连作障碍(Continuous cropping obstacles)是指在正常的管理措施下，同一地块连续多茬种植相同或近缘作物造成作物产量降低、品质变劣、生育状况变差、病虫害发生频繁的现象[1]。烟草(Nicotiana tabacum)是对连作非常敏感的作物，连作会造成养分利用率降低[2-3]、土传病害加重[4-5]、烟株生长发育变差[6-8]，严重影响烟叶产量和品质[9]。烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一。烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae (Breda de Hean)Tuker)主要以休眠菌丝体和厚垣孢子在病株残体、土壤、粪肥中越冬，在旱地中一般可以存活3年以上[10]。烟草连作会显著增加黑胫病发生，给烟叶生产造成危害。
大蒜(Allium sativum L.)被认为是一种有益的前茬作物，鳞茎具有明显的抑菌效应，可减轻病虫害和生理性病害的发生[11-12]。研究表明，大蒜提取物对水稻白叶枯病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、小麦全蚀病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌、大豆尖孢镰刀菌、大豆细菌性斑点病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌、马铃薯晚疫病菌、辣椒炭疽病病菌、辣椒疫霉病病菌、番茄青枯病病菌、番茄茎基腐终极腐霉、黄瓜灰霉病菌、西瓜蔓枯病菌和草莓灰霉病病菌等植物病原菌具有抑制作用[13-16]。
研究了大蒜根系不同腐解时间的腐解产物对烟草黑胫病菌的抑制作用，并通过盆栽试验观察其对烟草黑胫病的防治效果，明确不同腐解时间的大蒜根系腐解物对烟草黑胫病的防治效果，为烟草黑胫病的防治提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
大蒜品种：金乡白皮蒜，购于瑞丰隆农贸有限责任公司，取其生长一个月左右的根系。
烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae，0号小种)：由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心提供。
烤烟品种：供试品种为小黄金，由国家烟草种质资源中期库提供。
1.2 培养基的配制
燕麦培养基的制备：33 g燕麦片加1 000 mL去离子水煮至30 min左右，2层纱布过滤，用去离子水将滤液补足至1 000 mL，加入18 g琼脂粉，分装，121 ℃高压灭菌20 min，稍凉，倒平板。
1.3 大蒜根系腐解液的制备
称取10 g剪碎成1 cm长度的大蒜根系(鲜质量)于5 L塑料桶中，加入4 L土壤稀释溶液，放入30 ℃ 恒温培养箱中避光培养。分别腐解0，5，10，15，20，25，30 d后提取腐解液：先经纱布过滤2次，后进行真空抽滤，再用乙酸乙酯充分萃取分液之后38 ℃旋转蒸发浓缩至10 mL，置于4 ℃冰箱中备用。
1.4 试验设计与方法
1.4.1 大蒜根系腐解液对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响 燕麦培养基经121 ℃高压灭菌20 min，倒入无菌培养皿(直径9 cm)中，向已灭菌的燕麦培养基中加入150 μL不同腐解天数(0，5，10，15，20，25，30 d，其中0 d为腐解2 h的大蒜根系腐解液，为空白对照组)的大蒜根系腐解液，即CK、T5、T10、T15、T20、T25、T30处理，用涂布棒仔细涂抹均匀，在燕麦平板培养基中央接种直径5 mm的黑胫病菌饼，28 ℃恒温避光培养，每个处理设5次重复。每天观察测量1次，采用十字交叉法测定菌落直径并做好记录，直到菌丝长满培养皿为止。菌落直径用十字交叉法测；菌丝生长速率及菌丝抑制率以培养3 d (菌丝接近长满培养皿) 的菌落直径变化来计算[17]。
计算公式如下[18]：
生长速率
抑制率
1.4.2 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌丝形态的影响 培养试验结束后，挑取抑制效果最好的烟草黑胫病菌菌丝，显微镜观察并记录。
