氮素作为植物蛋白质、核酸、酶及叶绿素的组成成分,又参与多种内源激素及其前体的合成[1],合理施用氮肥不仅对水稻高产群体的建成具有调控作用,对水稻品质也有着重要影响。稻米品质的形成可以看作是籽粒中淀粉和蛋白质的合成与积累的过程,此过程实质上是水稻叶片与籽粒中碳氮代谢共同作用的结果。蛋白质是稻米胚乳中的第二大物质组分,在溶解性、生物价和能量吸收方面都有很好的性能,且其氨基酸配比较为合理,是一种优质蛋白质[2]。在稻米生产区中,稻米能提供人们所需蛋白质的50%～60%[3]。如何提高稻米蛋白质含量兼顾营养品质一直受到研究者的重视[4]。因此,通过氮肥运筹来改善稻米中蛋白质含量及其组分,对水稻优质栽培研究具有重要的意义。

关于氮肥运筹对稻米中蛋白质的影响效应国内外已有大量研究,从施氮量方面来看,普遍认为增施氮肥可直接增加稻米蛋白质含量[5]；从追施氮肥的时期及比例来看,随着穗肥比例的提高,蛋白质含量增加[6-7]。蛋白质合成是一系列复杂酶促反应过程。硝酸还原酶(Nitrate reductase,NR)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)、谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)是氮素同化过程中的关键酶,其活性显著影响着蛋白质与氨基酸含量[8]。NR是氮同化过程中的第1个关键酶,水稻从土壤中吸收的通过NR同化成高等植物体内95%以上的无机氮都是通过GS/GOGAT循环途径进行同化的,在这个过程中被同化为谷氨酸和谷氨酰胺,是整个氮代谢的中心环节[10-11]。有研究表明,充足的氮素有利于提高氮代谢中NR和GS的活性,促使与碳水化合物同化为氨基酸,进而合成蛋白质,促进植株生长及好粒蛋白质含量的提高[12]。然而,施氮量、施氮比例及时期的综合效应对水稻叶片和籽粒中氮代谢关键酶活性以及稻米中蛋白质含量及其组分、氨基酸含量的影响报道不多,尤其是在盐碱地这样的耕作条件下的研究更鲜有报道。鉴于此,本研究以粳稻品种为材料,比较分析了施氮量、施氮时期及比例对盐碱地水稻抽穗期剑叶和籽粒中氮代谢关键酶活性以及稻米中蛋白质组分、氨基酸含量的影响,以期为盐碱地优质水稻生产提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2018年在黑龙江省大庆市王家围子水稻试验基地(46°40′ N,125°07′ E)大田条件下进行。该地区属北温带大陆性季风气候区,水稻种植以连作为主,一年一熟制。供试稻田土壤为苏打盐碱土,0～20 cm耕层土壤理化性质为：有机质含量为34.9 g/kg,碱解氮含量为162.5 mg/kg,速效磷含量为34.1 mg/kg,速效钾含量为198.8 mg/kg,pH值8.07,可溶性盐含量为0.31%。

1.2 试验设计和田间管理

采用随机区组试验设计,通过实地农户调研确定当地农民常规施氮量以及施氮时期,根据徐一戎[13]提出的“前重、中轻、后补”施氮原则,设置5种氮肥运筹,即：不施氮肥(N0)、农民常规施氮(N1)、平衡施氮(N2)、平衡减氮(N3)、氮肥前移(N4),氮肥为尿素,含N 46.4%。以N1作为对照,氮肥按基肥∶蘖肥∶穗肥=6∶3∶1比例施入,其中穗肥以促花肥一次施入；N2和N3氮肥按基肥∶蘖肥∶穗肥=4∶3∶3比例施入,N3在N2基础上减少10%施氮量,穗肥分成促花肥和保花肥以1∶2的比例施入；N4氮肥按基肥∶蘖肥∶穗肥=5∶3∶2比例施入,穗肥以保花肥一次施入,具体施氮时期及施氮量见表1。各处理磷肥为重过磷酸钙,含P2O5 46%,总量为70 kg/hm2,作基肥一次施入。钾肥为硫酸钾,含K2O 50%；总量为90 kg/hm2,按基肥∶保花肥以7∶3的比例施入。各小区面积为63 m2(长×宽=10 m×6.3 m),3次重复。

供试品种为粳稻品种,垦粳8号,由黑龙江八一农垦大学农学院水稻研究中心在盐碱地上选育。秧龄3.1进行人工均行插秧,行距30 cm,穴距13.3 cm,每穴4苗,各试验小区水分管理采用单排单灌,防止各处理间相互影响。播种日期为4月20日,移栽日期5月17日,收获日期9月20日。插秧及本田管理常规进行。

