紫外分光光度法测定土壤硝态氮校正因数的优化

土壤硝态氮不仅是西北地区旱地土壤氮肥推荐的重要指标，而且在环境评价中也是一个不可或缺的指标[1-4]。土壤硝态氮含量的高低直接影响着作物的产量和品质，含量过低会降低农作物的产量，不足以满足人类对于温饱的需求以及对经济效益的追求，而含量过高不仅会使作物尤其是叶菜类蔬菜的硝酸盐含量超标，影响农产品的品质，进而对人体的身体健康产生威胁[5]，而且农田土壤硝态氮的径流、淋溶和土壤渗滤加剧了地表水体富营养化、土壤理化性质的不良改变以及地下水的硝酸盐污染[6-11]。

因此，快速摸清土壤硝态氮的含量适当控制其在土壤中的积累是减少氮素损失的关键措施之一，可以减少环境污染，使肥料的利用达到利益最大化。

目前，土壤硝态氮常用的测定方法有两大类，一类是蒸馏法或微量扩散法，由于该方法是纯手工测定，费时、费力、耗时且测定过程易受多种物质的干扰，导致测定结果存在较大偏差，所以这类方法已经逐渐被先进的仪器方法所取代。第二类是仪器方法，主要有酚二磺酸法、紫外分光光度法、离子电极和色谱法、反射仪法以及连续流动分析法等[12-15]。酚二磺酸比色法是农化实验室测定土壤硝态氮的经典方法，也是我国林业标准[16](LY/T 1230-1999)方法，该方法的优点是可以精确测定出土壤浸提液的硝态氮含量,但是该方法的操作步骤繁琐、土壤浸提液水分蒸发时间长、浪费资源且存在多种物质干扰，不适合大批量的样品测定，很难满足农业服务中常规的批量测定需求。连续流动分析法是近年来大型实验室常用的一种测定土壤硝态氮方法，具有测定过程简易、分析速度快等优点，但是由于其本身仪器的价格昂贵，维修费用较高，操作系数较难，并且该方法所测土壤硝态氮的精密度较差[17]。所以，连续流动分析法的普及度并不高。反射仪法测定土壤硝态氮的过程也较为简易，但是当硝态氮含量过低或过高(低出或超出其测定范围)时，反射仪并不能精准的测定硝态氮含量而且硝酸盐试纸也较贵，不符合农业的经济效益。而紫外分光光度法不需要经典方法繁琐的操作过程，仪器价格也相对较低，并且此方法在测定土壤硝态氮方面已经取得了一定进展，可靠性也得到了证明[18-19]。

易小琳等[18]提出土壤硝态氮测定的锌还原的紫外分光光度法和校正因数的紫外分光光度法2种操作程序，认为锌还原法测定更为准确以及可靠。但是锌还原法操作过程过于繁琐，与酚二磺酸法相比，锌还原法的操作过程以及测定结果的准确性并无优势，校正因数法虽然操作简便、测定速度快，但校正因数由于受到浸提剂、波长选择以及土壤类型影响具有不确定性需要修正，他们的试验研究了北京和河北不同类型的土壤，确定了以NaCl为浸提剂选取210 nm波长条件下的校正因数为3.6[18]。而宋歌和孙波等[19]运用酚二磺酸比色法、还原蒸馏法、镀铜镉还原-重氮化偶合比色法和改进的紫外分光光度法测定了中国9种不同土壤类型的硝态氮含量，并且计算了9种不同土壤类型在以KCl为浸提剂、220 nm为波长下紫外分光光度法的校正因数为2.2。可见波长、浸提剂等条件的选用以及土壤类型对紫外风光光度法校正因数具有重要的影响。中国土壤的类型多种多样，部分土壤确定的校正因数代表性有所欠缺，而目前紫外分光光度法测定土壤硝态氮选用的浸提剂和波长也有所不同。为此，采集了内蒙古地区不同生态区不同立地类型的8种土壤类型共212个土壤样品，分析了不同浸提剂以及波长对校正因数影响的基础上，探讨不同测定方法对土壤硝态氮的影响，最终优化紫外分光光度法浸提剂和波长选择并进行校正因数的修正。