1.4.3 大蒜根系腐解液对黑胫病防治效果的盆栽试验 将煮至半数米粒成开花状态的小米分装到锥形瓶中，放入121 ℃高压锅中灭菌20 min。灭菌结束后，在无菌环境中，接入1 cm×1 cm的烟草黑胫病菌菌块到锥形瓶中，28 ℃培养14 d制成烟草黑胫病菌菌谷[18]。将灭菌土与菌谷(每盆0.5 g)搅拌均匀后装入直径9 cm，高7 cm的花盆中，浇透水，置于人工气候室中培养1个月[19]。每个花盆移栽一株苗龄40 d左右的烟苗。每个处理10盆，3次重复。人工气候室培养条件设置为：白天温度28 ℃，晚上温度28 ℃，光照与黑暗各12 h循环，相对湿度保持在90%。移栽后第5，7，9天调查并记录烟苗发病级数，病情指数=∑(各级病株数×级数)/(最高病级数×调查总株数)×100，防治效果=(对照组病指-处理组病指)/对照组病指×100%[20]。
1.5 数据分析
试验数据采用Excel及SAS 9.2统计软件进行数据统计与分析，单因素方差分析，α=0.05水平下进行Duncan′s 多重比较[21]。
2 结果与分析
2.1 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌丝生长的影响
2.1.1 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌落直径的影响 由表1可知，在菌丝培养的第1天，与CK相比，T5、T15、T20、T25、T30处理均能显著降低黑胫病菌菌落直径，分别为0.20，0.88，0.44，0.70，0.71 cm，而T10处理的黑胫病菌菌落直径与CK相比差异不显著；在菌丝培养的第2天，与CK相比，T5、T10、T15、T20、T25、T30处理均能显著降低黑胫病菌菌落直径，分别为0.39，0.72，2.13，1.67，1.90，2.04 cm；在菌丝培养的第3天，与CK相比，T5、T10、T15、T20、T25、T30处理均能显著降低黑胫病菌菌落直径，分别为0.28，1.70，3.75，2.23，2.51，2.99 cm。总体来说，不同腐解天数大蒜根系腐解液均能显著降低烟草黑胫病菌菌落直径，且大蒜根系腐解15 d时得到的腐解液对烟草黑胫病菌菌落直径影响最大。
表1 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌落直径的影响
Tab.1 Effect of garlic root decomposed liquid on colony diameter of tobacco black shank cm
处理Treatment1 d菌落直径1 d colony diameter2 d菌落直径2 d colony diameter3 d菌落直径3 d colony diameterCK2.77±0.07a5.57±0.12a7.81±0.20aT52.57±0.09b5.18±0.26b7.53±0.11bT102.69±0.12a4.85±0.13c6.11±0.19cT151.89±0.11d3.44±0.07e4.06±0.15fT202.33±0.24bc3.90±0.12d5.58±0.23cdT252.07±0.26cd3.67±0.10de5.30±0.18cT302.06±0.26cd3.53±0.10e4.82±0.16e
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示经Duncan′s 多重比较法验证在P<0.05水平上差异显著。表2同。
Note：Data are mean±SD.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by Duncan′s Multiple Range Test.The same as Tab.2.
2.1.2 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌丝生长速率的影响 由图1可知，与CK相比，T5、T10、T15、T20、T25、T30处理均能显著降低黑胫病菌菌丝标准化生长速率。总体来说，不同腐解时间的大蒜根系腐解液均能抑制黑胫病菌菌丝生长。
不同小写字母表示经Duncan′s 多重比较法验证在
P<0.05水平上差异显著。图2同。
Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level by Duncan′s Multiple Range Test.The same as Fig.2.
