目前,根肿病在全世界发生越来越严重,根肿病是芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染十字花科植物根部而引起的,根部细胞异常增殖,形成肿块,进而影响水分和营养物质的运输,造成植株地上部分枯萎,直至全株死亡[1]。随着机械农具的使用,根肿病传播更加迅速,已成为影响我国大白菜产业发展的重要病害。芸薹根肿菌是一种专性土壤寄生的原生生物[2],不同地区根肿菌之间存在分化现象[3]。国际上通用的鉴定系统是Williams[4]鉴别系统和ECD[4](European clubroot differential set)鉴别系统,最常用的是Williams 鉴别系统。目前,我国存在的芸薹根肿菌生理小种有1,2,4,7,9,10,11,12,13等[5-10],其中4,7,10,11号最常见。
已报道的大白菜抗根肿病基因有8个,其中,CRa[11]、CRb[12]、Crr3[13]、CRk[14]和CRc[14] 为质量性状位点,Crr1、Crr2[15]和Crr4[16]为数量性状位点,Crr1为主效基因,Crr2为修饰基因,而Crr4为微效基因[16],除Crr4外其他7个基因均已开发出连锁标记。多重PCR是指在一次PCR扩增中使用2对或者2对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段,具有高效、快速、经济等优点。现在多重PCR已经广泛用于玉米[17]等经济作物,应用价值很高。
目前,不同大白菜材料对不同根肿菌生理小种的抗病性还不明确,本研究以我国大白菜产区主要存在的4,7,10,11号小种为菌源,同时利用已报道的13个主要抗根肿病 (CR)分子标记对供试大白菜进行抗病性鉴定和抗病位点检测,为这些品种在生产中的应用提供参考。同时试验还进行了多重PCR技术在大白菜中的应用研究,旨在推进简便、高效的PCR技术在大白菜中进行应用,提高大群体分子检测的工作效率。
1 材料和方法
1.1 试验材料
选取国内19个商业品种及6份自交系为试验材料,材料名称和来源详见表1。4个生理小种分别采自湖北长阳贺家坪、湖北利川、四川西昌市安宁镇和辽宁沈阳(表2),收集根瘤,洗净晾干,-20 ℃冷冻保存备用。
表1 供试25份大白菜材料名称和来源
Tab.1 Selected 25 Chinese cabbage cultivars and origin
编号Number材料名称Cultivar来源Origin编号Number材料名称Cultivar来源Origin1德高CR117德高蔬菜种苗研究所14大地CR118 山东省齐鲁大白菜服务中心2山地王2号武汉市文鼎农业生物技术有限公司15华抗301贵阳绿丰农业有限公司3星光云南大农农业科技有限公司16CR开拓16号北京春奥种苗科技有限公司4CR春泰广东省良种引进服务公司17CR福将北京东汇盛种业科技有限公司5CR-强汉昆明市昆蔬种子有限责任公司18清江春福 CR武汉市文鼎农业生物技术有限公司6CR咏春北京东汇盛种业科技有限公司19CK 秋绿60(对照)天津科润蔬菜研究所7水师营18号 CR大连市水师营蔬菜种子研究所2015B172天津科润蔬菜研究所8京春CR3京研益农(北京)种业科技有限公司2115B178天津科润蔬菜研究所9CR京秋新三号京研益农(北京)种业科技有限公司2215B201天津科润蔬菜研究所10C1沈阳维吉特种子有限公司2315B225天津科润蔬菜研究所11C3沈阳维吉特种子有限公司2412G57天津科润蔬菜研究所12CR75山东鲁信种业有限公司2512G83天津科润蔬菜研究所13德高CR铁甲1号德高蔬菜种苗研究所
1.2 试验方法
1.2.1 菌液的制备 对根瘤进行检查,确保存在休眠孢子囊,4层纱布过滤搅碎后的根肿瘤组织,4 000 r/min离心10 min,倒掉上清液,蒸馏水悬浮沉淀后离心3次。将制备好的孢子悬浮液浓度调至 1×107～1×108个/mL,4 ℃保存备用[18]。
表2 供试菌种来源和类型
Tab.2 Sampling sites and pathotypes of P. brassicae field populations
生理小种类型Physiological races采样地Sampling site参考文献Reference4号湖北长阳贺家坪汪维红等[5]7号湖北利川沈向群等[7]10号四川西昌市安宁镇沈向群等[7]11号辽宁沈阳沈向群等[7]
