生菜(Lactuca sativa)是世界范围内广泛种植的绿色蔬菜之一,具有很高的生产和经济价值,其人均消费量仅次于马铃薯[1]。近年来,随着生菜种植面积的不断增加和设施种植模式的快速推广,生菜已成为国内主要种植的叶菜种类。然而,由于设施栽培过程中植物生长环境相对闭塞、高湿、弱光、重茬等特点,一些生菜病害发生也日益频繁[2]。其中,细菌性软腐病正呈现逐年上升的趋势。该病害是生菜上普遍发生的一类毁灭性病害[3],在高温高湿的密闭环境中易大规模爆发,传播速度快且为害时间长,极易造成蔬菜产量和品质大幅度下降,给生菜产业带来严重的经济损失。
胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum(Pc))是引起的叶类蔬菜细菌性软腐病的主要致病菌[4-5]。该致病菌主要通过伤口(如虫害啃食、人为机械损伤所造成的)进入到植物组织中,进而危害植株叶柄、叶片,产生水渍状病斑,最终导致整棵植株腐烂死亡,并散发恶臭气味；且湿度越大,发病越重[6-7]。由于Pc寄主范围和地理分布广泛[8],可通过灌溉水传播,且植株整个生育期均可被侵染,因此难以正确掌握病害的防治时期；另外,传统对该病害的防治主要依靠喷施化学抗生素(如农用链霉素)和铜制剂(如可杀得、龙克菌)[9],但生菜生产周期短、农药易残留,施用化学农药不仅不能满足防治需求,反而会引发更多的食品、环境安全性问题。
选育并合理利用抗病品种来防治生菜细菌性软腐病是目前最为经济、安全、有效的措施[10]。早期研究已经证实了宿主抗性可用于有效防治马铃薯(Solanum tuberosum)[11]、大白菜(Brassica pekinensis)[12]、马蹄莲(Zantedeschia spp.)[13]和甘蓝(Brassica oleracea)细菌性软腐病[14]。然而关于生菜细菌软腐病抗性的研究还较少。本研究通过比较不同软腐致病菌、接种方法、苗龄、接种后调查时间对软腐病发病的影响,建立一种简便易行的生菜细菌性软腐病接种鉴定方法。在此基础上,为明确华北地区主栽的生菜品种对细菌性软腐病的抗性,本试验选择了50个不同生菜品种为试验材料,涵盖了目前生菜根据叶片生长状态和叶片颜色划分的3种生长类型(即直立型、散叶型和结球型)和2种叶色型(即绿叶型和紫叶型),分别通过春、秋茬2次对照接种试验对这些品种进行综合抗病性评价,以期明确供试生菜品种对细菌性软腐病的抗性水平,筛选优质抗病种质资源,为抗病育种和病害的有效防控提供科学基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试病原菌及接种液的制备 供试病原菌由谢华课题组分离、鉴定和保存,包括胡萝卜果胶杆菌(P.carotovorum)的3个亚种菌株：P.carotovorum subsp. carotovorum(Pcc)菌株KC-6,P.carotovorum subsp. brasiliensis(Pcb)BC1和P.carotovorum subsp. odoriferum(Pco)SC1-8。
将供试菌株转接至Luria-Bertani(LB)液体培养基中,28 ℃振荡过夜培养24 h后,4 000 r/min离心5 min收集菌体,用无菌水配成浓度为OD600≈0.2(菌浓度约2×108 cfu/mL)菌悬液作为致病性鉴定用接种液。