注：基肥于移栽前7 d(5月9日)施入；N1.蘖肥和促花肥分别于移栽后20 d(6月6日)和移栽后40 d(6月26日)施入；N2、N3、N4.蘖肥在返青期(5月21日)施入,促花肥在倒四叶长出一半时(6月20日)施入,保花肥在倒二叶长出一半时(7月10日)施入。

Note: The base fertilizer was applied 7 days before transplanting(May 9); N1.Manure and flower-promoting fertilizer were applied 20 days after transplanting(June 6) and 40 days after transplanting(June 26) Enter；N2, N3, and N4.Manure was applied during the regreening period(May 21), the flower-promoting fertilizer was applied when the inverted four leaves grow halfway(June 20),the flower-preserving fertilizer was applied when the second leaf is half-length(July 10).

1.3 测定指标与方法

1.3.1 氮代谢关键酶活性

在抽穗期,各处理选择生长整齐一致的剑叶取样,同时,每个处理选取50株生长整齐一致且同一天抽出叶鞘3 cm的稻穗挂牌标记,在抽穗10,20,30 d取稻穗,分别测定剑叶和穗中部籽粒的硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性。

1.3.1.1 硝酸还原酶 用硝酸还原酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定,称取0.1 g样本,加入1 mL提取液,冰浴研磨后4 000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清液冰上待测。采用可见分光光度法,并以每小时每克鲜质量样品中催化产生1 μmol 的量为一个NR活力单位。

1.3.1.2 谷氨酰胺合成酶 用谷氨酰胺合成酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定,称取0.1 g组织,加入1 mL提取液,进行冰浴匀浆。8 000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清,置冰上待测。采用可见分光光度法,并以每克鲜质量样品在每毫升反应体系中每分钟使540 nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

1.3.1.3 谷氨酸合酶 用谷氨酸合成酶试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定,称取0.1 g组织,加入1 mL提取液,进行冰浴匀浆。8 000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清,置冰上待测。采用分光光度法,以每克组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

1.3.2 蛋白质组分和蛋白质含量

水稻收获后,籽粒风干存放3个月后,用FC-2K型实验砻谷机(YAMAMOTO,离心式)加工成糙米,用VP-32型实验碾米机(日本山本有限公司)加工精米。

1.3.2.1 蛋白质含量 用VECTOR22/N型近红外光谱仪(德国BRUKER公司)测定稻米中蛋白质含量。

1.3.2.2 蛋白质组分 用LG-50型粉碎机(瑞安市百信制药机械有限公司)将稻米粉碎后,过内径0.178 mm筛,采用李合生[14]的连续提取法对清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白进行提取,采用凯氏定氮法测定精米粉中的含氮量,再乘以换算系数5.95,即为稻米中各蛋白质组分含量。

1.3.3 氨基酸含量的测定 参照GB/T 5009.124-2003[15]测定籽粒中氨基酸含量。用6 mol/L的盐酸水解氨基酸样品,氮吹仪去除水解管内空气,酒精喷灯封口,放入烘箱,110 ℃水解22 h。将水解液全部转移到50 mL容量瓶内定容。吸取滤液1 mL于5 mL容量瓶内,用真空干燥器在40～50 ℃干燥。干燥后的样品用pH值2.2的柠檬酸钠缓冲溶液溶解,溶解液用0.22 μm滤膜过滤,用L-8900高速氨基酸分析仪(日立高新技术公司)进行分析。

1.4 数据处理与统计方法

应用 Microsoft Excel 2016 进行数据处理,用采用 SPSS 进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 氮肥运筹对盐碱地水稻氮代谢关键酶活性的影响

2.1.1 硝酸还原酶 不同氮肥运筹下水稻抽穗期剑叶硝酸还原酶(NR)活性(以鲜质量计)的变化如图1所示,与N1相比,N2、N3和N4提高了抽穗期剑叶NR活性,N2增幅最大,N3次之,分别显著提高了74.21%和28.95%。在水稻抽穗后,其籽粒中NR活性呈现逐渐下降的趋势(图2),在相同的抽穗天数,与N1相比,N2、N3和N4处理下抽穗10 d籽粒NR活性分别显著提高了89.97%,49.88%和39.86%,抽穗20 d籽粒NR活性分别显著提高了102.62%,51.15%和20.00%,抽穗30 d籽粒NR活性分别提高了46.06%,17.27%和7.88%,仅N2与N1间差异显著。说明在籽粒灌浆过程中氮素的还原能力逐渐下降,N2、N3和N4在抽穗10～20 d这一过程中则能显著提高其还原能力,但在抽穗30 d后各处理籽粒中NR活性差异变小。

