光叶紫花苕生物固氮能力及其还田氮素对玉米的当季有效性

绿肥作为一种优质的生物肥源，在作物养分供应、农田杂草抑制、培肥土壤、涵养水分和调节大气等方面具有重要作用[1-4]。据研究，种植和翻压绿肥可以减少约150 kg/hm2的氮肥投入，同时能够提高氮肥的利用效率以减少氮素的流失[2]。此外，农田种植豆科绿肥具有的生物固氮作用还可提供高价值的生态系统服务[5-6]，有利于进一步减少农田化学氮肥投入。目前，国内对于豆科作物生物固氮能力的研究主要涉及豆科籽实类作物(例如大豆、花生)和豆科牧草[7-12]，豆科绿肥生物固氮相关研究较少[13]。

绿肥作物的种植利用不仅体现在还田后对后茬作物的生长与产量、养分吸收以及土壤物理、化学、生物特性的影响[14-18]，还能对与其间作的作物产量、养分吸收及土壤肥力产生影响[19-20]。农作物秸秆和绿肥等有机肥料都是保持和提高农田有机质，培肥土壤的重要手段。但不同有机肥料(物料)还田后的腐解速度、腐解率以及养分释放率均不同[21-22]。研究还显示，不同种类或不同研究区域下有机物料还田氮素的当季回收率存在较大差异[23-25]。光叶紫花苕作为四川盆地主要的冬季豆科绿肥，其还田氮素对后茬作物的有效性即当季回收率尚无相关研究。因此，为探明四川盆地生态条件下豆科绿肥光叶紫花苕的生物固氮能力以及光叶紫花苕翻压还田氮素的当季回收率，本研究开展了光叶紫花苕不同施氮量大田试验和光叶紫花苕翻压还田对春玉米产量及氮素吸收影响的盆栽试验，以期为该区域豆科绿肥的合理种植与还田利用提供科学理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试豆科绿肥为光叶紫花苕(Vicia villosa Roth var. glabrescens)，购买自当地市场。供试油菜品种为川油36，由四川省农业科学院作物研究所提供。供试玉米品种为正红311，由四川农大正红种业有限责任公司提供。丰度为5%的标记15N尿素购自上海化工研究院。

1.2 试验设计与种植管理

1.2.1 光叶紫花苕大田试验试验于2015年10月-2016年3月在四川崇州市白头镇五星村进行，供试土壤为水稻土，由灰色冲积物母质发育而成，质地重壤土，土壤肥力中等。试验采用两因素随机区组设计，以油菜作为豆科绿肥(光叶紫花苕)的非固氮参照作物，设置4个施氮水平： 0，75，150，225 kg/hm2(分别以N0、N75、N150、N225表示)。共8个处理，重复3次，24个小区，小区面积16 m2。前茬水稻收获后耕翻土壤，光叶紫花苕与油菜的播种时间均为2015年10月16日，光叶紫花苕、油菜的大田播种量分别为60，3 kg/hm2。磷钾养分大田施肥量分别为P2O5 60 kg/hm2、K2O 90 kg/hm2。氮磷钾肥(过磷酸钙含P2O5 12%、氯化钾含K2O 60%、尿素含N 46.67%)均做底肥一次性施用。病虫杂草管理措施一致。

此外，分别在光叶紫花苕、油菜的N75处理和N150处理小区设置微区(1 m×1 m)，施用等量(16.05 g)的标记15N尿素，用于15N同位素稀释法测定豆科绿肥生物固氮效率。2016年3月18日光叶紫花苕初花期时进行固氮豆科作物和非固氮作物油菜取样。

1.2.2 光叶紫花苕盆栽砂培试验砂培试验于2015年10月-2016年3月在四川省农业科学院土壤肥料研究所盆栽场进行，采用直径32 cm、高35 cm的塑料盆，内装石英砂。供试豆科绿肥为光叶紫花苕，用于自然丰度法中豆科植物在无氮条件下的B值测定。每处理重复4次，合计4盆。砂培采用无氮营养液，参照H.C.阿夫道宁营养液配方基础(MgS2O4·7H2O 500 mg/L、Na2HPO4·12H2O 100 mg/L、NaH2PO4·12H2O 100 mg/L、KCl 150 mg/L、CaCl2 360 mg/L、EDTA-Fe 25 mg/L)。每盆起始培养溶液2 L，每个培养桶底设排水孔，桶下置一盆，在盆内标记初始溶液刻度，每天加蒸馏水至刻度，每隔7 d更换1次营养液。同样地，2016年3月在光叶紫花苕初花期进行取样，烘干粉碎后测定δ15 N。