A. 直立绿叶型；B. 散叶绿叶型；C. 结球绿叶型；D. 直立紫叶型；E. 散叶紫叶型。
A. Romaine green type；B. Loose-leaf green type；C. Crisphead green type；D. Romaine purple type；E. Loose-leaf purple type.
图1 田间不同类型生菜表型
Fig.1 Phenotypes of different lettuce types in the field
1.1.2 供试生菜品种 前期收集了50份华北地区主栽生菜品种,涵盖17份结球型生菜品种(均为绿叶生菜),26份散叶型生菜品种(包括15份绿叶生菜和11份紫叶生菜材料)和7份直立型生菜(包括4份绿叶生菜和3份紫叶生菜材料)。各种类型如图1、表1所示。
表1 本研究所用的50份生菜品种信息
Tab.1 Information for the fifty lettuce cultivars used in this study
序号 Number品种 Cultivar来源 Source结球:绿叶型生菜(17份)Crisphead: green type lettuce (17 cultivars) 1奶生一号京研益农(北京)种业科技有限公司2绿翡翠北京爱德万斯种子有限公司3瑞丽结球生菜青县青丰种业有限公司4北生1号北京开心格林农业科技有限公司5北生2号北京开心格林农业科技有限公司6北生3号北京开心格林农业科技有限公司7北生4号北京开心格林农业科技有限公司8射手(101)北京圣华德丰种子有限公司9裕生1号北京东升种业有限公司10裕生2号北京东升种业有限公司11裕生3号北京东升种业有限公司12裕生4号北京东升种业有限公司13亚特兰大北京东升种业有限公司14意大利耐抽薹北京绿东方农业技术研究所15卡纳北京硕源种子有限公司16万盛118北京鼎丰现代农业发展有限公司17雷达北京鼎丰现代农业发展有限公司散叶:绿叶型生菜(15份) Loose-leaf: green type lettuce (15 cultivars)18裕散生1号北京东升种业有限公司19裕散生2号北京东升种业有限公司20裕散生3号北京东升种业有限公司21裕散生4号北京东升种业有限公司22北散1号北京开心格林农业科技有限公司23北散2号北京开心格林农业科技有限公司24北散3号北京开心格林农业科技有限公司25北散4号北京开心格林农业科技有限公司26大速生京研益农(北京)种业科技有限公司27罗生3号京研益农(北京)种业科技有限公司28大橡生2号京研益农(北京)种业科技有限公司29奶油生菜青县青丰种业有限公司30西班牙绿北京鼎丰现代农业发展有限公司31金森北京硕源种子有限公司32慕斯北京硕源种子有限公司散叶:紫叶型生菜(11份) Loose-leaf: purple type lettuce (11 cultivars)33北紫1号北京开心格林农业科技有限公司34北紫2号北京开心格林农业科技有限公司35北紫3号北京开心格林农业科技有限公司36北紫4号北京开心格林农业科技有限公司37红生1号京研益农(北京)种业科技有限公司38罗生1号京研益农(北京)种业科技有限公司39橡生1号京研益农(北京)种业科技有限公司40橡生二号京研益农(北京)种业科技有限公司41大橡生一号京研益农(北京)种业科技有限公司42美国紫叶生菜青县青丰种业有限公司43罗莎红北京鼎丰现代农业发展有限公司直立: 绿叶型生菜(4份) Romaine: green type lettuce (4 cultivars)44立生一号京研益农(北京)种业科技有限公司45意大利生菜北京硕源种子有限公司46香港玻璃生菜青县青丰种业有限公司47罗曼尼北京圣华德丰种子有限公司直立:紫叶型生菜(3份) Romaine: purple type lettuce (3 cultivars)48紫罗马北京绿东方农业技术研究所49立生四号京研益农(北京)种业科技有限公司50汉堡青县现代农业技术推广中心
1.2 试验方法
1.2.1 接种病原菌、苗龄和观察时期的确定 以田间抗性表现中抗的生菜品种北生3号为材料,分别设置接种病原菌、苗龄和接种后观察时期3个因素,每个因素设置3个水平(表2),共27个处理(表3),每个处理5株生菜幼苗,试验重复3次。接种方法为针刺法,接种后放在培养箱中温度保持在28 ℃,湿度保持在90%以上,调查发病情况。
表2 生菜细菌性软腐病苗期抗性鉴定试验因素与水平
