甜瓜是色香味俱佳的世界性果品，我国是甜瓜的生产大国，栽培面积和产量居世界首位。春季提早栽培和秋季延后栽培是保障甜瓜周年供应的重要茬口，能够大幅提高甜瓜经济效益，但早春期间外界气温低，阴雨天气多，大棚内甜瓜幼苗会长时间处于低温(<15 ℃)弱光(3 000～4 000 lux)状态，生长减缓，出现生理伤害。因此，筛选甜瓜耐低温弱光鉴定指标、选育耐低温弱光品种是甜瓜育种的重要工作。有关甜瓜耐低温弱光鉴定指标的研究比较全面，形态和生理指标都有涉及[1-6]。研究表明，甜瓜幼苗在低温弱光条件下，叶片出现褪绿黄化现象，这在西葫芦[7]、黄瓜[8]、辣椒[9]等作物中均有报道，因此，低温弱光影响甜瓜叶片叶绿素含量，叶绿素含量是鉴定甜瓜低温弱光特性的重要指标。
评价植物叶绿素含量的方法主要有2种，一种是利用乙醇或者丙酮作溶剂萃取植物中的叶绿素，通过分光光度计测定A663和A645波长吸光度，利用郎伯-比尔定律计算叶绿素绝对含量，该方法会破坏植株叶片组织，工作量大，不利于批量检测；二是利用SPAD叶绿素仪测定叶片单位面积的相对叶绿素含量，该方法操作简单，叶片无损。大量研究表明，2种方法评价叶绿素含量的结果具有良好的相关性，在番茄[10]、西葫芦[11]、菜豆[12]、菜心[13]、蕹菜[14]、菠菜[15]等作物中，都有SPAD值和叶绿素含量相关性的报道，并通过函数方法建立数学模型。甜瓜也有类似报道[16]。但上述研究均没有与抗逆性鉴定等应用挂钩，因此，在取样时期、取样部位等操作环节都不明确，这对实际应用缺乏指导意义。
利用SPAD值检测作物氮素营养的研究较为深入。胡国智等[17]发现甜瓜不同叶位的叶片SPAD值存在差异，每个叶位的叶片SPAD值和含氮量都有相关性，但是以顶3叶的相关性最高，最终选择甜瓜顶3叶作为SPAD值预测含氮量的测量叶。胡静等[18]研究开花期和结果期黄瓜叶片不同位点SPAD值的变化规律，发现叶片各位点SPAD值与叶片含氮量均存在显著相关，选择正三叶叶片氮素敏感部位作为诊断测定位点。上述SPAD值在植株叶片空间上的差异表明在应用SPAD仪的过程中科学选择测量叶的必要性。甜瓜两叶一心期至三叶一心期是对低温弱光敏感的时段，该时段有3片新叶，应选择哪个叶片作为测量叶，是建立一套科学统一的甜瓜耐低温弱光鉴定方法的重要因素。为此，本研究首先对丙酮研磨法和浸提法2种制备甜瓜叶片叶绿素样品的方法进行比较；再通过测量甜瓜两叶一心时期3片新叶SPAD值和叶绿素含量，分析两者的相关性；最后比较不同叶位的两指标间的相关性，建立回归方程，科学选择测量叶。
1 材料和方法
1.1 植物材料
选取甜瓜自交系P148饱满种子，催芽播种，生长至一叶一心期，取第一片新叶，用于叶绿素样品制备方法比较。每种方法重复3次，每次6株，分别由A、B、C 3人做3组平行试验。
自交系P148生长至两叶一心时，按照3片新叶生出早晚，自下而上依次编号Y1、Y2和Y3，用于不同叶位SPAD值和叶绿素含量的相关性分析。试验重复3次，每次16株。
1.2 试验方法
1.2.1 丙酮浸提法和研磨法提取甜瓜叶片叶绿素的效果比较 避开主叶脉，称取一叶一心期第1片新叶叶肉组织约0.1 g，计质量。方法1浸提法：用锋利的刀片将叶片切成约1 mm宽的细丝，放入10 mL离心管，加入丙酮-乙醇(V/V=2∶1)混合液10 mL，避光浸提2.5 h，叶片完全褪色。方法2研磨法：剪碎叶片，放入10 mL离心管，加少许CaCO3和石英砂，用少量丙酮-乙醇(V/V=2∶1)混合液研磨叶片成细末，定容至10 mL，避光浸提2 h，叶片褪色。利用K5600微量测定仪测定A663和A645波长吸光度，利用Arnon公式计算叶片叶绿素a、b和a+b含量。比较2种方法提取叶绿素的得率和测量误差出现的频率，判断2种方法的提取效果。
Chla含量(mg/g)=(12.7OD663-2.69OD645)×(V/(W×1 000))
Chlb含量(mg/g)=(22.9OD645-4.68OD663)×(V/(W×1 000))