1.2.2 接种方法 将种子播在装有消毒土的穴盘中,用移液枪吸取1 mL 根肿菌液,注射种子周围,少量蛭石覆盖。苗盘置于温室通风阴凉处,25 ℃下生长,苗盘下保持1 cm水层,30 d后调查发病情况。每个材料播种25穴,重复3次。
1.2.3 调查方法 接种菌液培养30 d后,将大白菜材料根部冲洗干净并调查发病情况,取3个重复的平均值计算发病率和病情指数,计算方法如下[5]：
病株率=(发病株数/总株数)×100%；
病情指数=∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)。
1.2.4 大白菜根肿病病情分级标准 根肿病病情分级标准参照曾令益等[19]的报道,病情指数DI≤10记为抗病(R),10
1.2.5 抗病位点检测 出苗10 d后,每个材料取3株真叶,利用CTAB法[20]提取大白菜叶片的基因组DNA作为模板进行PCR反应,采用 10 μL PCR反应体系：5 μL的2×Taq Master mix,上、下游引物10 μmol/L各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 3.2 μL。PCR反应程序参考文献[13,16,19,21]中的方法进行,无菌水作为阴性对照进行PCR扩增。将条带大于300 bp的引物进行琼脂糖凝胶电泳,小于300 bp的引物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。抗根肿病位点引物序列见表3。
表3 大白菜抗根肿病位点的引物序列
Tab.3 List of primers used for detection of clubroot resistant locus in Chinese cabbages
位点Locus引物名称Primer 序列Primer sequences目的片段大小/bpProduct size参考文献ReferenceCrr1BrID10867TTTATAGGCTTGGAAGCAAC86[21]TGAATGCCTTTACCAGAAGTBrID11233CAGATTGAGGGAATCAACTT100[21]GTGCATGATCCTGATAACCTBrID11507GTTTCGTTGTTGTTGTAGCA85[21]TTCGTTTCTCATCCATCTCTCrr2BSA3CATTTGAGATTAAGATCAGGCGATG491∗TCGAGTTTGGTCTCTGTGAAAAATCBRMS096AGTCGAGATCTCGTTCGTGTCTCCC220[16]TGAAGAAGGATTGAAGCTGTTGTTGCrr3BrSTS78CTCTCCTCTAACCTGTTCCAAGAA200[13]GGTGTATCCACACACTCATCAAGTNewSTS78TGGTGAATCCACACACTCATCAAGTG 387∗GCTGAT CAA CACCAC TCT CACCAGOPC11-2SGTAACTTGGTACAGAACAGCATAG1 300[19]ACTTGTCTAATGAATGATGATGGCRkHC6884-FWTCTCTGTATTGCGTTGACTG1 000[19]HC6886-RVATATGTTGAAGCCTATGTCTHC6887-RVAAATATATGTGAAGTCTTATGATCCRaSC2930T-FWTAGACCTTTTTTTTGTCTTTTTTTTTACCT800[19]SC2930Q-FWCAGACTAGACTTTTTGTCATTTAGACTSC2930RVAAGGCCATAGAAATCAGGTCB0902AGCCTTGCGTAAAAGCAACTAC160∗GTTTGGAATCCGACAAATACATCCATCRbKBrH129J18RAGAGCAGAGTGAAACCAGAACT254[19]GTTTCAGTTCAGTCAGGTTTTTGCAGCRcB50C9-FWGATTCAATGCATTTCTCTCGAT800[19]B506R-FWAATGCATTTTCGCTCAACCB50RVCGTATTATATCTCTTTCTCCATCCC
注：*.来自大白菜数据库。
Note：*.From http://brassicadb.org/brad/.