1 材料和方法

内蒙古自治区地域辽阔，地层发育也比较齐全，土壤类型较多，包括黑土、暗棕壤、黑垆土、灰钙土、黑钙土等30种土壤类型，本次试验采集了从内蒙古自东到西不同生态区的灌淤土、栗钙土、栗褐土、草甸土、风沙土、棕壤、亚高山草甸黑土以及碱化盐土共8种类型的土壤, 8种类型土壤的总面积依次是48.4，2 434.9，187.7，598.7，2 059.5，46.8，107.5，129.4万hm2，而灌淤土、栗钙土、栗褐土、草甸土、棕壤以及亚高山草甸黑土的耕地面积分别占本土类面积的76.83%，12.22%，36.05%，17.63%，7.7%，27.17%[20]，栗钙土分布最广、面积最大，目前除少部分耕地外，大部分都是天然牧场，是发展畜牧业的重要土地资源；而灌淤土、栗褐土是自治区重要的农业土壤；碱化盐土广泛的分布于自治区的各个盟市之间，而碱化盐土不经改造不能作为农业利用的土壤，因此，碱化盐土的改良是自治区农业不可忽视的一部分。

本次试验的采集地自东到西依次是巴林右旗、托克托县、四子王旗、武川县、清水河县、和林格尔县、以及五原县，土壤类型的采集具有一定的代表性，采样点的土壤利用类型涵盖了内蒙古自治区主要的土壤利用类型，包括了农田、草地、林地；每个采样点随机采集土壤样品，土壤样品均取自0～30 cm深度耕层土样，采样点概况详见表1，由于受土壤水分、温度、保存时间的影响，所以该试验的所有土样均为风干土样(过筛2 mm)。

1.1 研究方法

本研究以酚二磺酸比色法[21]作为标准方法测定土壤硝态氮含量，用以优化和修正紫外分光光度法测定土壤硝态氮的校正因数，同时验证和分析以紫外分光光度法测定的土壤硝态氮含量，以连续流动分析法[13]和反射仪法[22]进一步验证紫外分光光度法在土壤硝态氮测定中的应用效果。

紫外分光光度法的测定原理是土壤浸提液中的硝酸盐在超短紫外(210～220 nm)有强吸收，以有机质为主的杂质在210～220 nm和275 nm处均有吸收，而有机质为主的杂质在275 nm处的吸收值比在210～220 nm处的吸收值小f倍，因此，可以利用浸提液在275 nm处的吸光度代替以有机质为主的杂质在210～220 nm处的吸光度值，将它从浸提液在210～220 nm处的吸光度中扣除，从而得到硝态氮在210～220 nm处的校正吸光值。目前对于硝酸盐强吸收的波长选择有210,220 nm 2个波长，而常用的浸提剂有KCl和CaCl2 2种浸提剂。由于波长、浸提剂选择的不同以及土壤类型的影响导致紫外分光光度法的校正因数也不尽相同[23-25]，所以本研究利用2种不同浸提剂以及不同硝酸盐强波长测定不同土壤硝态氮，分析浸提剂种类以及不同波长对紫外分光光度法校正因数f值以及硝态氮含量的影响。

1.2 统计方法

使用SAS统计软件和Sigmaplot软件分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浸提剂以及波长条件下校正因数的修正

表2是紫外分光光度法在不同浸提剂以及波长条件下测定各种类型土壤校正因数和硝态氮以及有机质含量的变化情况。结果表明，本研究选取的土壤样品的硝态氮和有机质平均含量分别在3.0～45.5 mg/kg和3.1～70.5 g/kg的范围内变动，具有很大的变异，说明本研究选取的土壤样品具有一定的代表性，可以用于校正因数的修正。

注：表中所列数值是不同土壤类型在不同浸提剂以及波长情况下校正因数的平均值，±后面的数值为标准偏差；平均值不包括碱化盐土；硝态氮含量的测定方法是酚二磺酸比色法。

Note: The values listed in the table are the average values of correction factors for different soil types with different extractants and wavelengths (Mean±s)；The average value excludes Alkalized saline soil.；The method for determination of nitrate nitrogen content is phenol disulfonate colorimetry.

