肠道是动物体最长的消化器官,具有吸收营养物质和保护机体不受致病菌影响的功能。细菌脂多糖会引发肠道功能受损,导致肠道营养物质吸收障碍、生长抑制、免疫功能紊乱,给养殖业造成较大经济损失[1-2]。在畜禽饲料中添加抗生素成为临床生产实践中杀灭细菌提高经济收益的首选手段[3]。然而滥用抗生素对食品安全造成了严重的负面影响,破坏畜禽肠道内的微生态平衡,并引发细菌耐药性[4]。此外,畜产品中抗生素的残留也对人体健康产生威胁[5]。因此通过绿色、天然、安全的饲料添加剂替代抗生素成为畜牧业健康养殖的研究热点[6]。
绿茶在我国有着长久的历史,绿茶中除了富含人体所必需的营养物质外,还含有具有药理和保健作用的茶多酚、茶氨酸、茶色素、茶多糖等,且绿茶及茶多酚在养殖业和食品行业中作为抗氧化剂、杀菌剂、抗病毒剂、保色剂及免疫增强剂等正逐步被人们广泛认同和接受[7-9]。研究表明,绿茶中的茶氨酸经口摄入可被小肠黏膜吸收,经血液循环进入全身各组织器官参与免疫调节从而修复肠道损伤[10-12]。
本研究以SPF级C57BL/6雄鼠为试验动物,利用大肠杆菌脂多糖诱导建立小鼠肠道损伤模型,在小鼠饲粮中分别添加1%,2%,3% 的绿茶粉+20 mg/kg茶多酚进行预防干预。采用RT-PCR测定肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相对表达量。利用ELISA法测定血清中IgA、IgG、IgM、肠道sIgA和血浆内毒素含量。探究绿茶粉对小鼠肠道屏障损伤修复的作用机制,以期为绿茶粉进一步深层开发利用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料试剂
绿茶粉购自金寨茶叶生产公司；茶多酚购自合肥安启生物技术有限公司；大肠杆菌脂多糖(LPS)购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；盐酸金霉素购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠血清IgA、IgG、IgM、血清内毒素、肠道分泌型sIgA ELISA试剂盒购自苏州卡尔文生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒RNA simple Total RNA Kit、反转录试剂盒Fast Quant RT Kit(with gDNase)和荧光定量试剂盒SuperReal RreMix Plus(SYBR Green)均购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 试验设计
试验选取72只3周龄SPF级C57BL/6、平均体质量为(16.05±1.01) g的雄性小鼠(北京维通利华试验动物技术有限公司提供)。试验小鼠随机分为6组(每组3个重复,每个重复4只),对照组(Ⅰ组) 及阳性对照组(Ⅱ组)给予基础饲粮,基础饲粮配方参照标准为美国营养学会1993年出版的啮齿类动物纯化饲料(AIN-93)制作,其组成及营养成分含量见表1。抗生素对照组(Ⅲ组)在基础饲粮中添加抗生素20 mg/(kg·d)。试验组Ⅳ组、V组、Ⅵ组分别在基础日粮中添加1%,2%,3% 绿茶粉和20 mg/kg茶多酚。所有小鼠分笼饲养,给予自由饮水、采食。在小鼠45 d时,Ⅰ组腹腔注射生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V和Ⅵ组按10 μL/g的剂量腹腔注射LPS。注射5 h后,乙醚麻醉小鼠采集血样及各组织器官。
表1 试验饲粮组成及营养水平(饲喂基础)
Tab.1 Composition and nutrient levels
of basal diets(as-fed basis)
项目 Item含量/%Content 原料 Ingredients玉米Corn48.42豆粨Soybean meal24.30植物油Plant oil2.20麸皮 Bran7.00次粉 Wheat middlings15.00磷酸氢钙CaHPO41.00石粉Stone-powder1.30赖氨酸Lysine0.12蛋氨酸Met0.30氯化胆碱Chloride0.10矿物元素添加剂Mineral elements0.04食盐NaCl0.20维生素添加剂Vitamin additive0.02合计 Total营养水平 Nutrient levels100.00代谢能(MJ/kg)ME2.86粗蛋白质CP17.03粗脂肪EE4.89钙 Ca1.53有效磷 AP0.54DL-蛋氨酸 DL-Met0.61L-赖氨酸 L-Lys1.09
注：矿物元素添加剂.每千克饲粮提供：Cu 80 mg、Fe 66.7 mg、Zn 62.9 mg、Mn 2.5 mg、I 4.0 mg、Se 5.0 mg、载体851.0 mg；维生素添加剂.每千克饲粮提供：VA 12.5 mg、VB1 10.2 mg、VB6 5.1 mg、VB12 5.0 mg、VC 260.4 mg、VD 1.0 mg、VE 100.0 mg、VK 6.9 mg、生物素 12.5 mg、叶酸 1.3 mg、尼克酸 39.5 mg、泛酸 37.5 mg、核黄素10.4 mg、抗氧化剂 2.0 mg、载体 495.7 mg；代谢能为计算值,其余为实测值。
Note：Mineral element additives. Provided per kg diet： Cu 80 mg，Fe 66.7 mg，Zn 62.9 mg，Mn 2.5 mg，I 4.0 mg，Se 5.0 mg，Vector 851.0 mg；Vitamin supplements. Provided in each kg diet：VA 12.5 mg，VB1 10.2 mg，VB6 5.1 mg，VB12 5.0 mg，VC 260.4 mg，VD 1.0 mg，VE 100.0 mg，VK 6.9 mg，biotin 12.5 mg，folic acid 1.3 mg，nictinic acid 39.5 mg，patothenic acid 37.5 mg，riboflavin 10.4 mg，antioxidants 2.0 mg，Vector 495.7 mg； ME was calculated value, others were measured value.
