Whirly基因家族的蛋白质成员在整个植物界中都存在，主要定位于线粒体和叶绿体中，具有和单链DNA结合的能力[1]。Desveaux等[2]在2000年从马铃薯中分离出的PBF-2转录因子是第一个Whirly基因家族成员，它和cDNA编码的蛋白质都以序列特异性的方式与诱导子响应元件 (Elicitor response element)单链形式结合。
Desveaux等[3]在2005年研究发现，拟南芥和马铃薯中的Whirly转录因子具有调节防御基因表达的作用，其可能在防御反应以外的过程中发挥作用，并可能在叶绿体和核中起作用。Whirly蛋白在细胞核内参与水杨酸(SA)依赖的抗病信号转导，Desveaux等[4]研究发现，拟南芥中StWhy1同源基因AtWHY1的DNA结合活性由SA诱导，并且是SA依赖的抗病性和SA诱导的系统获得性抗性(SAR)响应基因表达所需的。Whirly蛋白家族能够调节端粒结构稳定，拟南芥AtWHY1被鉴定为一个新的端粒末端结合蛋白，在调节拟南芥端粒的稳态中能够发挥作用，主要表现在：在AtWHY1缺陷型植株中端粒延长，端粒酶活性增加；在含有AtWHY1的转基因植物中端粒酶活性降低，端粒缩短[5]。Whirly蛋白在质体内能够维持质体基因组的稳定，调节质体基因的表达。Marechal等[6]发现，Whirly单链DNA结合蛋白在维持拟南芥质体基因组稳定方面起到重要的作用。Cappadocia等[7]的研究结果表明，Whirly蛋白与单链DNA的结合有助于准确修复断裂的双链DNA。
辣椒(Capsicum annuum L.)是茄科辣椒属的1年生或多年生草本植物，是世界上种植面积最广的香料作物，目前辣椒的全基因组测序和物理图谱已经完成[8]。目前国内外对Whirly基因家族的研究主要以拟南芥为对象，针对Whirly蛋白的结构和功能进行研究，而对于辣椒Whirly基因家族的研究还没有详细报道。为此，利用生物信息学的方法，对辣椒CM334基因组中Whirly基因家族的全部序列进行鉴定分析，并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了CM334中Whirly基因在逆境胁迫下的表达情况，为进一步研究Whirly基因家族在辣椒生长发育中的功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 植物材料
所用辣椒材料CM334由韩国首尔国立大学馈赠。辣椒培养条件参考文献[9-10]。当辣椒幼苗有6～8片真叶展开时按如下方法处理。
脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理：用脱落酸(100 μmol/L)和茉莉酸甲酯(200 μmol/L)分别喷洒辣椒叶片的正反面，以喷洒无菌水作为对照。
高温处理(Heat)：对辣椒叶片进行高温处理，白天温度设置为(42±2)℃，晚上设置为(35±2)℃。对照组白天温度设置为28 ℃，晚上设置为26 ℃[11]。
低温处理(Cold)：预先将光照培养箱的温度降至5 ℃(昼)/0 ℃(夜)，随后将辣椒苗放入光照培养箱中培养。对照组培养温度与高温处理对照组相同。
疫病(YB)处理：将辣椒幼苗的根置于用Hoagland′s培养液配制的病原菌(来自河南农业大学毛庄实验基地)孢子悬浮液中，以无菌水作对照。28 ℃保湿24 h后，在温度28 ℃、相对湿度70%～90%条件下培养。
上述处理的辣椒植株在培养箱中培养的光照强度均为160 μmol/(m2·s)，光周期均为12 h光/12 h暗。
1.2 辣椒Whirly基因家族成员的鉴定
将Whirly(pfam:PF08536)(http://pfam.xfam.org/)[12]的保守结构域在辣椒基因组数据库PGP(http://peppergenome.snu.ac.kr/，CM334蛋白)中进行Blast比对，获得的所有候选序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中进行Blast 比对。利用在线分析工具ProtParam (http://web.sxpasy.org/protparam/)分析候选氨基酸序列的等电点及分子质量[13]。
1.3 基因结构和蛋白质基序分析