从不同的浸提剂来看，KCl和CaCl2 2种不同的浸提剂得到的校正因数有明显的不同，其中碱化盐土在使用KCl作为浸提剂时的校正因数在210,220 nm处分别为6.0,3.6，而在使用CaCl2作为浸提剂时校正因数为14.2,6.8。其他土壤也有类似的趋势，在使用KCl做浸提剂时的校正因子平均值为3.4,2.8，而使用CaCl2做浸提剂时的校正因子则为4.4,2.9。总体来看，210 nm处的校正因数平均值均高于220 nm，其标准偏差也大于220 nm，说明在210 nm处校正因数的离散程度大于220 nm处，即校正因数在210 nm处的变异性高于220 nm处。另外，从不同土壤类型来看，碱化盐土的校正因数明显高于其他类型的土壤，其标准偏差也比其他土壤类型大，表明碱化盐土的校正因数离散程度很高，在实际测定时必须使用合适的校正因数，并不能以其他土壤类型上得到的校正因数来代替。

2.2 不同浸提剂以及波长条件下校正因数的相关关系

图1展示了在210,220 nm条件下不同种浸提剂之间校正因数的相关关系图，从图中可以看出，KCl与CaCl2 2种浸提剂之间的校正因数并无显著的相关性，点比较散，说明浸提剂的选择在某种程度上会影响到校正因数的取值。当浸提剂是KCl时，波长在210 nm与220 nm的校正因数之间有显著的线性关系(R2=0.60)；当浸提剂是CaCl2时，校正因数在2种波长之间线性关系较KCl做浸提剂更好，决定系数达0.96，且210 nm处的校正因数明显高于220 nm处的校正因数(图2)。当浸提剂为KCl或CaCl2时，碱化盐土与非碱化盐土的不同波长的校正因数之间的相关关系如图3所示，碱化盐土与非碱化盐土的不同波长之间的校正因数有显著的相关关系，并且以CaCl2为浸提剂时，不同波长的校正因数相关关系高于以KCl为浸提剂时不同波长的校正因数的相关关系。结果进一步表明分别探讨碱化盐土和非碱化盐土校正因数的必要性，由于碱化盐土样本数较少需要加大样本数增加修正校正因数的可靠性，下面主要进行非碱化盐土类型土壤修正校正因数的分析和不同测试方法的比对，验证非碱化盐土修正校正因数的鲁棒性。

2.3 标准的紫外分光光度法硝态氮含量与酚二磺酸法硝态氮含量对比

酚二磺酸法测定土壤中硝态氮是最经典的方法，测定数值准确性和精确性较高，为了进一步确定修正校正因数后紫外分光光度法的可靠性，选取了酚二磺酸法和以2.2为校正因数的国标紫外分光光度法进行相关性分析。图4，5分别研究了以KCl和CaCl2为浸提剂在不同波长条件下测定的硝态氮含量的相关性，结果表明,不同方法之间都有极显著的相关性，修正校正因数后的优化紫外分光光度法均方根误差(RMSE)、相对误差(RE%)均小于国标紫外分光光度法与酚二磺酸法测定硝态氮含量的线性相关关系，而优化紫外分光光度法中以KCl为浸提剂时，其均方根误差与相对误差均小于以CaCl2为浸提剂，而以KCl为浸提剂在220 nm波长处，均方根误差与相对误差均最小，分别为1.8 mg/kg和15.6%，说明当浸提剂为KCl，波长在220 nm时，校正因数f=2.8时，优化的紫外分光光度法测定的硝态氮含量与酚二磺酸法测定的土壤硝态氮含量最为接近。