2.1.2 谷氨酰胺合成酶 氮肥运筹下水稻抽穗期剑叶以及抽穗后籽粒GS活性(以鲜质量计)与NR活性的变化趋势相似(图3-4),均表现为N2>N3>N4>N1。N2、N3和N4剑叶中GS活性较N1分别提高了63.22%,34.28%和14.42%,N2、N3与N1间差异显著。水稻抽穗后籽粒中GS活性随灌浆进程的推进而降低,且在抽穗10～20 d这一阶段下降幅度较大；在相同的抽穗天数,N2、N3和N4籽粒GS活性均高于N1,尤其是N2和N3处理抽穗10,20,30 d籽粒GS活性分别显著提高了60.41%,54.15%,59.78%和24.33%,41.82%,34.51%。

2.1.3 谷氨酸合成酶 由图5-6可知,氮肥运筹下水稻抽穗期剑叶、抽穗后籽粒中谷氨酸合成酶(GOGAT)活性(以鲜质量计)与NR、GS活性的变化趋势相似,与N1相比,N2和N3剑叶GOGAT活性分别显著提高了45.46%和27.27%,N4剑叶GOGAT活性略有增加,但与N1差异不显著。水稻抽穗后10,20,30 d籽粒GOGAT活性呈逐渐下降的趋势,且在相同抽穗天数,籽粒中GOGAT活性变化与抽穗期剑片的变化较为一致,表现N2>N3>N4>N1的趋势,与N1相比,在抽穗10 d时,N2和N3籽粒GOGAT活性分别显著提高73.33%和46.67%；在抽穗20 d时,N2、N3和N4籽粒GOGAT活性分别显著提高54.94%,38.04%和23.96%；在抽穗30 d时,N2、N3和N4籽粒GOGAT活性分别显著提高63.34%,33.33%和21.68%。

2.2 氮肥运筹对盐碱地水稻籽粒蛋白质含量及组分的影响

蛋白质含量是稻米营养品质的重要指标。由表2可知,与N1相比,N2、N3和N4提高了籽粒中清蛋白、球蛋白和谷蛋白含量,尤其是N2和N3处理下清蛋白、球蛋白、谷蛋白含量分别显著提高了28.30%,14.29%,10.32%和20.76%,9.89%,8.70%,N4谷蛋白显著提高了7.08%；N2和N3醇溶蛋白分别显著降低了7.55%和9.43%,N4醇溶蛋白略有增加,但与N1间差异不显著。N2、N3和N4蛋白质含量较N1分别提高了9.59%,7.26%和1.73%,N2与N1处理间差异显著。

注：每一列相品种间不同的字母表示在0.05水平上差异显著。表3同。

Notes: The values followed by the different letters are significantly different at 0.05 probability level within the same variety in each column. The same as Fig.3.

氮肥运筹下水稻籽粒氨基酸含量变化如表3所示,与N1相比,N2、N3和N4提高了籽粒总氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸含量,尤其是N2和N3提高幅度较大,总氨基酸分别显著提高了29.78%和19.11%,必需氨基酸分别显著提高了31.14%和17.96%,非必需氨基酸含量分别显著提高了29.09%和19.39%,N4总氨基酸和非必需氨基酸含量分别显著提高了9.56%和10.00%。另外,N2显著提高了所有必需氨基酸(除苯丙氨酸差异不显著外)和非必需氨基酸含量,N3必需氨基酸组分和非必需氨基酸组分含量也高于N1(除了亮氨酸显著低于N1)。

苏氨酸和赖氨酸是衡量蛋白质质量好坏的限制性必需氨基酸,与N1相比,N2和N3处理下苏氨酸含量分别显著增加了60.00%和33.33%,赖氨酸含量分别显著增加了31.25%和25.00%；N4苏氨酸和赖氨酸分别增加了13.33%和6.25%,差异不显著。