以候选Whirly家族成员的CDS序列和基因序列为参照，通过在线GSDS 2.0(Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行基因结构分析[14]。分析时将CDS序列和基因序列都转换成FASTA格式，还要保持同一基因2种序列的对应。用MEME Suite 4.12.0在线软件(http://meme-suite.org/tools/meme)对Whirly家族蛋白质基序进行鉴定。
1.4 系统进化树分析
Whirly家族蛋白质全长序列用ClustalW进行多序列比对，ClustalW比对参数如下。空位罚分：10；空位延伸罚分：0.2；蛋白质重量矩阵：gonnet；残留特定的罚分：开；亲水罚分：开；间隙分隔距离：4；末端间隙分割：关闭；负矩阵：关闭；延伸分歧截止：30%。比对后Whirly蛋白序列用MEGA 7.0软件，使用邻近法构建进化树，其中校验参数Bootstrap值设置为1 000次重复。
1.5 辣椒Whirly基因组织表达模式分析
在辣椒参考基因组(https://www.nature.com/articles/ng.2877)中获取CM334 RNA-seq数据，利用HemI绘制Whirly基因在辣椒不同组织和果实发育中的表达热图。
1.6 辣椒总RNA的提取及cDNA第1链的合成
总RNA提取采用TaKaRa MiniBeST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa, Inc., Dalian, China)试剂盒，按照说明书进行操作。cDNA第1链合成采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Inc., Dalian, China)。
1.7 辣椒Whirly基因家族表达分析
采用qRT-PCR分析，引物见表1。反应体系为20.0 μL，其中cDNA为2.0 μL，上、下游引物均为1.0 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTM (TliRNaseH Plus) 10.0 μL以及ddH2O 6.0 μL。设置程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环40次[9]。采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量[15]。
表1 qRT-PCR引物序列
Tab.1 qRT-PCR primer sequences
基因Genes前引物(5′-3′)Forward primers(5′-3′)后引物(5′-3′)Reverse primers(5′-3′)片段大小/bpSizeCaWHY2CTGATGGCACTGGTTATTTTGTTTCTGCATTCTGAAGGCCGATTAG182CaWHY1TATGATTGGAGTAGAAAGCAGGTCCTGCCTTCGTAACAGGGATG249CaUBIFGTCCATCTGCTCTCTGTTGCACCCCAAGCACAATAAGAC198
表2 Whirly基因家族成员鉴定结果
Tab.2 Whirly family member identification list
编号No.基因名称Gene name序列IDSequence ID开放阅读框/bpORF length氨基酸数/个Number of amino acids分子质量/kuMolecular weight等电点pI1AtWHY3AT2G0274080726829.03 9.542AtWHY1AT1G1441079226328.38 9.383AtWHY2AT1G7126071723825.68 9.654BdWHY1BRADI1G5104082527429.67 8.985BdWHY2BRADI3G0445069623124.79 9.526BoWHY1.bBo8g06603090630132.18 9.577BoWHY3Bo7g08056078326027.96 9.588BoWHY2Bo6g11284072324025.61 9.489BoWHY1.aBo7g0452501 07435738.97 