2.4 几种分析方法的硝态氮含量与优化的紫外分光度法硝态氮含量对比

为了进一步验证以KCl为浸提剂在220 nm条件下修正校正因数为2.8的优化紫外分光光度法测定土壤硝态氮的可靠性，选择了目前常用的连续流动分析法、酚二磺酸比色法以及反射仪法与此校正因数方法进行了线性分析(图6)。结果表明，优化紫外分光光度法与3种分析方法测定的硝态氮含量达到了极显著相关，相关系数分别为0.99，0.99和0.98，优化紫外分光光度法与3种分析方法的拟合曲线一次项系数接近于1，常数项的值接近于零，说明优化紫外分光光度法不仅与3种分析方法不仅具有高度相关性，而且系统误差极低，并且本研究也对优化紫外分光光度法与3种分析方法进行了均方根误差与相对误差分析，结果表明，优化紫外分光光度法与3种分析方法的均方根误差和相对误差分析数值极低，均方根误差在1.7～1.9，而相对误差在13.9%～15.8%，进一步说明了优化紫外分光光度法与3种分析方法测定土壤硝态氮的误差极小，证明了以KCl为浸提剂在220 nm波长条件下选择校正因数2.8的可靠性。

3 讨论与结论

土壤硝态氮含量的高低会影响农作物的产量与品质，也是环境评价中不可或缺的指标之一，关于硝态氮不同分析方法的比较，前人已有诸多的报道。连续流动分析法是近年实验室新兴的一种硝态氮测定方法，有研究认为，流动注射分析法具有准确性、简洁性、鲁棒性等特点[26]。唐其文等[27]通过研究连续流动分析法与传统方法(氧化镁浸提-扩散法、酚二磺酸比色法和镀铜镉还原-重氮化耦合比色法)对比表明，连续流动分析法的分析速度快，稳定性好(5次平行次数内结果RSD<5%)，准确性高。但由于连续流动分析法本身仪器的价格昂贵，维修费用较高，导致连续流动分析法的使用普及度低。反射仪法所用仪器携带便捷，使用方便，适合大田硝态氮含量的实时监测。在我国有研究者在不同气候和地理区域下选择了冲积土、栗钙土、褐土、红壤、风沙土、水稻土以及盐渍土7种不同土壤类型进行了硝酸盐反射仪速测法和实验室硝酸盐测定方法的比较，证明硝酸盐反射仪法的可靠性[28]，同样在欧洲Schmidhalter[29]研究了黏土、黏壤土、淤泥壤土、砂壤土4种不同土壤结构类型的硝态氮含量，均分析确定反射仪法与实验室测定方法的硝态氮含量结果一致。然而，硝酸盐试纸较贵，测定的土壤硝态氮含量范围有限，有效保质期较短(12个月)，可能会影响进一步的推广应用。

紫外分光光度法由于操作简便被广泛用于土壤硝态氮的测定，然而计算过程中的校正因数易受土壤类型、浸提剂等的影响，最终影响到结果的准确性。易小琳等[18]通过研究河北和北京的15个土壤样品以酚二磺酸比色法为参比法测定土壤硝态氮含量得出紫外分光光度法(波长为210 nm，NaCl浸提剂)的校正因数为3.6。宋歌等[19]研究了8个地区9个土壤样品采用不同方法为参比法确定了紫外分光光度法(波长为220 nm，KCl浸提剂)的校正因数的范围是1.50～3.56，平均为2.2。前人的研究结果表明紫外分光光度法的校正因数由于受到不同因素的影响变异性较大，本研究选取了8种土壤类型212个土壤样品，系统研究了浸提剂、波长选择对紫外分光光度法测定土壤硝态氮校正因数的影响，发现210 nm处的校正因数值普遍高于220 nm，盐碱土的校正因数普遍高于其他土壤。当浸提剂为KCl时，校正因数在210,220 nm的值分别为3.4，2.8，分别与易小琳与宋歌等[11-12]在210,220 nm处的校正因数较为接近。说明波长的选择对校正因数的影响较大。当浸提剂为CaCl2时，校正因数在210,220 nm的值分别为4.4,2.9，由于碱化盐土的校正因数值偏大，所以碱化盐土的校正因数值需单独使用。通过修正校正因数的紫外分光光度法测定的硝态氮含量与酚二磺酸法、连续流动分析法和反射仪法测定的硝态氮含量线性相关性结果进一步分析，表明在浸提剂是KCl，波长为220 nm，校正因数为2.8，此时优化紫外分光光度法与标准方法所测硝态氮含量的均方根误差以及相对误差最小，测定结果最为可靠。选择合适的校正因数的紫外分光光度法是一种测量土壤硝态氮简单便捷的方法，适合对土壤样品做大规模硝态氮含量的测定。

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