3 讨论与结论

NR是植物氮代谢的关键酶,是催化转化为氨基酸的第一步反应,同时也是植物体内氮素同化中的限速酶[16]。已有研究证明,当进入水稻体内后,必须经过NR的还原后才能进一步合成氨基酸[17]。本研究结果表明,在水稻抽穗后,其籽粒中NR活性呈现逐渐下降的趋势,而平衡施氮、平衡减氮施肥和氮肥前移的施氮方式能提高水稻抽穗期剑叶以及抽穗后各时期籽粒NR活性,说明在籽粒灌浆过程中氮素的还原能力逐渐下降,但穗氮肥的施用能提高此过程中氮素的还原能力,尤其是平衡施氮方式效果更为显著,这可能是穗氮肥分次施用的作用效果。此外,本研究还发现在抽穗30 d时,仅平衡施氮方式对籽粒NR活性影响显著,说明籽粒中NR活性不仅与穗氮肥施用次数有关,与施氮量也密切相关。

GS是处于氮代谢中心并参与植物中各种氮代谢调节的多功能酶,其活性的提高可带动氮代谢的增强,促进氨基酸的合成和转化[10]。水稻体内氮元素主要是通过GS-GOGAT途径同化为谷氨酰胺或谷氨酸[11,18]。孙永健等[19]研究表明,氮素穗肥以倒四、倒二叶龄期等量追施可促进花后氮素累积,提高剑叶NR和CS活性。相似的,本研究表明,平衡施氮和平衡减氮施肥方式显著提高了抽穗期剑叶以及抽穗后籽粒中GS和GOGAT活性。这可能由于穗氮肥分别于倒四叶和倒二叶龄期2次施入,使氮肥施入土壤后,其养分释放规律能较好地与盐碱地水稻生育后期对氮素养分的需求相配,有利于提高水稻GS和GOGAT活性。此外,有研究表明，水稻籽粒谷氨酰胺合成酶参与催化合成的谷氨酰胺较少,更多的谷氨酰胺是在叶片中合成,然后转运至籽粒中,在籽粒中转化为氨基酸[18,20-22]。本研究结果也表明,籽粒中GS活性明显低于抽穗期剑叶的GS活性,且在抽穗10～20 d这一阶段籽粒中GS活性大幅度下降,而籽粒中GOGAT活性维持在较为稳定的水平。

有关氮肥与稻米中蛋白质含量的关系,众多报道均认为氮肥可以促进籽粒中蛋白质含量的积累[23]。成臣等[24]研究表明,施氮量增加有利于稻米蛋白含量的提高,但过高的施氮量难以使稻米蛋白含量进一步的提升。本研究结果表明,在相同的施氮时期及比例下,平衡施氮方式与平衡减氮施肥相比稻米蛋白质含量增加。潘圣刚等[25]和陈梦云等[6]研究指出,提高氮肥在穗粒肥中所占的比例使蛋白质含量显著提高。本研究结果与其较为一致,表现为降低基肥施氮量,增施调节肥与穗肥可显著提高稻米中蛋白质含量。稻米的清蛋白和谷蛋白中必需氨基酸含量较多,易于消化,为优质蛋白[26]；Ogawa等[27]研究表明,醇溶蛋白积累在PB-I中,而PB-I因为结构紧密,难以被吸收消化,被认为是劣质蛋白。本研究中,平衡施氮和减氮平衡施肥方式显著提高了清蛋白、球蛋白和谷蛋白含量,显著降低了醇溶蛋白含量,而氮肥前移施氮方式清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量均有所提高,推测原因是平衡施氮和减氮平衡施肥方式的氮肥按40%作基肥,30%作蘖肥,30%作穗肥施用,且穗肥分别于倒4叶和倒2叶分次施用改善了稻米中蛋白组分,进而提高稻米中的营养品质。

稻米营养价值的高低,不仅取决于蛋白质含量,还受其他品质成分的影响,尤其是必需氨基酸含量[4]。徐大勇等[28]研究表明,两系杂交稻氮的60%作基肥、40%作穗肥,随穗肥追施后移,籽粒蛋白质及氨基酸有增加的趋势。在本研究中,平衡施氮和平衡减氮方式氮肥的基肥∶蘖肥∶穗肥=4∶3∶3比例可显著提高水稻籽粒中总氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸含量,与前人研究结果较为相似[26],这可能是由于抽穗期剑叶和籽粒灌浆过程的氮代谢关键酶活性增强,带动了氮代谢途径运转,从而促进了氨基酸的合成与转化。但平衡施氮方式的作用效果更为显著,这与常二华等[29]研究中增施氮肥可以明显提高水稻籽粒氨基酸总量这一结果基本一致。

综上所述,平衡施氮和平衡减氮施肥方式利于抽穗期剑叶以及籽粒灌浆过程中的氮代谢关键酶活性维持较高水平,促进氮素吸收同化与转运,提高了稻米中蛋白质和氨基酸含量,并调控了蛋白组分,进而达到改善稻米营养品质的目的,且平衡施氮方式作用效果更为明显。