1.2.3 春玉米盆栽土培试验盆栽试验在四川农业大学温江区惠和村教学科研园区进行，盆钵口径为28 cm，盆钵高28 cm，盆栽土壤来自试验田耕作层，属于冲积性水稻土，质地轻壤，土壤肥力中等。采用单因素试验设计，在相同氮磷钾化学养分施用量条件下(参照大田用量，150 kg/hm2，P2O5 90 kg/hm2，K2O 135 kg/hm2)设置光叶紫花苕半量翻埋还田、全量翻埋还田(参照前茬大田微区生物产量确定绿肥还田全量干物质量为500 kg/hm2)2个处理，分别以GM1、GM2表示，还田绿肥15N标记氮素投入量分别为1.05，2.10 mg。以不施氮肥作为空白对照，共3个处理，每个处理3盆。2016年3月21日，先在盆钵中填装土壤，前茬大田微区15N标记尿素处理的光叶紫花苕植株风干后截成2～3 cm长，按试验要求翻埋在表层土壤之下。3月31日移栽相同规格(二叶一心)的玉米幼苗，每盆1株。2016年7月28日玉米成熟期取样。

1.3 测定指标与方法

光叶紫花苕初花期时取地上部植株样品，在105 ℃下杀青30 min、65～75 ℃烘干称质量；然后先用普通粉碎机粉碎样品后过孔径0.841 mm筛，再取部分上述样品进一步用超细植物粉碎机粉碎过孔径0.147 mm筛，粉碎样送河北省农林科学院遗传生理研究所测定全氮含量(K-05自动定氮仪)、15N丰度和δ15 N(美国热电公司元素分析仪Flash2000HT，美国热电公司同位素比率质谱仪Thermo-Fisher Delta V Advantage IRMS)。

光叶紫花苕的氮素产量(N yield)=BM×N content(%)

其中，BM是指光叶紫花苕的生物产量即干物质重量，N content(%)是指光叶紫花苕的全氮百分含量。

自然丰度法测定豆科绿肥光叶紫花苕的生物固氮效率的计算公式[26]为：

生物固氮效率(NA)=100×(δ15Nnon-legume-δ15Nlegume)/(δ15Nnon-legume-B)

其中，δ15Nnon-legume和δ15Nlegume分别是指作为非固氮参照作物油菜和固氮作物光叶紫花苕的15N丰度，B值是指固氮作物光叶紫花苕生长于无氮培养基质环境下的15N丰度，根据砂培无氮营养液的试验结果，其B值为-1.15。

15N同位素稀释法测定豆科绿肥光叶紫花苕的生物固氮效率的计算公式[26]为：

生物固氮效率(ID)=100×(1-atom% 15N excess legume/atom% 15N excess non-legume)

其中，atom% 15N excess legume和atom% 15N excess non-legume分别是指固氮作物光叶紫花苕和非固氮参照作物油菜的15N原子百分超。

豆科绿肥光叶紫花苕的生物固氮量计算公式为：

生物固氮量=%Ndfa×N yield

其中，%Ndfa是指生物固氮效率，N yield是指光叶紫花苕的氮素产量。

在玉米成熟期对每盆玉米植株取样，分器官考查干物质量，然后粉碎过筛，样品全氮和15N丰度测定方法同上。化学氮肥利用率相关公式为：

氮肥农学利用率(g/g)=(施氮区作物产量-不施氮区作物产量)/施氮量；

氮肥表观利用率=(施氮区作物吸氮量-不施氮区吸氮量)/施氮量×100；

15N回收率(%)=(植株干质量×植株的N%×植株的15N原子百分超)/投入的15N量×100%。

1.4 数据统计分析方法

应用Microsoft Excel 2003进行数据的整理。应用SPSS 19.0软件，绿肥不同施氮处理的差异显著性采用方差分析(ANOVA)和多重比较(LSD法)，绿肥翻压还田量2个处理的差异显著性分析采用t检验法，显著性水平均为0.05。所有表格中的数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 施氮量对光叶紫花苕生物量和氮素产量的影响

由表1可知，大田试验条件下光叶紫花苕增施氮肥处理(N75、N150、N225)的生物量和氮素产量均高于N0处理，但不同处理间并无显著差异。随施氮量(0～225 kg/hm2)的增加，光叶紫花苕的生物量和氮素产量总体上都表现出升高趋势。不同施氮处理间的全氮含量无显著差异。

注：同一列中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。表2-3同。

Note：Different small letter mean significant difference among different treatment at 0.05 level in the same column.The same as Tab.2-3.

2.2 施氮量对光叶紫花苕生物固氮效率和生物固氮量的影响

根据表2结果，采用15N自然丰度法(NA)计算的光叶紫花苕生物固氮效率变幅为56.3%～85.6%，生物固氮量变幅为156.8～189.7 kg/hm2。各增施氮肥处理(N75、N150、N225)的生物固氮效率和生物固氮量均低于N0处理。方差分析表明，生物固氮效率在N0、N75和N150 3个处理间无显著差异，但N225处理显著低于N0处理。不同施氮处理间的生物固氮量无显著差异。

大田微区15N同位素稀释法(ID)试验结果表明，N75、N150两处理的生物固氮效率分别为77.2%，66.9%，差异不显著。进一步分析显示，相同施氮处理(N75、N150)下，NA法和ID法测定的生物固氮效率并无显著差异。

2.3 春玉米的产量、化学氮肥利用率及对光叶紫花苕还田15N的当季回收率

由表3可知，盆栽条件下光叶紫花苕翻压还田量(GM1、GM2)对春玉米的籽粒产量、植株干质量及氮肥表观利用率均无显著影响，而全量翻压还田(GM2)处理的氮肥农学利用率显著高于半量翻压还田(GM1)处理。与半量翻压还田(GM1)处理相比，全量翻压还田(GM2)处理有利于提高玉米的产量和氮肥利用率。