1.3 生长性能测定
试验开始前,对每只小鼠称质量并记录。记录每只小鼠日采食量,乙醚麻醉前对每只小鼠称质量并记录。计算小鼠的平均日采食量 (ADFI)、平均日增质量(ADG)和料质量比(F/G)。
1.4 小鼠血清及组织样品采集
在小鼠45 d日龄时,注射LPS 5 h后对所有小鼠进行眼眶采血,样品于室温静置2 h,3 000 r/min离心10 min取上清,置于4 ℃保存。血样采集完成后脱颈处死所有小鼠,无菌采集十二指肠、空肠和回肠,置于液氮中保存备用。
1.5 引物设计与合成
选用小鼠β-actin基因作为内参。根据GenBank 上公布的Claudin-1、ZO-1、Occluding基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计引物,引物序列见表2。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表2 RT-PCR试验所用引物
Tab.2 Primers used in RT-PCR experiments
基因名称Gene name上游引物Forward primer下游引物Reverse primer目的产物/bpPCR productClaudin-1CTTTGTGTCCACCATTGGCACAGCCATCCACATCTTCTGC 74ZO-1TCTTGCTGGCCCTAAACCTGGCATCAGTTTCGGGTTTTCCC312OccludinCAGGTGAGCACCTTGGGATTAGAGTACGCTGGCTGAGAGA249β-actin GAGAAATTGTGCGTGACATCACCTGAACCTCTCATTGCCA152
1.6 qRT-PCR的方法检测各组织中Claudin-1、ZO-1、Occluding 蛋白的相对表达量
常规方法提取十二指肠、空肠和回肠RNA并将其反转录为cDNA,保存于-80 ℃待用。qRT-PCR反应体系为20 μL：cDNA 2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 6 μL。实时荧光定量PCR扩增程序为：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s,循环次数40次。得到的Claudin-1、ZO-1、Occluding基因和内参基因的Ct值,采用2-ΔΔCt法计算Claudin-1、ZO-1、Occluding mRNA的相对表达量。
1.7 血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM测定
按ELISA试剂盒说明书方法检测小鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量。
1.8 小肠分泌型免疫球蛋白(sIgA)测定
取十二指肠、空肠、回肠黏膜于EP管中,加入1 mL生理盐水充分匀浆,4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min,取上清液,按ELISA试剂盒说明书方法检测小肠sIgA含量。
1.9 数据处理
试验数据使用
表示,采用SPSS软件中的ANOVA过程对试验数据进行方差分析,LSD显著性检验。
2 结果与分析
2.1 小鼠生长性能的变化
由表3可知,各组小鼠ADG、ADFI、F/G均无显著性差异,但存在趋势性变化。与Ⅱ组相比，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组小鼠平均日增质量量较低，但料质量比较Ⅱ组高1.2%，3.0%，2.6%。
2.2 小鼠血浆内毒素含量的变化
由表4可知,与Ⅰ组相比,Ⅱ组小鼠血浆中内毒素含量极显著升高(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ、V和Ⅵ组小鼠血浆中内毒素含量较Ⅱ组极显著降低 (P<0.01)。
表3 饲粮添加绿茶粉对LPS感染小鼠生长性能的影响
Tab.3 Effects of dietary green tea powder on the performance of LPS infected mice
日龄Days组别Groups平均日增质量/gADG平均日采食量/gADFI料质量比F/G21～45日龄Ⅰ0.66±0.033.97±0.206.02±0.1521-45 daysⅡ0.65±0.033.94±0.196.06±0.16Ⅲ0.68±0.034.01±0.155.90±0.20Ⅳ0.64±0.033.92±0.146.13±0.21Ⅴ0.61±0.033.81±0.196.24±0.16Ⅵ0.58±0.033.61±0.136.22±0.23
注：同列数据无字母或有相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。表4-6同。
Note：In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); While with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); With different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as Tab.4-6.
