甘蔗割手密高贵化育种中分子细胞遗传学研究进展

甘蔗主要生长于热带或亚热带地区,属于多年生C4植物,蔗糖占全世界糖产量的80%,并在可再生能源方面具有巨大的潜力。因此甘蔗是一种重要的糖、能兼用作物[1]。此外,产糖时产生的蔗渣也可用于燃料、造纸和饲料等[2]。甘蔗除具有重要的经济价值外,在多倍体植物基因组演化分析上也是重点植物之一[3]。甘蔗属是禾本科黍亚科蜀黍族甘蔗亚族群甘蔗亚族中10属之一,具有较高的染色体倍性变化(4～16倍体)以及复杂的基因组(～7 Gb)。甘蔗属与蔗茅属、硬穗茅属、河八王属、芒属的亲缘关系相对较近,统称为 “甘蔗属复合体(Saccharum complex)” [4]。在甘蔗属复合体中,甘蔗属的利用价值最高且研究应用最为广泛。甘蔗属(Saccharum)由细茎野生种(又称割手密,Saccharum spontaneum,2n=32～128,x=8)、大茎野生种(Saccharum robustum,2n=60或80,x=10)、热带种(Saccharum officinarum,2n=80,x=10)、中国种(Saccharum sinense,2n=116～118)、印度种(Saccharum bareri,2n=82～124)和食穗种(也称肉质花穗种,Saccharum edule,2n=60或80)组成。经基因组原位杂交认为,中国种和印度种都是热带种与割手密杂交后代[5]。原先认为大茎野生种经过人工栽培驯化得到热带种[6],但最新的分子生物学证据表明它们是2个独立的甘蔗种[7]。因此,割手密、热带种和大茎野生种被认为是甘蔗属的3个原始种[7]。目前,大多数的栽培甘蔗品种中都含有这3个原始种的血缘。在甘蔗属的6个种中,除了食穗种应用相对较少以外,其他5个种均应用广泛且有重要的利用价值,特别是割手密和热带种[8]。

1.1 割手密及其相关分子细胞学研究

割手密的基因型众多,植株从矮小,无茎,丛生至大茎,无性系间表型差异巨大,遗传多样性极为丰富[9]。大部分割手密具有高纤维,低糖分,茎中空等特点[10-11]。割手密可通过有性或无性繁殖方式进行传播,具有抗逆性强、根系发达、适应性广等优点,其抗逆性主要包括抗旱性、抗寒性、抗病、抗辐射性以及耐瘠性,是甘蔗育种的抗性基因库[12]。爪哇割手密的杂交后代具有流胶病的抗性,印度割手密的杂交后代具有较好的适应性,而缅甸割手密的开发利用造就了澳大利亚甘蔗育种的辉煌成就[13]。在甘蔗育种过程中,割手密的开发利用使得甘蔗育种取得很多突破性的进展。割手密的染色体数目变异幅度极大(2n=32～128),具有丰富的遗传多样性。王平等[14]通过5S rDNA探针定位8倍体和13倍体割手密材料说明了5S rDNA位点与倍性的一致性,且不同倍性割手密材料染色体结构存在多样性。李苏洁等[15]通过5S rDNA探针证明缅甸存在多种倍性的割手密材料。到目前为止,报道的割手密染色体基数基本都是x=8[16-17]。随着分子生物学的发展和不断应用,科学家们也相继采用分子标记,对甘蔗的亲缘关系、遗传关系和抗性进行深入研究,为后期育种提供优良抗性材料和参考依据。ISSR、RAPD、AFLP已广泛用于检测割手密材料的遗传多样性[18],评价种间亲缘关系等[19-20],SSR和SRAP分子标记也用于割手密与斑茅杂交后代真伪鉴定[21]。然而,割手密优势抗性基因的研究还相对较少。因此研究者们提出新思路,即通过分子标记和基因克隆等方式研究筛选割手密的相关抗性基因。申明明等[22]从割手密克隆出抗旱基因ScALDH；徐荣等[23]也从甘蔗野生种割手密叶片中挖掘出抗旱基因ScPP2C，这为割手密野生种质资源的抗逆性材料选育奠定了理论基础,进一步提高了甘蔗的选种效率。