图1 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌丝生长速率的影响
Fig.1 Effect of garlic root decomposition solution on the mycelial growth rate of Phytophthora parasitica
2.1.3 大蒜根系腐解液对黑胫病菌菌丝生长抑制率的影响 由图2可知，与CK相比，T5、T10、T15、T20、T25、T30处理均能显著抑制黑胫病菌菌丝生长。总体来说，不同腐解天数的大蒜根系腐解液均能抑制黑胫病菌菌丝生长，且以腐解15 d的大蒜根系腐解液对菌丝生长的抑制作用最强。
2.2 镜检观察黑胫病菌菌丝
由图3可知，在黑胫病菌培养的过程中，与CK相比，大蒜根系腐解液处理后的烟草黑胫病菌菌丝生长受到抑制，其中T15处理的菌丝生长受到的抑制作用最强。在20×10倍的显微镜下观察到T15处理的菌丝出现畸形现象，菌丝出现短而多的分支、菌丝原生质外漏、菌丝变形严重且菌丝膨大体增加等现象。由此可知，大蒜根系腐解液造成菌丝异常，从而抑制其生长。
图2 大蒜根系腐解物对烟草黑胫病菌菌丝的抑制率
Fig.2 The inhibition rate of Phytophthora parasitica mycelium from garlic root decomposed liquid
2.3 大蒜根系腐解液对黑胫病的盆栽防治效果
由表2可知，烤烟移栽后第5天调查烟苗的发病情况，与对照相比，除T5处理外，各处理黑胫病病情指数与对照相比达到差异显著水平。烤烟移栽后第7天与第9天各处理烟苗病情指数变化趋势与烤烟移栽后第5天各处理烟苗病情指数变化趋势一致，在调查期间，不同腐解时间大蒜根系腐解液对烟草黑胫病防治效果明显，且随着大蒜根系腐解时间的增加表现出抑制效果表现出先增强后减弱再增强的趋势，在第5，7，9天时，不同腐解时间大蒜根系腐解液对烟草黑胫病的防治效果分别为5.41%～49.63%，3.72%～47.63%，4.30%～41.38%。以上结果表明，不同腐解时间的大蒜根系腐解液对烟草黑胫病有一定的防治效果，其中腐解15 d时的大蒜根系腐解液对烟草黑胫病的防治效果最好。
A.正常菌丝；B.T15处理的菌丝(短而分支);C.T15处理的菌丝(原生质外漏);D.T15处理的菌丝(变形)。
A. Normal hyphae morphological；B.Mycelium treated by T15 (short and branch);C.Mycelium treated by T15 (protoplasm overflow); D.Mycelium treated by T15 (swelled mycelium).
图3 黑胫病菌菌丝形态(20×10倍)
Fig.3 The hyphae morphological of Phytophthora parasitica
表2 大蒜根系腐解液对烟草黑胫病的防治效果
Tab.2 Control effect of garlic root decomposing solution on tobacco black shank
处理Treatment5 d7 d9 d病情指数Disease index防治效果/%Prevention rate病情指数Disease index防治效果/%Prevention rate病情指数Disease index防治效果/%Prevention rateCK40.09±1.13a-59.55±2.03a-69.74±2.11a-T537.92±1.49a5.41±0.04d57.33±2.92a3.72±0.05df66.75±1.10a4.30±0.02eT1032.84±1.33b18.01±0.03c52.12±1.67b12.48±0.03e54.06±1.78bc22.48±0.03cdT1520.19±0.97e49.63±0.02a31.19±1.91f47.63±0.03a40.88±2.36e41.38±0.03aT2030.19±2.24c 24.70±0.06c 46.03±1.82c22.71±0.03ad55.61±1.43b20.26±0.02dT2525.53±1.73d36.32±0.04b41.64±1.92d30.08±0.03c52.16±1.81cd25.21±0.03bcT3023.85±0.72d40.50±0.02b37.21±1.35e37.51±0.02b50.03±1.59d28.26±0.02b
3 讨论
烟草黑胫病作为烟草主要真菌病害之一，发病率高，每年给烟草生产造成严重的经济损失[22]。有报道称，大蒜提取物对烟草黑胫病菌能够起到很好的抑制作用[23-24]。王云帆等[25]研究发现，不同浓度的大蒜提取物对黄瓜黑星病菌菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用；本研究在燕麦培养基中加入大蒜根系腐解液能显著抑制烟草黑胫病菌菌丝生长，通过镜检腐解15 d的大蒜根系腐解液处理过的烟草黑胫病菌菌丝发现，菌丝出现原生质体泄漏、菌丝分支及菌丝变形等异常现象。这些现象是否会降低烟草黑胫病的侵染力还需要进一步验证。而且不同腐解时间大蒜根系腐解液对菌丝生长的抑制速率不同，其中以第15 天的抑制效果最好。
据研究表明，大蒜浸提液和挥发物以及大蒜根系分泌物可抑制多种土传病害病原菌活性[26]，大蒜抑菌作用与其化感作用密不可分。盆栽试验结果表明，大蒜根系腐解液对烟草黑胫病菌有一定的防治作用，能够一定程度上减轻烟草黑胫病的发生。而大田环境相对复杂，且外界影响因素众多，大蒜根系腐解液在大田环境下是否会对烟草黑胫病的发病程度有影响，还需要进一步验证。
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