Chla+b含量(mg/g)=(20.2OD645+8.02OD663)×(V/(W×1 000))
其中OD：测定波长下的光密度值；V：叶绿素提取液总体积(mL)；W：材料鲜质量(g)。
1.2.2 不同叶位叶片SPAD值和叶绿素含量的相关性分析 首先避开主叶脉，利用SPAD测试仪(KONICA MINOLTA，日本)分别测量Y1、Y2和Y3 3张叶片的前、中、后3点SPAD值，Excel求取平均值和标准差；再利用1.2.1部分方法1丙酮浸提法分别提取Y1、Y2和Y3的叶绿素。利用SPSS 13.0软件，首先通过One-Way-ANOVA程序，对甜瓜两叶一心期3张新叶的叶绿素a、b和a+b含量进行多重比较，观察不同叶位叶绿素含量的变化规律；再使用Correlation程序的leanear过程，计算不同叶位SPAD值与叶绿素含量的线性相关性；最后使用Regression程序，选择SPAD值与叶绿素含量相关系数最大的叶位，建立SPAD值与叶绿素含量回归方程，以此叶位作为甜瓜两叶一心时期利用SPAD值预测叶绿素含量的测量叶。
2 结果与分析
2.1 丙酮浸提法和研磨法提取甜瓜叶片叶绿素的效果比较
由表1数据可见，A、B、C 3个测量人分别利用方法1(浸提法)和方法2(研磨法)提取叶绿素，研磨法的提取值均高于浸提法。综合3人测量数据，可见研磨法提取的叶绿素a、b、a+b含量分别为1.10±0.08 mg/g，0.41±0.08 mg/g，1.51±0.12 mg/g，得率高于浸提法(0.90±0.04 mg/g，0.21±0.06 mg/g，1.10±0.05 mg/g)，通过方差分析，2种方法提取的Chla和Chlb差异显著，提取的Chla+b差异极显著。由此可见，研磨法提取叶绿素得率高。
分析A、B和C 3人分别使用2种方法提取Chla、b和a+b测量值的标准差(SE)，统计SE值小于0.1的测量值，方法1中有7组，方法2中只有3组，表明方法1(浸提法)操作简单，易于得到稳定数据。尽管方法2(研磨法)通过综合3人测量数据，也可以得到重复性好的数据结果(SE=0.08，0.08，0.12)，但是这是通过增加重复优化的结果。因此，浸提法相比于得率高的研磨法操作稳定，不需要增加重复数，更加适用于批量测定叶绿素含量的试验。
表1 不同测量人使用2种提取方法获得的叶绿素测量值
Tab.1 The chlorophyll content determinated by
different testers using two methods mg/g
测量人Tester指标Item方法1-浸提法Method 1-soaking method方法2-研磨法Method 2-grinding methodAChla0.91±0.04#1.01±0.13Chlb0.14±0.02#0.42±0.21Chla+b1.04±0.06#1.43±0.34BChla0.85±0.201.16±0.03#Chlb0.26±0.09#0.49±0.05#Chla+b1.11±0.291.65±0.07#CChla0.93±0.05#1.13±0.13Chlb0.22±0.02#0.33±0.10Chla+b1.15±0.07#1.46±0.233人综合Chla∗(P=0.015)0.90±0.04b1.10±0.08aTotalChlb∗(P=0.026)0.21±0.06b0.41±0.08aChla+b∗∗(P=0.005)1.10±0.05b1.51±0.12a
注：*.P=0.05水平差异显著；**.P=0.01水平差异极显著；#.SE值<0.1的测量值；ab.多重比较结果。表2-3同。
Note：*.Significant difference at the P=0.05 level; **. Significant difference at the P=0.01 level; #.The value with SE<0.1; ab. The multiple comparison results. The same as Tab.2-3.