表4 不同剂量绿茶粉对小鼠血浆中内毒素含量的影响
Tab.4 Effects of different doses of green tea powder on the expression of endotoxin in mouse plasma EU/mL
项目 ItemⅠⅡⅢⅣⅤⅥ内毒素 ET 11.41±0.35Aa12.81±0.53B11.48±0.36Aa9.60±1.24Cb10.68±0.28Ca9.82±0.78Cb
2.3 小鼠各组织中Claudin-1、ZO-1、Occluding 蛋白相对表达量的变化
小鼠十二指肠、空肠及回肠Claudin-1、ZO-1、Occludin 蛋白相对表达量分别见图1-3。
由图1可知,在十二指肠中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组3个蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。与Ⅱ组相比较,V和Ⅵ组中的Claudin-1、ZO-1和Occludin蛋白相对表达量极显著增加(P<0.01)；Ⅳ组中Claudin-1 蛋白相对表达量无显著变化(P>0.05),ZO-1和Occludin 蛋白相对表达量极显著增加(P<0.01)。
柱状图上有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。图2-3同。
There are no letters or identical letters on the column, which means that the difference is not significant (P>0.05), and different lowercase
letters mean significant difference (P<0.05), and different capital letters indicate significant difference (P<0.01). The same as Fig.2-3.
图1 不同剂量绿茶粉对免疫应激小鼠十二指肠中紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响
Fig.1 Effects of different doses of green tea powder on the relative expression of tight
junction protein mRNA in duodenum of immune stressed mice
图2 不同剂量绿茶粉对免疫应激小鼠空肠中紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响
Fig.2 Effects of different doses of green tea powder on the relative expression of tight
junction protein mRNA in the jejunum of immune stressed mice
由图2可知,在空肠中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组3个蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。与Ⅱ组相比,Ⅳ组中Claudin-1和ZO-1 蛋白相对表达量极显著增加(P<0.01),Claudin-1 蛋白相对表达量无显著变化(P>0.05)；V组中ZO-1和Claudin-1 蛋白相对表达量极显著增加(P<0.01),Occludin 蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)；Ⅵ组中ZO-1、Claudin-1和Occludin mRNA相对表达量均极显著增加(P<0.01)。
由图3可知,在回肠中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组3个紧密连接蛋白mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)。与Ⅱ组相比,Ⅴ和Ⅵ组绿茶粉组中ZO-1、Occludin和Claudin-1 蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01)；Ⅳ组中ZO-1和Claudin-1 蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01)，但Occludin 蛋白相对表达量无显著变化(P>0.05)。
2.4 小鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量的变化
由表5可知,与Ⅰ组相比,Ⅱ组小鼠血清中IgA、IgG、IgM含量均显著降低(P<0.05)。Ⅲ组和Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组小鼠血清中IgA、IgG、IgM含量较Ⅱ组极显著升高(P<0.01)。