1.2 热带种及其相关分子细胞学研究

热带种起源于新几内亚,品种类型高达几百个。由于热带种具有大茎、多汁、高糖、高产等众多的优异性状,在甘蔗育种中占有举足轻重的地位,通常也被称为高贵种,但其抗病性、抗逆性和适应性较差,且分蘖力弱[1],限制了它在制糖产业中的应用。因此,将其他野生种质资源的各种抗性基因导入到热带种中成为甘蔗育种者们获得高产、高糖和高抗甘蔗品种的重要途径之一。典型热带种染色体数2n=80[24-25],染色体基数x=10[26],其主要代表品种类型有：Black Cheribon、Badila、罗汉蔗和南涧果蔗等。但同时也存在着染色体数目非80条的非典型热带种,一般认为这种非典型的热带种都属于非整倍体或杂种[25, 27]。Price[28]研究了144份形态学认定的热带种的无性系,结果就发现其中典型的热带种有129份,15份材料为非典型热带种或杂种。Yu等[25]也利用基因组原位杂交证明典型的热带种染色体数目为2n=80,而那些非典型的热带种材料均为热带种与割手密之间的杂交后代。此外,为了提高真假热带种的检测效率,分子标记技术也在热带种杂种鉴定上发挥了巨大作用。Yang等[29]利用45S rDNA上保守的SNP位点差异设计引物,利用PCR成功鉴定热带种中是否包含割手密血缘,极大地提高了真假热带种的鉴定效率。

2 甘蔗热带种与割手密的高贵化育种

尽管利用甘蔗制糖已有数千年历史,但直到19世纪末才开始甘蔗的有性杂交育种。1887-1888年,Sotwedle、Harrison和Bovell等发现存在天然的甘蔗实生苗[30],甘蔗杂交育种才开始逐渐进入人们视野。1889-1890年,Jeswiet首次提出并总结了甘蔗高贵化的育种思路(图1),这为后来的甘蔗高贵化育种奠定了理论基础,开辟了甘蔗有性杂交育种的新纪元。甘蔗高贵化育种,即以热带种为母本,野生种质资源为父本杂交,将获得的杂交后代作为父本连续与热带种(或栽培种)回交的过程[30]。1921年,Jeswiet正是通过高贵化路线,以高贵种(热带种)和割手密作为亲本进行高贵化育种,从而选育出了POJ系列品种和亲本材料(图1)。其中,抗病高产高糖品种POJ2878成为了风靡全球的蔗王和应用最广泛的杂交亲本,现今绝大多数甘蔗商业品种均含有它的血缘[30]。

目前,甘蔗商业栽培种大多数都是利用种间、属间杂交或回交育成的[24, 30]。基于甘蔗的高贵化育种理论,许多国家都先后开展热带种与割手密的杂交且都取得不同程度的进展。1916年,Barber利用热带种Vellai、印度细茎野生种和印度种进行不断杂交,育得抗病、高产、高糖的Co系列品种[30]。我国台湾甘蔗育种场开展亲本创新的研究,在割手密、热带种和大茎野生种的利用方面也取得突破性成就,选育出了台糖系列和新台糖系列的优良品种[31]。海南甘蔗育种场也以热带种Badila与不同类型的割手密进行杂交,选育大批含Badila血缘的育种中间材料。1960-1990年,利用获得的中间材料与栽培品种进行回交,选育出了崖城系列的重要亲本材料[32],并利用这些亲本育成了我国大陆绝大多数品种。甘蔗种间杂交是目前获得高糖、高产、高抗甘蔗优良品种最重要的途径,甘蔗高贵化育种既可以将外源的野生优良抗性基因传递到杂交后代,又能通过染色体2n+n的遗传方式将高贵种的高产高糖基因保留,甚至在BC1代还得到加强,从而极大地推进了获得甘蔗优良品种的育种进程[33]。根据前人对甘蔗割手密高贵化杂交过程中的研究可知,F1和BC1后代染色体遗传方式是2n+n[28,34],即热带种以2n配子传递,割手密以n配子传递。母本染色体成倍增加,不仅热带种的高贵基因能继续保持,还能迅速提高其血缘比例,其杂交后代中所含热带种染色体数量比其亲本还多。而杂交品种与割手密杂交时染色体通常以n+n的方式遗传。所以只有以典型的热带种作为亲本,杂交、回交时染色体才会以2n方式遗传。若是仅仅将与热带种形态相似的假热带种或栽培品种,当作母本或回交亲本,则不存在2n配子的传递,也就无法实现热带种高贵基因的大幅提高,这会大大延缓高贵化的进程,增加了育种年限和成本。因此,甘蔗高贵化育种中起始亲本或回交亲本必须选择那些能引起染色体加倍的材料,这样才能达到高贵化的目的,使得目标性状能够在后代中快速加强。