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Effects of Nitrogen Fertilizer Applications on Key Enzyme Activities of Nitrogen Metabolism and Protein Content of Rice in Saline-alkali Land

JIANG Hongfang1,LAN Yuchen1,LI Meng2,ZHAO Yang3,LI Xiaolei3,WANG Heying1,XU Lingqi1,WANG Junyu1,ZHANG Jianing1,LÜ Yandong1,GUO Xiaohong1

(1.Agronomy College,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Modern Agricultural Cultivation and Crop Germplasm Improvement,Daqing 163319,China；2.Agricultural Technology Extension Station of Mudanjiang City,Mudanjiang 157000,China；3.Beidahuang Kenfeng Seed Industry Co.,Ltd,Harbin 150090,China)

Abstract： In order to clarify the effects of nitrogen fertilizer applications on key enzyme activities of nitrogen metabolism and protein concent of rice in saline-alkali land, five kinds of nitrogen fertilizer operations were set up in the field experiment using japonica rice variety Kenjing 8 as material. Namely no nitrogen fertilizer(N0),farmers′ conventional nitrogen application(N1,the total amount of pure N was 150 kg/ha,base fertilizer∶tillering fertilizer∶panicle fertilizer=6∶3∶1),balanced nitrogen application(N2,the total amount of pure N was 150 kg/ha,base fertilizer∶tillering fertilizer∶panicle fertilizer=4∶3∶3),balanced nitrogen reduction and fertilization(N3,the total amount of pure N was 135 kg/ha,base fertilizer∶tillering fertilizer∶panicle fertilizer=4∶3∶3),and nitrogen fertilizer advancement(N4,the total amount of pure N was 150 kg/ha,base fertilizer∶tillering fertilizer∶panicle fertilizer=5∶3∶2). Among them,N1 was used as a control. To analyze the activities of nitrate reductase(NR), glutamine synthetase(GS) and glutamate synthase(GOGAT) in flag leaves and grains at the heading stage of rice in saline-alkali land, as well as protein content and protein components in grains, the effect of amino acid content. Results showed that,compared with N1, N2, N3 and N4 increased the activity of NR, GS and GOGAT in the flag leaves of rice at the heading stage, especially the activities of NR, GS and GOGAT of N2 and N3 were significantly increased by 74.21%, 63.22%, 45.46% and 28.95%, 34.28%, 27.27%; The activities of NR, GS and GOGAT in the grain after heading decreased with the advancement of the filling process, and the trend of each period was consistent with the flag leaf at the heading stage. The albumin, globulin and gluten content of N2 and N3 were significantly increased by 28.30%, 14.29%, 10.32% and 20.76%, 9.89% and 8.70%, respectively. The prolamin was significantly reduced by 7.55% and 9.43%, respectively. The total protein content increased by 9.59% and 7.26%, respectively. The protein content of N4 and its components were improved, and gluten was significantly increased by 7.08%. The contents of total amino acids, essential amino acids and non-essential amino acids in the grains treated with N2 and N3 were significantly increased by 29.78%, 31.14%, 29.09% and 19.11%, 17.96%, 19.39%, respectively. N4 significantly increased the total amino acid and non-essential amino acid content. In summary, balanced nitrogen application and balanced nitrogen reduction are beneficial to maintain high levels of NR, GS and GOGAT activities during flag leaf and grain filling, and regulate protein content, its components and amino acid content, and effectively improve the nutritional quality of rice.

Key words: Rice；Nitrogen fertilizer applications；Nitrogen metabolism；Protein content；Amino acid；Saline-alkali land

中图分类号：S143.1

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2019)增刊-0213-08

doi:10.7668/hbnxb.20190719

收稿日期：2019-09-19

基金项目：国家重点研发计划项目(2016YFD0300104)；黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2018-Y03)；黑龙江省自然基金面上项目(C2017046)；黑龙江八一农垦大学青年创新人才项目(CXRC2017001)；黑龙江省大学生创新创业训练计划(201810223014)；黑龙江八一农垦大学科研团队平台支持计划(TDJH201802)；黑龙江八一农垦大学校启动计划项目(XDB-2016-02)

作者简介：姜红芳(1993-),女,黑龙江哈尔滨人,在读硕士,主要从事水稻高产优质栽培研究。

通讯作者：郭晓红(1980-),女,黑龙江宁安人,副教授,博士,主要从事水稻栽培学研究。