Tab.2 Factors and levels for testing seedling resistance to bacterial soft rot disease
因素Factor水平 Level123病原菌 (P)PathogenPcb BC1(P1)Pcc KC-6(P2)Pco SC1-8(P3)苗龄(S)Seeding age3-4片叶(S1)5-6片叶(S2)7-8片叶(S3)接种后调查时间(T)12 h(T1)24 h(T2)48 h(T3)Time of disease investigation after inoculation
表3 生菜苗期细菌性软腐病鉴定实施方案
Tab.3 Identification method of the bacterial soft rot disease at the seedling stage of lettuce
试验编号Number病原菌(P)Pathogen苗龄(S)Seedling age调查时间(T)/hTime of disease investigation1Pcb BC1(P1)3-4真叶(S1)12(T1)2Pcc KC-6(P2)3-4真叶(S1)12(T1)3Pco SC1-8(P3)3-4真叶(S1)12(T1)4Pcb BC1(P1)5-6真叶(S2)12(T1)5Pcc KC-6(P2)5-6真叶(S2)12(T1)6Pco SC1-8(P3)5-6真叶(S2)12(T1)7Pcb BC1(P1)7-8真叶(S3)12(T1)8Pcc KC-6(P2)7-8真叶(S3)12(T1)9Pco SC1-8(P3)7-8真叶(S3)12(T1)10Pcb BC1(P1)3-4真叶(S1)24(T2)11Pcc KC-6(P2)3-4真叶(S1)24(T2)12Pco SC1-8(P3)3-4真叶(S1)24(T2)13Pcb BC1(P1)5-6真叶(S2)24(T2)14Pcc KC-6(P2)5-6真叶(S2)24(T2)15Pco SC1-8(P3)5-6真叶(S2)24(T2)16Pcb BC1(P1)7-8真叶(S3)24(T2)17Pcc KC-6(P2)7-8真叶(S3)24(T2)18Pco SC1-8(P3)7-8真叶(S3)24(T2)19Pcb BC1(P1)3-4真叶(S1)48(T3)20Pcc KC-6(P2)3-4真叶(S1)48(T3)21Pco SC1-8(P3)3-4真叶(S1)48(T3)22Pcb BC1(P1)5-6真叶(S2)48(T3)23Pcc KC-6(P2)5-6真叶(S2)48(T3)24Pco SC1-8(P3)5-6真叶(S2)48(T3)25Pcb BC1(P1)7-8真叶(S3)48(T3)26Pcc KC-6(P2)7-8真叶(S3)48(T3)27Pco SC1-8(P3)7-8真叶(S3)48(T3)
1.2.2 病情分级及抗感评价标准 参照大白菜软腐病单株分级标准,并在此基础上,根据生菜细菌性软腐实际发病情况,对其进行了改进,将病情具体划分为8个级别：1 级：接种点无症状；2 级：接种叶柄病斑长度介于1～5 mm；3 级：接种叶柄病斑长度介于6～10 mm；4级：接种叶柄病斑长度介于11～20 mm；5 级：接种叶柄病斑长度介于21～30 mm；6 级：接种叶柄病斑长度介于31～40 mm；7 级：40 mm以上；8 级：植株整体全部腐烂。
病情指数计算公式：
病情指数(Disease index,DI)=∑(各级病叶片数×各相应病级数)/(鉴定总叶片数×最高病级数)。
生菜品种细菌性软腐病抗性水平按照以下标准进行确定：
免疫(Immune,I)：DI=0；高抗(Resistant,R)：0 1.2.3 数据处理与分析 采用SPSS 10.0软件对生物学特性数据进行统计分析,以Tukey HSD单因素方差(ANOVA)方法,分别在5%和1%水平上进行差异显著性分析。 分别对1.1.2中50份生菜种质资源春、秋茬进行细菌性软腐病抗病性鉴定。对每个品种春、秋病情指数取平均值,进一步对这些生菜品种进行综合抗性评价。 生菜育苗、接种及病情调查均在北京通州永盛园温室进行。供试生菜种子用75%乙醇浸泡60 s,再用1%次氯酸钠消毒45 s,无菌水冲洗3次,晾干。种植基质为灭菌的田园土和营养土混合(2∶1)。