通过甘蔗高贵化,一般含有10%～20%割手密血缘的甘蔗品种产量、糖分和抗逆性等综合性状会比较理想。随着高贵化次数的增多,野生血缘会被不断稀释,导致杂交后代的各种抗性不断降低,从而直接影响甘蔗的产量。但如果选用抗逆性强的BC2、BC3中间材料进行强化,其后代的抗逆性也能保持。当然后代野生种质染色体比例只是其中的影响因素之一,只有导入包含丰富抗逆基因的染色体到杂交后代中，才能从根本上提高后代的抗逆性状。此外,由于甘蔗自基础性杂交育种到育成商业品种的年限长,育种者往往不重视从事基础杂交,而是选择少数几个创制的亲本或商业品种间相互杂交,虽然育成了一批优良的品种,但是甘蔗的遗传基础狭窄,导致亲本间和品种间的异质性低,后代普遍抗性越来越差。为此,甘蔗育种家们也开展了大量拓宽甘蔗遗传基础的相关研究[35-36]。我国海南甘蔗育种场育种家们选择不同的热带种无性系,如Badila、Fiji、越南牛蔗等作为高贵化育种的起始亲本,利用不断杂交和回交的方法进行亲本的创新研究。此外,我国割手密种质资源极其丰富,且染色体有2n=64，72，80，96和104等不同类型[37-40]。其中,2n=64，80，96这3种类型最为丰富[39,41-42]。目前,利用海南崖城割手密和云南割手密已创制出大量含中国割手密的亲本组合,丰富了中国甘蔗育种的遗传基础[43]。

3 甘蔗与割手密高贵化过程中的分子细胞学研究

3.1 甘蔗杂交过程中染色体遗传的多样性

甘蔗栽培种包含复杂且数量众多的异源染色体,与经典的细胞遗传不同,甘蔗有性杂交育种时亲子代之间染色体的传递方式呈现出多样化的特点,存在n+n、2n+n、n+2n、2n+2n等多种传递方式[24, 44-46]。而目前看来杂交亲本的不同是导致这种复杂遗传方式的主要原因。如以热带种为母本与割手密杂交大部分杂交后代染色体传递为2n+n,而以而用栽培品种母本与割手密杂交则为n+n；以甘蔗属间材料为亲本时则会出现更为复杂的n+n、2n+n、n+2n、2n+2n等多样化的传递方式[46]。由于甘蔗近缘属具有众多优异的抗逆性状,利用杂种优势可以快速提高杂交后代的各种抗性性状,所以前人进行了大量甘蔗与近缘属间的杂交育种。如河八王属与甘蔗热带种、大茎野生种杂交表现为n+n；而与割手密就表现为n+n和2n+n的遗传方式。甘蔗热带种、割手密与硬穗茅属杂交则表现为更加复杂的n+n、n+2n和2n+n的遗传方式。甘蔗属与芒属之间的杂交也表现出更为复杂的遗传方式n+n、n+2n和2n+n。甘蔗属与蔗茅属的染色体遗传方式也是更加复杂,有n+n、n+2n、2n+n和2n+2n等方式[46]。因此,明确杂交后代的遗传方式对甘蔗育种来说至关重要。基于染色体计数的方法,热带种与割手密杂交后代F1及BC1大多数都是2n+n的染色体传递模式[17, 28]。然而,以前通过简单的染色体计数只能推测其染色体组成,并不能真实直接反映基因组组成和杂交后代染色体的遗传方式,这无疑会极大地影响育种效率。因此,基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization, GISH)便广泛地应用甘蔗遗传学研究中,能极大地提高育种的准确性[5, 16, 26, 46-47]。