2.2 不同叶位叶绿素含量的变化规律
由表2可见，3个叶位的SPAD值和叶绿素a、b、a+b含量有差异，数值随着叶位升高而增加。Y3的叶绿素含量极显著地高于Y1和Y2(P<0.01)，Y1和Y2之间的叶绿素含量差异不显著。
表2 甜瓜两叶一心时3片新叶SPAD值和叶绿素含量的比较
Tab.2 The SPAD value and chlorophyll content of three new leaves in two leaves and one new period of melon mg/g
叶片序号Leaf codeSPAD(P=0.001)Chla(P=0.010)Chlb(P=0.003)Chla+b(P=0.004)Y121.08±7.10B0.44±0.22B0.10±0.08B0.54±0.27BY222.01±8.05B0.51±0.31B0.12±0.09B0.63±0.39BY328.08±5.82A 0.66±0.29A0.18±0.09A0.84±0.35A
2.3 不同叶位SPAD值与叶绿素含量的相关性分析
通过计算甜瓜两叶一心时不同叶位叶绿素含量与SPAD值的相关系数(R)，判断两者相关性。由表3可见，随着叶位增加，R值降低，两者相关性降低。Y1和Y2的Chla、Chlb和Chla+b含量与SPAD值的R值在0.689～0.836与0.739～0.779，均达到了极显著水平(P<0.01)，Y1和Y2的Chla+b含量与SPAD值的R值比Chla和Chlb与SPAD值的R值高；Y3的叶绿素含量与SPAD的R值低(0.059～0.154)且没有统计学意义(P>0.05)，表明Y3的SPAD值与叶绿素含量之间没有显著线性相关性。不同叶位中以Y1的Chla+b含量与SPAD值的R值最高，表明两者相关性最高。
表3 甜瓜两叶一心时3片新叶叶绿素含量与SPAD相关系数(R)
Tab.3 The correlation coefficient (R value) of SPAD value and chlorophyll content of three new leaves in two leaves and one new period of melon
叶片序号Leaf codeChlaChlbChla+bY10.809∗∗0.689∗∗0.836∗∗P=0P=0P=0Y20.739∗∗0.741∗∗0.779∗∗P=0P=0P=0Y30.1540.0590.144P=0.493P=0.793P=0.523
2.4 建立SPAD值与叶绿素含量回归方程
选择与SPAD值相关系数最大的叶位Y1和叶绿素含量指标Chla+b，建立回归方程：y(Chla+b)=0.032×x(SPAD)-0.141，决定系数(R2)=0.699，以此叶位作为甜瓜两叶一心时期利用SPAD值预测叶绿素含量的测量叶。
3 结论与讨论
本研究通过测量甜瓜幼苗两叶一心时期，自下而上的3片新叶SPAD值和叶绿素含量，分析发现，甜瓜叶片SPAD值和叶绿素含量随着叶位升高而增加，Y3的叶绿素含量极显著地高于Y1和Y2。这与肖关丽和郭华春[19]报道结果相同，他们对不同温光条件下马铃薯不同叶位的SPAD值变化规律进行研究，发现马铃薯上部4片叶的SPAD值较高，SPAD值随叶位的升高而增加，推测可能与叶片成熟度和叶绿素合成分解规律有关。同时，3个叶位叶绿素含量与SPAD的线性相关性则随着叶位升高而降低，Y1的Chla+b含量与SPAD值的相关性最高，而Y3的叶绿素含量与SPAD值无显著相关性。这与胡国智等[17]发现甜瓜以顶3叶的SPAD值和含氮量相关性最高的结论不同。乔润雨等[15]研究21种绿叶菜SPAD值与叶绿素含量的相关性，发现不同绿叶菜对应的相关性类型不同，除了线性相关，还出现了指数相关、乘幂相关等其他非线性相关。目前对于同株植物不同叶位SPAD值和叶绿素含量的相关性研究鲜有报道，尚不能确定引起本研究结果的原因是否为相关性类型发生变化；但是本研究已经证实，甜瓜幼苗两叶一心时期的3片新叶SPAD值和叶绿素含量不同，两者相关程度不同，应选择该时期第一片新叶作为SPAD值预测叶绿素含量的测量叶。
叶绿素是植物体进行光合作用的重要色素，其含量的多少与植株光合能力的大小有着密切的关系。唐懿等[20]研究发现，低温弱光会降低茄子幼苗的光合速率，引起膜脂过氧化，严重影响幼苗的质量；聂书明等[21]指出，低温弱光条件下，辣椒叶片叶绿素含量呈明显下降趋势。可见逆境胁迫下的植物叶片叶绿素含量，不仅直接影响着植物的光合同化过程，也是衡量植物耐逆性的重要指标之一。在利用叶绿素含量评价甜瓜耐低温弱光特性的实际操作中，尚缺乏具体测量叶位的报道。本研究分析了两叶一心期不同叶位SPAD值和叶绿素含量和相关性，一方面明确了测量叶为第一片新叶，另一方面建立2个指标回归方程，为简化叶绿素指标测定的操作提供了有益的补充。
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