采用72 穴的育苗盘进行育苗,每穴3～5 粒,出苗后每穴保苗1株,长至适龄移栽至装有灭菌土壤的花盆(高9 cm,底径7.5 cm,口径11 cm)中,用于之后的接种鉴定。每个生菜品种接种设置3组重复,每组重复5株,共15株,以清水对照。接种后将幼苗放置于温室内搭建的小型塑料拱棚中,湿度维持90%以上。 采用针刺法,比较了不同调查时间(12，24，48 h)、接种苗龄(3-4片，5-6片和7-8片真叶)和常见的3种软腐致病亚种菌株(Pcc KC-6、Pcb BC1和Pco SC1-8)对生菜软腐病发病的影响。方差分析结果显示,苗龄(S因素)和调查时间(T因素)的F 值分别为12.04和29.72,达到极显著水平(F值>F0.01=8.096)；而病原菌种类(P因素)的F值为3.94,未达到显著水平(F值<F0.05=4.351)。因此,调查时间较苗龄和接种病原菌而言,影响最大,苗龄次之,接种病原菌种类对生菜细菌性软腐病的发病无显著影响。 从表4可以看出,第25个处理组合(Pcb BC1,7-8片真叶,接种后48 h调查)的接种效果最好,病情指数最高,为0.72,与其他26个处理组合结果存在极显著差异(P<0.01)。综上所述,采用胡萝卜果胶杆菌巴西亚种Pcb BC1、接种7-8片真叶期生菜幼苗,并于接种后48 h调查病情效果最佳。 采用上述最佳方法对50份生菜种质资源分别进行春、秋茬试验抗性鉴定,结果显示,所有生菜品种植株在春、秋茬试验中均发病,且不同品种的发病程度差异明显(图2、表5)。春茬供试的50个品系中,包括高抗品种(0 表4 本研究不同组合方法对软腐病发病的影响 试验号No.组合Combination病情指数DiseaseindexP-value(0.05)(Turkey HSD)P-value(0.01)(Turkey HSD)25P1S3T30.72±0.02aA22P1S2T30.57±0.02bB27P3S3T30.53±0.01bcBC26P2S3T30.45±0.02cdCD23P2S2T30.42±0.01deDE8P2S3T10.37±0.01defDEF24P3S2T30.37±0.01defDEF19P1S1T30.34±0.02efgEFG20P2S1T30.30±0.01fghFGH13P1S2T20.29±0.03ghiFGHI14P2S2T20.27±0.04fghEFG17P2S3T20.27±0.01ghiFGHI5P2S2T10.26±0.01ghijGHI7P1S3T10.26±0.01ghijGHI16P1S3T20.26±0.01ghijGHI18P3S3T20.26±0.01ghijGHI4P1S2T10.25±0.02hijGHIJ21P3S1T30.25±0.01hijGHIJ10P1S1T20.24±0.02hijGHIJK11P2S1T20.21±0.01ijkHIJK15P3S2T20.21±0.01ijkHIJK9P3S3T10.19±0.01ijkIJK6P3S2T10.18±0.01jkIJK1P1S1T10.15±0.02kJK2P2S1T10.15±0.02kJK12P3S1T20.15±0.01kJK3P3S1T10.14±0.01kK 比较50个生菜品种春、秋茬抗病性鉴定结果发现,32个(64%)生菜品种在抗病性鉴定结果与春茬一致,包括8个高抗品种、20个中抗品种和4个感病品种；其他生菜品种在不同茬期对软腐病的抗性表现不同：其中,卡纳、北散3号、罗曼尼等7个生菜品种春茬表现为感病,而在秋茬被鉴定为中抗甚至高抗；裕生4号、北散2号、立生一号等9个春茬中抗品种在秋茬被提升至高抗品种。该结果表明部分生菜品种对软腐病的抗病性与种植季节有关。 结合春茬与秋茬试验结果,对50份生菜种质资源进行综合抗病性评价：裕生4号、橡生二号、意大利生菜等10个品种(20%)对细菌性软腐病的抗性级别为高抗；北生2号、汉堡、雷达等31个品种(62%)表现为中抗；剩余9个品种(18%)表现为感病；无高感和免疫品种。 A. 感病型；B. 中抗型；C. 高抗型；D. 阴性对照。 图2 不同抗性生菜发病程度 表5 50个生菜品种对软腐病的抗病性评价 序号No.