3.2 甘蔗割手密的高贵化过程中染色体的遗传

1996年,D′Hont等[26]首次利用GISH技术成功识别商业栽培种R570的基因组组成,将R570中热带种(80%),割手密(10%)以及它们之间的重组染色体(大约10%)均区分开来。Piperidis等[24-44]基于GISH发现甘蔗高贵化后代中表现为典型的2n+n传递方式,而D′Hont[26]发现热带种BNS3066(2n=80)与割手密SES14(2n=64)杂交F1中,其遗传方式为n+n。这说明了甘蔗割手密高贵化过程中染色体传递方式也并非单一的2n+n染色体传递方式。Yu等[25]利用GISH证明5个热带种与割手密杂交F1中也存在着n+n和2n+n染色体传递方式,并且在同一个杂交后代无性系中同时存在着n+n和2n+n这2种不同的遗传方式(图2)。这些研究结果均表明,割手密高贵化杂交后代除了常见的2n+n染色体传递方式[48],还有存在着n+n的遗传方式。在甘蔗高贵化过程中,2n+n的染色体传递方式有利于高糖基因的富集,因此选择2n+n杂交后代将大大地提高甘蔗育种效率。目前GISH是检测基因组组成高效且准确的细胞学技术,今后也将广泛地用于了解现代甘蔗品种复杂的基因组结构,为甘蔗育种提供理论基础。

4 甘蔗高贵化育种的拓展与前景

甘蔗高贵化育种过程中,亲本选择单一,遗传背景狭窄,已经导致了杂交后代宿根性差、抗性低、种植品种产量低等大量问题。尽管可选择的种质数量众多[36](全世界已有超过万份甘蔗种质资源),但是实际生产应用中却只占少数。如热带种只有Black Cheribon和Badila等少数无性系被利用；割手密中利用最为广泛的只是爪哇割手密和印度割手密；印度种应用最广泛的是春尼；中国种有竹蔗、Uba等被利用；大茎野生种只有Mol 123和台湾的大野被利用。其次,虽然育种者们搜集了大量的野生资源,但在种质收集过程中无法及时对其开发利用价值进行科学评价。仅仅通过观察形态特征对其进行分类,这很容易出现种质分类有误的情况。第三,野生种质资源的生理生态学和细胞遗传学等方面研究还太少,存在研究不全面、不深入等问题,导致大部分野生种质资源未被开发利用。总之,甘蔗遗传基础狭窄已经极大地阻碍了其进一步发展,挖掘优异性状野生种质资源创新亲本材料将成为未来甘蔗育种的重要方向之一。

目前,甘蔗育种者们也开始展开甘蔗远缘杂交育种,目的是将近缘属野生种质资源的优异的基因引入到甘蔗栽培品种中[8],拓宽甘蔗背景。甘蔗属与蔗茅属(滇蔗茅、蔗茅和斑茅)杂交最早报道。我国也进行了甘蔗属与芒属[49]、甘蔗属与河八王属[50-51]等属间杂交。其中,以斑茅的利用最为广泛[32, 52-53],Wu等[54-55]研究发现其后代F1遗传方式为n+n,而在BC1中大部分为不平衡的2n+n或超亲现象,BC2及更高代又恢复为n+n传递,这将为今后充分利用甘蔗与斑茅杂交后代奠定基础。因此,甘蔗近缘属间杂交也将成为今后拓展甘蔗遗传背景的重要途径之一。

此外,甘蔗高贵化育种过程中杂交后代染色体的传递方式会直接影响甘蔗高贵化育种进程,然而到目前为止还未见有报道导致这种多样化的染色体方式的具体分子机制。因此,研究高贵化过程的遗传分子机制,将为充分利用甘蔗特殊的遗传方式辅助育得优良的甘蔗品种提供指导作用。随着现代分子生物学的日益发展和各学科之间的相互渗透,分子设计育种目前已大量应用在水稻和小麦等作物上[56-57],并且已取得较大的成功。而且伴随甘蔗割手密全基因组的公布,现代分子设计育种策略也将进一步用于选择优异亲本材料辅助甘蔗的高贵化育种。

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