表5 不同剂量绿茶粉对小鼠血清中免疫球蛋白含量的影响
Tab.5 Effects of different doses of green tea powder on the expression of immunoglobulin in serum of miceμg/mL
组别GroupsIgA IgGIgM Ⅰ48.30±1.45Aa2.09±0.30Aa324.71±34.48AaⅡ42.26±3.76Ab1.95±0.12Ab314.64±39.30AbⅢ51.67±1.05Ba2.69±0.36Ba377.33±7.94BaⅣ50.40±1.48Ba2.36±0.29Bb370.67±25.02BaⅤ53.59±3.56Ba3.87±0.59C440.67±54.26BbⅥ51.79±1.81Ba2.96±0.59Bc397.33±47.49Bb
图3 不同剂量绿茶粉对免疫应激小鼠回肠中紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响
Fig.3 Effects of different doses of green tea powder on the relative expression of tight junction
protein mRNA in the ileum of immune stressed mice
2.5 小鼠肠道sIgA的变化
由表6可知，与Ⅰ组相比，Ⅱ组与Ⅵ组小鼠肠道sIgA含量显著降低(P<0.05)，Ⅴ组肠道sIgA含量极显著降低(P<0.01)，但Ⅲ组肠道sIgA含量无显著改变(P>0.05)。与Ⅱ组相比，Ⅲ组小鼠肠道sIgA含量显著升高(P<0.05)，Ⅴ组肠道sIgA含量极显著升高(P<0.01)。
表6 不同剂量绿茶粉对小鼠肠道sIgA含量的影响
Tab.6 Effects of different doses of green tea powder on the expression of intestinal sIgA in mice μg/mL
项目 ItemⅠⅡⅢⅣⅤⅥ肠道sIgA Intestinal80.67±12.67Aa63.91±4.77Ab73.54±8.29 Aa80.94±9.79Ab80.30±6.43B77.24±6.01Ab
3 讨论
动物接种疫苗、感染病原或接触了异源蛋白等会产生免疫应激[13]。免疫应激对动物的肠道功能、生长性能、免疫功能等影响巨大,已成为一个影响畜禽生长和经济效益的十分现实和突出的问题,因此缓解免疫应激是目前畜禽养殖需要解决的一个重要问题[14]。绿茶作为一种天然植物已经逐步作为畜禽饲料或饲料添加剂应用于畜禽生产[15-17]。而绿茶饲料增强营养吸收、缓解免疫应激方面的研究鲜有文献报道。
曹兵海等[18]报道,在肉仔鸡饲粮中添加 0.4%的茶多酚,对肉仔鸡的增质量、F/G等均有改善作用。本试验中各绿茶粉添加组组内均未形成显著性差异(P>0.05),但有改善的趋势,虽1%,2%,3%绿茶粉组中小鼠平均日增质量量较对照组略有降低,但料质量比却略有提升,考虑可能是由于脂肪沉积主要集中在后期,且绿茶粉味苦,致使小鼠采食量降低,导致小鼠前期日采食量和体质量未形成显著性差异。但添加绿茶粉能极显著降低小鼠血浆内毒素水平,极显著提高血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平,同时显著上调Occludin、ZO-1和Claudin-1蛋白的表达,一定程度上加强小鼠小肠上皮细胞间紧密连接结构,这与周晓蓉等[19]及朱晟易等[20]研究结果相一致。推测当LPS诱导小鼠发病后,绿茶粉和茶多酚通过增加紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin蛋白相对表达量,改善了肠上皮的机械屏障,抑制细菌移位,从而修复肠道屏障。
以sIgA为主的体液免疫在肠黏膜免疫系统中起主导作用,它是防御病菌在肠道黏膜黏附和定植的第一道防线,当肠黏膜上皮表面免疫活性细胞受到细菌黏附素刺激时,黏附局部便产生sIgA,阻止肠道微生物及其毒素分子对肠黏膜的攻击[21-22]。吴香兰等[23]研究表明,对小鼠灌喂茯砖茶水提物后,小肠黏液sIgA含量有所提高。本研究于日粮中添加绿茶粉后，小鼠肠道sIgA含量较只注射大肠杆菌脂多糖组有所提升，进一步证明了饲粮中添加绿茶粉能在LPS诱导小鼠发生免疫应激后,促进肠上皮局部产生sIgA,阻止细菌破坏肠道紧密连接结构,形成保护肠道的第一屏障。
本试验应用C57BL/6小鼠建立免疫应激动物模型。通过饲养试验,在小鼠饲粮中添加不同浓度水平的绿茶粉,腹腔注射LPS损坏肠道结构和功能后测定与体液免疫、细胞免疫和肠道机械屏障的相关指标,结果表明,绿茶粉可以在一定程度上修复肠道屏障,增强免疫应激小鼠的体液免疫,从而减轻肠道炎症,达到保护肠道的作用。以期为绿茶饲料添加剂的应用基础研究提供科学实践依据,同时为开拓绿茶资源在畜禽养殖中的高效应用途径提供科学依据。
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