品种名称Variety春茬Spring stubble秋茬Autumn stubble病情指数Diseaseindex抗病等级Resistancelevel病情指数Diseaseindex抗病等级Resistancelevel综合病情指数Comprehensivedisease index综合抗性等级Comprehensiveresistance level结球:绿叶型生菜 Crisphead: green type lettuce12裕生4号0.36MR0.14R0.25R13亚特兰大0.38MR0.16R0.27MR17雷达0.35MR0.19R0.27MR8射手(101)0.29MR0.29MR0.29MR7北生4号0.34MR0.27MR0.30MR5北生2号0.27MR0.36MR0.32MR9裕生1号0.30MR0.35MR0.32MR14意大利耐抽薹0.33MR0.36MR0.34MR10裕生2号0.40MR0.30MR0.35MR11裕生3号0.41MR0.32MR0.36MR4北生1号0.50S0.24R0.37MR6北生3号0.41MR0.33MR0.37MR16万盛1180.45MR0.30MR0.37MR3瑞丽结球生菜0.48S0.31MR0.40MR15卡纳0.57S0.25MR0.41MR1奶生1号0.50S0.44MR0.47S2绿翡翠0.50S0.53S0.52S散叶:绿叶型生菜 Loose-leaf: green type lettuce28大橡生2号0.22R0.13R0.17R30西班牙绿0.24R0.20R0.22R23北散2号0.30MR0.25R0.27MR26美国大速生0.36MR0.22MR0.29MR27罗生3号0.40MR0.22R0.31MR19裕散生2号0.34MR0.30MR0.32MR31金森0.40MR0.28MR0.34MR18裕散生1号0.45MR0.29MR0.37MR29奶油生菜0.45MR0.37MR0.41MR24北散3号0.46S0.39MR0.42MR25北散4号0.43MR0.50MR0.47S20裕散生3号0.51S0.47S0.49S22北散1号0.30MR0.68S0.49S21裕散生4号0.58S0.41MR0.50S散叶:紫叶型生菜 Loose-leaf: purple type lettuce40橡生二号0.17R0.14R0.15R 表5(续) 序号No.品种名称Variety春茬Spring stubble秋茬Autumn stubble病情指数Diseaseindex抗病等级Resistancelevel病情指数Diseaseindex抗病等级Resistancelevel综合病情指数Comprehensivedisease index综合抗性等级Comprehensiveresistance level38罗生1号0.21R0.13R0.17R33北紫1号0.21R0.15R0.18R43罗莎红0.24R0.15R0.20R34北紫2号0.37MR0.13R0.25MR36北紫4号0.28MR0.22R0.25MR39橡生1号0.35MR0.15R0.25MR35北紫3号0.40MR0.31MR0.35MR42美国紫叶生菜0.35MR0.27MR0.35MR37红生1号0.28MR0.44MR0.36MR41大橡生一号0.52S0.48S0.50S32慕斯0.54S0.60S0.57S直立型:绿叶型生菜 Romaine: green type lettuce45意大利生菜0.18R0.30MR0.24R44立生一号0.40MR0.24R0.32MR46香港玻璃生菜0.38MR0.43MR0.40MR47罗曼尼0.63S0.35MR0.49S 直立型:紫叶型生菜 Romaine: purple type lettuce49立生四号0.19R0.14R0.16R48紫罗马0.24R0.15R0.19R50汉堡0.29MR0.22MR0.26MR 注：不同类型品种内按照综合抗病性等级I-HS依次排列。 Note:The varieties are arranged based on the disease resistance level from I to HS. 供试的50份生菜品种中,包含17份为结球生菜、26份散叶生菜和7份直立生菜。结球型生菜中以中抗品种(88%)居多,其余为1个(6%)高抗品种(裕生4号),和2个(12%)感病品种(奶生1号和绿翡翠)；而散叶型、直立型生菜中,除中抗品种外,也存在较多的高抗或感病品种(高抗、中抗、感病的品种占比分别为23%,54%,23%和43%,43%,14%)。 按叶片颜色将50份生菜品种分为35份绿叶生菜和15份紫叶生菜。