9.7110CsWHY2Csa5M64729072924226.12 9.5611CsWHY1Csa6M40424083427730.01 9.0012CaWHY2CA10g0810071423725.71 9.7113CaWHY1CA11g0538048316017.35 6.8414GmWHY1.eGLYMA18G1620069022924.64 9.5415GmWHY1.dGLYMA08G4085081026929.25 9.2816GmWHY2.aGLYMA03G4127072924226.37 9.1017GmWHY1.cGLYMA02G0244138112614.27 5.5418GmWHY1.bGLYMA02G0239078926229.09 9.7119GmWHY1.aGLYMA01G0500079226329.04 9.5620GmWHY2.bGLYMA19G4388083727830.44 9.5821SiWHY1Si006951m93030933.91 9.9622SiWHY2Si018290m 66922224.08 9.2023SlWHY1Solyc05g00710080726828.84 9.1324SlWHY2Solyc11g04475071123625.83 9.9825VvWHY1VIT_01s0026g0172080726829.46 9.6826VvWHY2VIT_18s0089g0090069623125.18 9.40
2 结果与分析
2.1 辣椒Whirly基因家族成员的鉴定
以拟南芥的Whirly蛋白氨基酸序列为查询序列进行BlastP相似性检索，共鉴定了26个单子叶(短柄草、谷子)和双子叶(辣椒、拟南芥、甘蓝、黄瓜、大豆、番茄、葡萄)的Whirly基因家族成员(表2)，其中辣椒CM334的Whirly基因有2个，分别为CaWHY1和CaWHY2。从表2可知，除了BdWHY1(pI=8.98)、CaWHY1(pI=6.84)、GmWHY1.c(pI=5.54)外，其他Whirly蛋白的等电点均在9.50左右。除CaWHY1和GmWHY1.c的分子质量分别为17.35,14.27 ku之外，其余Whirly蛋白的分子质量均在24.08～38.97 ku。
2.2 辣椒Whirly基因结构分析
通过GSDS基因结构分析可知，辣椒Whirly基因家族中CaWHY1有5个外显子、4个内含子，CaWHY2有7个外显子、6个内含子，CaWHY2和SlWHY2的基因结构完全一样(图1)。从图1还可以看出，除GmWHY1.c有2个内含子外，其他Whirly基因都有多个内含子(4～8个)。
图1 26个Whirly家族基因结构分析
Fig.1 Structure analysis of 26 Whirly family genes
图2 26个Whirly蛋白保守基序分布
Fig.2 Motif distribution of 26 Whirly proteins
2.3 辣椒Whirly蛋白保守基序分析
为了研究Whirly转录因子之间结构的多样性，利用MEME Suite 4.12.0 在线工具对26个不同物种的Whirly蛋白进行保守基序分析[16]。如图2所示，在Whirly家族中鉴定出3个保守基序。之前有研究报道表明，Whirly蛋白有3个结构域：N末端结构域、Whirly结构域和C末端多变区[17]。通过基序分析发现，Whirly基因家族在进化上结构具有保守性。
2.4 辣椒Whirly蛋白系统进化树分析
为更好地分析辣椒Whirly基因家族的进化，构建了辣椒、拟南芥、短柄草、甘蓝、黄瓜、大豆、谷子、番茄和葡萄的Whirly蛋白系统进化树(图3)。根据进化树的聚类结果，26个不同物种的Whirly蛋白明显分为3类：Class Ⅰ、 Class Ⅱ、Class Ⅲ。几乎所有的Whirly1属于Class Ⅰ，Whirly2属于Class Ⅱ，Whirly3属于Class Ⅲ。CaWHY1和SlWHY1聚在一起，CaWHY2和SlWHY2聚在一起，辣椒和番茄都属于茄科植物，其基因在功能上也有相似之处。同时，可以明显看出单子叶植物和双子叶植物分别聚在一起，表明单子叶和双子叶植物的Whirly基因在进化上有差异。
●.双子叶植物；□.单子叶植物。
●.Dicotyledon;□.Monocotyledon.