1.2.6 大白菜多重PCR体系的建立 采用PCR产物混合法和引物混合法对大白菜两重SSR-PCR扩增体系进行摸索。PCR产物混合法：单一引物的PCR 产物各取2 μL,混合均匀之后进行点样；引物混合法：同一反应体系中加入不同的引物,其他成分与单一引物PCR反应中加入的量相同。
2 结果与分析
2.1 大白菜材料人工接种鉴定结果
由表4可知,供试大白菜材料中,德高CR117、CR咏春、水师营18号、CR京秋新三号、德高CR铁甲1号、大地CR118和秋绿60 7份材料对4个生理小种都表现感病,其中德高CR117、CR咏春、德高CR铁甲1号和大地CR118表现为低感,而秋绿60接种4个菌株后均在主根上形成大的根瘤,发病症状明显,均表现为高感；山地王2号、星光、CR春泰、CR-强汉、京春CR3、CR福将、15B178和12G57 8份材料对4个生理小种都表现抗病；C1、C3、CR75和15B172 4份材料对2个生理小种表现感病,其中 C1、C3和15B172对4号生理小种高感,对7号生理小种低感；CR75对4号和11号生理小种低感；华抗301、CR开拓16号、清江春福CR、15B201、15B225和 12G83 6份材料只对4号生理小种低感,对其他3个生理小种抗病。
由此可见,供试大白菜中,有8份材料对4号生理小种表现为抗病,有15份材料对7号生理小种表现为抗病,18份材料对10号生理小种表现为抗病,17份材料对11号生理小种表现为抗病。从病原的致病力强弱来看,4号生理小种为最强,其次为7号生理小种。
表4 供试大白菜材料人工接种鉴定结果
Tab.4 The identification results of artificial inoculating in Chinese cabbages
编号Number名称Cultivars生理小种类型 Physiological races4号7号10号11号1德高CR117LSLSLSLS2山地王2号RRRR3星光RRRR4CR春泰RRRR5CR-强汉RRRR6CR咏春LSLSLSLS7水师营18号HSLSLSLS8京春CR3RRRR9CR京秋新三号HSLSLSLS10C1HS LSRR11C3HSLSRR12CR75LSRRLS13德高CR铁甲1号LSLSLSLS14大地CR118LSLSLSLS15华抗301LSRRR16CR开拓16号LSRRR17CR福将RRRR18清江春福CRLSRRR19秋绿60HSHSHSHS2015B172HSLSRR2115B178RRRR2215B201LSRRR2315B225LSRRR2412G57RRRR2512G83LSRRR
注：R.抗病；LS.低感；HS.高感。
Note： R.Resistant; LS.Low susceptible; HS.High susceptible.
表5 供试大白菜材料分子标记鉴定结果
Tab.5 Identification results of molecular markers in Chinese cabbages
位点 Locus引物Primer材料编号Cultivar number12345678910111213141516171819202122232425Crr1BrID10867++-++++-+++-++++++++++-++BrID11233-±±--±±-±±±±--±+±±±++++++BrID11507±--±±--±+++-±±±--±---+--+Crr2BSA3+------------------------BRMS-096---+±±---±----±+-++---+-+Crr3BrSTS-78-------±-----------------NewSTS78-------------------------OPC11-2S-------------------------CRkHC688±+±++++±±±±+--±±±±+++++++CRaSC2930-±±±±±±±±±±±---±+±±++±±+-B0902±±-±+±±±±±±±---±+±±±+--+-CRbKBrH129J18R-±+±-±±±±±±±---±+±-++--±-CRcB50--±--------±-------------
注：“+ ”.纯合抗病位点;“- ”.纯合感病位点;“± ”.杂合抗病位点。
Note： "+" . Homozygous resistant site; "-".Homozygous susceptible site; "±".Heterozygous resistant site.
