量的形成，其经济系数较高且B2N2P2的经济系数显著高于CK，因此具有更可观的经济效益。菌肥的施用还能增加冬小麦的千粒质量，而菌肥与有机肥共用的两处理的经济系数偏低，说明该有机肥会降低作物的谷草比，不利于产量的提高。化肥减量25%(N 150 kg/hm2)配合生物菌肥下冬小麦的产量最高，这和段文学等[19]在山东省的研究结果相同，Mondal等[27]在芥菜上也得出一致的结论。由此表明：菌肥配施与秸秆还田下化肥减量产量不减反增是可以实现的。菌肥与中量化肥的组合相比其他处理有其明显的优越性，说明低量化肥已不能满足小麦正常的生长需要，氮肥减量要适度。有研究发现，有机肥氮可以替代50%化肥氮并提高作物产量[10]；而另一些人则认为有机肥氮替代70%或秸秆氮替代30%化肥氮，均能有效提高土壤供氮能力[28]，这与本试验的结果存在出入。本试验发现有机肥替代1/3化肥氮下的产量偏低，不施用有机肥的处理反而效果更好，这可能和该有机肥过低的C/N有关。
在山东省乃至整个华北地区秸秆还田下复合菌肥部分代替化肥可以减少农业面源污染，而TN和TP等由径流或淋溶进入河流湖泊造成的水体富营养化是农业面源的重要方面。滨州市各河流污染已相当严重, 50%以上的河流水质在Ⅴ类水质以下，除黄河外，其他河湖均已遭受不同程度的污染[29]。徒骇马颊河水系是海河流域三大水系之一，而该水系骨干入海河道位于滨州市北部，河道尾闾受上中游工厂排污、生活垃圾及污水、农业污染等影响，河水污染严重，河口水污染愈演愈烈，严重损害河流生态[30]。据估计，若山东滨州地区小麦-玉米轮作系统年化肥氮用量以400 kg/hm2为准，全部减量25%可以减少滨州市年纯氮投入量4.52×104t[31]，折合普通尿素约为9.82×104 t，若小麦的当季氮素回收率为43.8%，玉米的当季回收率为32.4%[32]，则每年可减少各种途径损失氮素1.39×104 t。实际情况远远大于这个数值[33]，而有机肥投入的增加可以减少畜禽粪便无序排放及环境污染。
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