光叶紫花苕翻压还田量(GM1、GM2)对春玉米成熟期地上部植株15N吸收量有显著影响(表3)，但对还田绿肥15N的当季回收率并无显著影响。

3 讨论与结论

本试验结果表明，光叶紫花苕增施氮肥处理(N75、N150、N225)的生物固氮效率(56.35%～65.16%)及生物固氮量(156.81～169.68 kg/hm2)均低于N0处理，其中N225处理的生物固氮效率显著低于N0处理。这一结论与前人关于豆科作物的研究[9,26-28]较为一致。一般地，随土壤供氮水平的提高，豆科植物的固氮作用会受到抑制。但马霞等[8]采用NA法研究表明，大田苜蓿接种根瘤菌并追施少量外源氮肥提高了生物固氮效率(77.8%)和固氮量。李跃森等[10]报道，盆栽条件下豆科牧草圆叶决明生物固氮百分率随施氮水平的增加呈先升高后下降的趋势，并在N2(30 mg/kg) 水平下达到最高。可见，土壤供氮水平偏低不利于豆科作物生长和生物量积累，从而影响生物固氮能力[8]；通过适当补施外源氮素则能促进根瘤的形成，增加其固氮能力[10]。本研究采用15N同位素稀释法(ID法)的生物固氮效率(66.9%-77.2%)高于Li等[29]在丹麦的研究结论，但与Almeida等[25]在巴西的试验结论较为接近。这可能与不同研究地区生态条件的差异有关[30]。

本研究还表明，相同施氮量下NA法和ID法测定的生物固氮效率并无显著差异，其中N75处理下NA法的生物固氮效率低于ID法，而在N150处理下则表现为NA法高于ID法。Høgh-Jensen等[26]研究表明，在低氮水平下(20 kg/hm2)NA法测定的豆科牧草生物固氮效率明显低于ID法，而在高氮水平下(400 kg/hm2)NA法与ID法测定的生物固氮效率差异很小。Huss-Danell等[31]、Naudin等[32]和Oberson 等[33]针对豆科牧草、豌豆-小麦间作系统、大豆的研究均表明，NA法与ID法测定的豆科植物生物固氮效率基本无差异或差异不大。可见，这2种15N同位素方法均可用于豆科绿肥生物固氮能力的测定。此外，由于本研究所得豆科绿肥光叶紫花苕的生物固氮效率和生物固氮量仅为1 a大田试验结果，有待于进一步验证。

本试验盆栽条件下，基于成熟期玉米植株的光叶紫花苕还田15N当季回收率为44.63%～48.34%。单鹤翔等[23]在华北平原的研究显示，基于冬小麦植株及籽粒的玉米秸秆还田15N当季回收率分别为22.8%～33.1%，7%～10%。而在陕西关中地区，基于冬小麦植株的玉米秸秆还田15N当季回收率仅为1.9%～3.4%[24]。可见，同样作为有机肥料，还田绿肥的15N氮素当季回收率以及后茬作物籽粒氮素来源于还田有机肥15N的比例均明显高于还田秸秆。其主要原因在于秸秆的碳氮比相对绿肥较高[21]，绿肥腐解速度快、养分释放率高[22，34]，而秸秆腐解速度和养分释放慢[23-24]。Almeida等[25]在巴西的大田试验研究表明，不同毛叶苕子覆盖还田量下基于玉米籽粒的还田苕子15N当季回收率为9.8%～10.1%。该试验结论也明显低于我们的盆栽试验结果，可能与研究区域及试验条件的差异有关。杨滨娟等[35]针对“紫云英-双季稻”种植体系进行的绿肥翻压还田量与施氮量试验研究表明，60%绿肥还田 + 60% 常规施N量处理能够提高氮肥利用效率，有利于实现水稻氮素高效吸收和利用。本试验中盆栽玉米的单一施氮量(150 kg/hm2)参照的是大田经济施氮水平，至于大田试验条件下的效果如何，以及豆科绿肥还田量与不同施氮量的互作对还田绿肥氮素当季回收率的影响，尚需要进一步研究。

本研究通过大田试验研究了不同施氮水平下光叶紫花苕的生物固氮效率和生物固氮量，同时采用盆栽试验研究光叶紫花苕不同翻压还田量下春玉米的产量、氮肥利用率以及还田绿肥15N的当季回收率。结果发现，不同施氮量对光叶紫花苕生物量、氮素产量及生物固氮量均无显著影响，但对生物固氮效率有显著影响。盆栽试验条件下，光叶紫花苕翻压还田量对春玉米地上部植株15N吸收量和氮肥农学利用率有显著影响，但对还田绿肥15N的当季回收率并无显著影响。因此，本试验中等土壤肥力条件下，豆科绿肥光叶紫花苕大田种植时可以不追施氮肥，以全量翻压还田为宜。本研究结果为豆科绿肥种植的合理施氮和翻压还田利用提供了理论依据。

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