绿叶生菜中包括4份高抗材料(11%)、24份中抗材料(69%)和7份感病材料(20%)；紫叶生菜中筛选到抗病、中抗和感病材料分别为6份(43%)、7份(50%)和2份(7%)。上述结果表明,不同类型的生菜种质对软腐病的抗性存在一定差异：结球生菜和直立型生菜相较于散叶生菜对细菌性软腐病的抗性资源更为丰富；大部分紫色生菜品种比绿色生菜更具软腐病抗性。 抗病性鉴定是选育抗病生菜品种的基础,制定准确可靠、简便、快速的鉴定方法,对于提高抗病育种的效率,加快育种进程尤为重要[15]。国内目前尚无对生菜细菌性软腐病的抗性研究的报道,缺乏相对成熟的抗性评价方法,对生菜资源的抗病性情况及抗病机制还不清楚。本试验建立了一套快速、可靠、准确的检测方法,为国内生菜抗软腐病评价标准的确立提供参考依据。 前人研究表明,伤口和空气湿度是细菌性软腐病发病的重要条件,且只有空气相对湿度保持在90%以上时,致病菌才能成功侵染植物并引起软腐病斑[16]。本研究中将幼苗放置于温室内搭建的小型塑料拱棚中,确保湿度维持在90%以上。此外,传统的叶菜上接种软腐菌方法为刀片划伤法或针刺菌液悬滴法,这类方法操作复杂,伤口大小易受接种人员手法影响,菌液悬滴在伤口处易滑落,容易导致不同植株接种量不同。本研究中采用蘸菌针刺法[17],步骤简单、可操作性强,适用于大规模试验,且致病菌接种量易于控制,有利于提升抗病性评价结果的可靠性和准确性。 本研究探究了致病菌种类、苗龄和接种后观察时间对软腐病发病的影响。胡萝卜果胶杆菌Pc目前主要被划分为3个亚种Pcc、Pco和Pcb[18]。这3个亚种均是引起叶类蔬菜细菌性软腐病的重要致病菌[19]。研究发现,接种病原菌的种类对于生菜细菌性软腐病发病无显著影响。该结果表明了P. carotovorum不同亚种在生菜上无明显寄主偏好性[20],均可用于生菜软腐抗病性鉴定。研究还发现不同苗龄对材料的鉴定结果存在明显差异,总体上苗龄越大, 发病越重。选择生菜7～8片真叶期接种软腐致病菌,植株发病快而且适度,可真实反映品种的抗病性,与史国立等[16]对大白菜软腐病抗病性研究方法结果一致。另外,在对植物进行抗病性鉴定时,鉴定材料的发病情况往往受到温度、湿度、降水等不稳定气候因素的影响,进而影响试验结果。本研究中分别对50个生菜品种进行了春、秋2茬的重复性试验,通过对比2次试验结果,对品种进行了综合抗病性评价,进一步提升了抗性评价结果的准确性。研究还发现供试生菜品种春茬的病情指数普遍高于秋茬,推测导致该差异的原因可能是：软腐致病菌最适生长温度为25～30 ℃,在保证湿度相同的条件下,春季的温度条件(春季温度略高于秋季,且早晚温差较秋季小)更适合细菌性软腐病的发生,因此春茬比秋茬发病情况更为严重。 生菜作为目前国内主要种植、消费的叶类蔬菜之一,种质资源丰富,随着种植面积的扩大,从国外引进的品种数量也在不断增加,现有的栽培品种较为混杂,抗病性差异明显,尚缺乏对细菌性软腐病免疫和高抗的品种。本试验研究的50个生菜品种中,对细菌性软腐病表现高抗的材料有10份,中抗31份,其他为感病材料,未发现免疫和高感品种。对软腐病抗性较好的生菜材料是橡生二号、立生四号、罗生1号和北紫1号；抗病性较弱的材料是绿翡翠、裕散生4号、慕斯和大橡生一号,这些抗病生菜种质携带着许多优良抗病基因,对于发掘和利用主栽生菜品种抗病基因以及生菜品种的改良具有非常重要的意义。 [1] Kim D E, Shang X M, Assefa A D, Keum Y S, Saini R K. 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2 结果与分析
2.1 抗性鉴定方法的建立
2.2 生菜种质资源春、秋两茬抗病性鉴定
Tab.4 The effects of different combinations
on the incidence of soft rot
A. Susceptible type；B. Moderately resistant type；C. Highly resistant type；D. Negative control.
Fig.2 Disease severity of the inoculated lettuces with different resistant levels
Tab.5 Evaluation of resistance to soft rot in 50 lettuce cultivars
2.3 不同类型的生菜种质资源抗性鉴定
3 结论与讨论