2.2 大白菜材料分子标记鉴定结果
目前国内对大白菜材料中含有的抗病位点研究较少,通过抗病性和分子标记检测,找到两者之间的关系。利用已报道的与抗病基因连锁的13个分子标记对供试大白菜进行PCR扩增,检测到Crr1、Crr2、Crr3、CRk、CRa、CRb和CRc共7个抗病位点(表5)。全部材料都检测到含有Crr1抗病位点,但是不同引物对同一材料的判定结果不同；在德高CR117、CR春泰、CR-强汉、CR咏春、C1、华抗301、CR开拓16号、清江春福CR、秋绿60、15B225和12G83 11份材料中发现含有Crr2抗病位点,其中德高CR117、CR春泰、CR开拓16号、清江春福CR、秋绿60、15B225和12G83 7份材料中为纯合位点；只有京春CR3中检测到Crr3位点,除德高CR铁甲1号和大地CR118外,其他试材中均含有CRk抗病位点；21，16份试材分别检测到抗病位点CRa和CRb,且大多为杂合位点,仅在部分试材中检测到纯合抗病位点；星光和CR75含有CRc抗病位点,其他材料中均未检测到这个位点。
大部分试材中并不是只含有1个抗病位点,星光、CR春泰、CR咏春、京春CR3、C1、CR75、CR开拓16号和清江春福CR 8份试材含有5个抗病位点；德高CR117、山地王2号、CR-强汉、水师营18号、CR京秋新三号、C3、CR福将、秋绿60、15B172、15B178、15B225和12G57 12份试材含有4个抗病位点；华抗301、15B201和12G83 3份试材含有3个抗病位点；只有德高CR铁甲1号和大地CR118含有1个抗病位点。
2.3 大白菜多重PCR反应体系的建立
多重PCR在大白菜中并未使用,它能节省材料,提高扩增速率。根据2个引物的PCR扩增产物条带差异大和退火温度相同的选择原则,将BrID11233和B0902聚合在一起。图1为引物BrID11233和B0902两重PCR组合产物混合法(A)和引物混合法的扩增结果(B)。
根据两重PCR组合产物混合法(A)和引物混合法的扩增结果(B)发现,引物BrID11233和B0902所扩增条带与单一的PCR反应扩增的条带一致,且能够清晰的区分开,表明这2个引物可以成功的聚合在一起。
M.Marker;H1-H4.材料编号：分别为2,6,7,17号材料。
M.Marker;H1-H4.Material number：Materials of 2, 6, 7，17.
图1 引物BrID11233和引物B0902的两重PCR组合扩增结果
Fig.1 The amplification result of primers BrID11233 and B0902 of two multiple PCR
3 结论与讨论
汪维红等[5]表明,Williams鉴别系统的 4 号小种因为致病力最强,分布最广,所以是我国根肿菌的优势小种。本研究发现：对4号生理小种感病的大白菜材料多于对其他3个生理小种感病的材料,其中华抗301、CR开拓16号、清江春福CR、15B201、15B225和 12G83等材料只对4号生理小种感病,这也印证了前人的研究结果。CRb基因对生理小种2,4,8号有抗性[13],本研究与其研究结果不一致,部分含有CRb基因的试材(如清江春福CR)对4号生理小种表现感病。可能由于同一地方存在多个生理小种混杂的情况,恩施地区同一田块存在不同的生理小种[19]。故推测湖北长阳贺家坪所取病源菌不仅有4号生理小种,还可能存在其他生理小种。
抗病位点CRa、CRb、Crr3和CRk都位于A03号染色体上,关于它们的位置一直都存在争议,CRa和CRb也许是2个独立基因[22],也许是连锁紧密的2个抗病位点[11-12]。Sakamoto 等[14]研究表明,CRk和Crr3 是2个位置很近的独立的抗病位点,本研究发现在CR-强汉中只检测到 CRa而未检测到CRb。同时,像德高CR117等材料中均含有CRk,但不含有Crr3,只有京春CR3同时含有Crr3和CRk,德高CR铁甲1号和大地CR118未检测到含有Crr3和CRk。这说明CRa、CRb、Crr3和CRk应该是4个相互独立的基因。
抗病位点越多的材料抗病性越强[19]。本研究中发现德高CR铁甲1号和大地CR118对4个生理小种均表现感病,而且这2个材料只含有Crr1基因,印证了前人的结果。除了这2个材料之外其他试材并不符合这个关系。同时,C1和C3这2个品种的抗病性鉴定结果一样,但是分子标记检测结果发现,C1中检测到含有Crr2,C3 中未检测到,推测Crr2抗病位点对于品种的抗病性影响不大。
所有材料中均含有Crr1抗病位点,但其对材料抗性影响不大。Suwabe等[16]研究发现,Crr2和Crr4基因的存在能够增强Crr1基因的抗病能力,且含有纯合抗性基因的植株比杂合基因植株的抗根肿病能力强。在本次试验中未检测Crr4位点,对结果有一定影响。除此之外在数量性状的遗传中,抗病基因之间的相互关系会影响到性状表达。李朋朋等[23]研究发现，等位基因间的互作对根肿病的抗性有重要的影响。
以往大白菜的PCR扩增体系都是1次反应中使用1对引物,本研究发现在大白菜中,可以建立扩增效果良好的多重PCR体系,这项技术的应用不仅可以节省材料,还能提高大白菜大群体分子检测的工作效率。
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