图3 26个Whirly蛋白的系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree constructed from 26 Whirly proteins
2.5 辣椒Whirly基因时空表达分析
为了探究Whirly基因在辣椒不同组织及果实发育中的作用，利用CM334的RNA-seq数据绘制了Whirly基因家族在4个组织(根、茎、叶和果实)以及7个果实发育时期的热图(图4)。结果显示，CaWHY1和CaWHY2在不同组织中的表达量有差异，CaWHY2在根、茎和叶中均表达，CaWHY1在根、茎、叶中表达量却很低。同时，在果实发育中CaWHY1表达量也很低。
图4 Whirly基因在辣椒不同组织和果实发育中的表达模式
Fig.4 Expression analysis of pepper Whirly genes in different tissues and fruit development
2.6 辣椒Whirly基因家族胁迫响应表达分析
利用qRT-PCR分析了辣椒CM334中的Whirly基因家族在逆境胁迫下的表达情况(图5)。辣椒的CaWHY1基因表达量在疫病胁迫下变化最为明显， 0～2 h急剧上升，2 h时达到最大值，为对照的4.5倍，随后表达量逐渐下降，24 h时下降到最小值，24～48 h又逐渐上升，48 h时其表达量为对照的1.8倍。CaWHY1在高温处理条件下，24 h时表达量达到最大值。在脱落酸、低温处理、茉莉酸甲酯胁迫下CaWHY1的表达量变化幅度相对不大。
CaWHY2在疫病和高温处理条件下的表达量变化最为明显，其中疫病胁迫下，在2 h 时其表达量达到最高值，为对照的2.3倍，随后逐渐降低，在12 h之后缓慢降低有趋于稳定之势，但最后表达量较对照有所下降。CaWHY2在高温处理条件下，2 h时其表达量上升至对照的1.7倍，6 h时又显著下降，之后逐渐上升，在24 h时表达量达到最大值，为对照的2.1倍，之后又逐渐下降，48 h时下降至对照的1.6倍。CaWHY2在脱落酸和低温处理条件下的表达模式相反，即当脱落酸胁迫下的表达量上升时，低温处理条件下的表达量下降，但脱落酸和低温处理条件下表达量的变化幅度不同。CaWHY2在茉莉酸甲酯处理条件下，0～2 h有不明显的上升，之后逐渐下降，24 h时降至最低值，约为对照的1/2，24～48 h逐渐上升，48 h时达到最大表达量，为对照的1.7倍。
图5 辣椒Whirly基因家族响应胁迫的qRT-PCR分析
Fig.5 qRT-PCR analysis of pepper Whirly gene family reacting to stress
3 结论与讨论
Whirly基因家族在双子叶和单子叶植物中均有发现。本研究在辣椒CM334中鉴定了CaWHY1和CaWHY2 2个Whirly基因，其中CaWHY2和番茄SlWHY2的基因结构完全一样，均有7个外显子、6个内含子，在进化树中CaWHY2和SlWHY2也是聚在一起，这可能是由于辣椒和番茄均属于茄科，亲缘关系较密切[18]。对蛋白质基序分析发现，Whirly蛋白在植物中高度保守，含有3个保守的基序。Whirly基因表达模式分析表明，CaWHY1和CaWHY2在不同组织和果实发育时期的表达水平存在差异。在脱落酸、低温处理、高温处理、茉莉酸甲酯和疫病处理条件下，CM334的Whirly基因均有表达。在疫病处理下，CaWHY2和CaWHY1表达量均增加，其中CaWHY1基因的表达量较CaWHY2增加更明显。CaWHY2基因在脱落酸和低温处理条件下表达量的变化趋势相反。
Whirly转录因子在植物的生长发育过程中起到很重要的作用[19]。另有研究证明，Whirly转录因子在叶绿体和细胞核中也发挥一定作用[20]。本研究对辣椒Whirly基因表达模式分析表明，Whirly基因家族在辣椒的生长发育中起调控作用。植物需要适应不利的环境条件，包括生物和非生物胁迫[21-22]。杨洋等[23]研究发现，Whirly转录因子在植物应对低温胁迫中发挥作用。本研究中，Whirly基因在各种胁迫处理下的表达量变化再次证明，Whirly基因在多种生物和非生物抗性反应中起重要作用。
Whirly基因在植物界中广泛存在，在其他物种尤其是拟南芥中Whirly基因的研究较为详细，但是有关辣椒Whirly基因的报道却较少。本研究鉴定了辣椒CM334中的Whirly基因，对其结构、进化关系、保守基序和表达模式进行了初步分析，并对其在逆境胁迫下的表达量变化进行了分析，为进一步研究Whirly基因在辣椒中的功能奠定了基础。
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